一種白樺樹皮藥用部位的提取方法及醫(yī)療用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一類從樺木科喬木植物白樺樹樹皮中提取、分離獲得的具有抑制二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的組份。經(jīng)多次體外二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶抑制實驗表明，該組份具有明顯的DGAT1抑制活性，可在制備治療和預(yù)防高血脂、動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥藥物中應(yīng)用。對開發(fā)利用中國的藥用植物資源具有重要意義。
【專利說明】一種白樺樹皮藥用部位的提取方法及醫(yī)療用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開一種白樺樹皮藥用部位及提取方法，同時還提供了其醫(yī)療用途，涉及中醫(yī)藥學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
技術(shù)背景
[0002]高血脂癥主要是指血清總膽固醇(TC)或三酰甘油(TG)水平過高和(或)血清高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)水平過低，而引起的一系列嚴(yán)重危害人體健康的疾病。隨著人們生活水平的逐漸提高，飲食及生活方式的改變，人口老齡化的到來，患高血脂癥的人群不斷增長。研究表明，高血脂是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的元兇，而動脈硬化是導(dǎo)致心腦血管疾病(心絞痛、心肌梗塞、偏癱)的罪魁禍?zhǔn)住Ｓ筛哐l(fā)心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，尤其在發(fā)展中國家增加的速度更快。全世界每年有1500萬人死于心腦血管疾病，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于癌癥死亡人數(shù)。
[0003]DGAT 是一種二脂酸甘油酸基轉(zhuǎn)移酶(Diacylgycerol Acyltransferase, DGAT),該酶與脂肪代謝、脂類在組織中的沉積有很大關(guān)系，它的主要作用機(jī)制是使二酰甘油(Diacylgycerol, DAG)加上脂肪酸?；o酶A形成三酰甘油(triacylgycerol, TG)。TG在體內(nèi)過剩時導(dǎo)致動脈粥樣硬化、肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝等疾病。因此，通過尋找選擇性作用于DGATl的抑制劑，降低血清中三酰甘油的形成，從而調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，降低體重，改善脂肪肝，成為越來越受重視 的治療及預(yù)防高脂血癥的新途徑。Zhao等[Zhao G,Souers AJj Voorbach Mj et al.Validation of diacyl glycerolacyltransferase I asa novel target for the treatment of obesity and dyslipidemia using a potent andselective small molecule inhibitor.J Med Chemj 2008，51: 380-3]報道針對DGATI化學(xué)合成的小分子化合物4a對鼠和人的DGATl有較強(qiáng)的抑制效果，IC5。分別為24rnnol/L、7 nmol/L，口服化合物4a可使飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體重減輕，肝臟TG明顯減少，而不影響攝食量，且四周內(nèi)體重未出現(xiàn)反彈。Birch等[Birch AM，Birtles S，Buckett LKj etal.Discovery of a potent, selective, and orally efficacious pyrimidinooxazinylbieyelooctaneacetic acid diacylglycerol acyltransferase-1 inhibitor.J MedChem，2009，52 (6): 1558-68]報道的口服有效DGATl抑制劑(15 nmol/L)對飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠也具有減肥作用。也有報道DGATl抑制劑A-922500能明顯有效改善先天肥胖Zucher糖尿病大鼠和飲食誘導(dǎo)的倉鼠的高甘油三酯血癥[King AJj Segreti JAjLarson KJj et al.Diacylglycerol acyltransferase I (DGATl) inhibition lowersserum triglycerides in the Zucker fatty rat and the hyperlipidemic hamster.JPharmacol Exp Therj 2009，330 (2): 526-31]。許多醫(yī)藥企業(yè)也針對DGATl開展臨床前研究。
[0004]2006年，輝瑞公司的DGATl抑制劑BAY74-4113已處于I期臨床試驗；2009年，諾華的DGATl抑制劑已進(jìn)入II臨床試驗。DGATl已逐漸成為肥胖、脂代謝紊亂、糖尿病等疾病藥物的研究熱點。目前還沒有以DGATl為靶點的降血脂藥物上市，這為我們從天然資源里尋找高效、高選擇性地小分子DGATl抑制劑提供了機(jī)遇。
[0005]白樺樹{Betula p IatyphyI la Suk)為樺木科喬木植物，在我國廣泛分布于大、小興安嶺及長白山地區(qū)，資源極為豐富，但開發(fā)利用甚少?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明:白樺有降血月旨，抗氧化，抗肝炎，抗艾滋病和增強(qiáng)免疫力等作用。
[0006]本發(fā)明首次從白樺樹皮中分離得到抑制DGATl藥用部位，經(jīng)多次藥理實驗研究，發(fā)現(xiàn)該藥用部位具有顯著抑制DGATl活性及降血脂作用，經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見該類植物具有此方面的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種白樺樹皮藥用部位的一種新組合物，具有抑制DGATl的活性，可以降低血脂。
[0008]本發(fā)明還進(jìn)一步提供白樺樹皮藥用部位的提取、制備方法，設(shè)用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0009]本發(fā)明的另一個目的是提供了白樺樹皮藥用部位及其從中分離的活性組分的醫(yī)療用途，作為抑制甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGATl)的抑制劑，可用于預(yù)防及治療各種高脂血癥、粥樣動脈硬化及其由它引發(fā)的并發(fā)癥。
[0010]本發(fā)明提供的白樺樹皮藥用部位是通過以下方法得到的:
1)將干燥切碎的白樺樹PIatyphyI la Suk)樹皮，用5_10倍量有機(jī)醇(80%或以上濃度)，加熱回流提取2-4次，每次30min-60min，合并提取液；
2)提取液減壓濃縮回收有機(jī)醇，至濃縮，合并濃縮液，放涼，加入I倍量水，析出沉淀，過濾或離心取沉淀，即為提取濃縮物；
3)提取濃縮物用1-2倍量水調(diào)節(jié)混懸液后，分別用1-2倍量二氯甲烷萃取3次，合并萃取液；
4)萃取液減壓濃縮回收二氯甲烷，至濃縮，合并濃縮液，放涼，干燥；
5)干燥品研磨后經(jīng)過200-300目硅膠柱層析，先用1-2倍量正己烷為流動相進(jìn)行洗脫，之后用3-5倍量二氯甲烷與甲醇按10:1比例洗脫液洗脫，收集該洗脫液，將洗脫液常溫減壓濃縮，干燥，得本發(fā)明提取物，用HPLC法測定發(fā)明提取物I中羽扇豆醇的含量不低于20%。上述的有機(jī)醇包括甲醇、乙醇。
[0011]對所得本發(fā)明藥用部位進(jìn)行了甘油?；D(zhuǎn)移酶抑制活性試驗，表明其具有明顯的抑制活性。
[0012]試驗例I
本發(fā)明藥用部位的抑制DGATl活性試驗
實驗方法=DGATl抑制劑的體外檢測使用表達(dá)在昆蟲細(xì)胞膜的人類DGATl作為酶源(Proc.Natl.Acad.sc1.1998, 95，13018-13023)。將 sf9 細(xì)胞用包含人類 DGATl 編碼序列的重組桿狀病毒進(jìn)行感染，48小時后采集。細(xì)胞通過超聲溶解法溶解，并在4°C條件下，在41%蔗糖溶液中以28000rpm轉(zhuǎn)速離心分離I小時，得到所述隔膜。收集，清洗細(xì)胞間的隔月吳碎片并在液氣中儲存。
[0013] DGATl活性檢測通過修正的科爾曼(Coleman)所描述的方法進(jìn)行(methodsinEnzymologyl992, 209, 98-102)。反應(yīng)體系中包含，10 μ M樣品，上述方法得到的0.4μ g膜蛋白質(zhì)，5mM MgCl2和1.2mM sr^l, 2- 二?；视?丙三醇，用蒸餾水調(diào)整總檢測體積至200 yL，在試管中培養(yǎng)。通過在上述體系中加入100 μ mol/L 14C甘油?；?輔酶A(0.05 μ Ci)進(jìn)行反應(yīng)，并于25°C條件下進(jìn)行溫和短暫的震蕩。30 min后通過加入1.5mL 2-丙醇:庚烷:水(80:20:2)終止反應(yīng)。反應(yīng)停止后加入1.0 mL庚烷和0.5 mL 0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.5)，將放射性三酰甘油產(chǎn)物分離到有機(jī)相中，并用2.0 ml的堿性乙醇溶液(乙醇:0.5 N NaOH: H20=50:10:40)洗滌一次。用液體閃爍照相法檢測上層庚烷層的放射性來量化DGATl活性。實驗結(jié)果如下:
【權(quán)利要求】
1.一種白樺樹皮藥用部位，是通過以下方法得到的: 1)將干燥切碎的白樺樹iBetulaP IatyphyI la Suk)樹皮，用5_10倍量有機(jī)醇(80%或以上濃度)，加熱回流提取2-4次，每次30min-60min，合并提取液； 2)提取液減壓濃縮回收有機(jī)醇，至濃縮，合并濃縮液，放涼，加入I倍量水，析出沉淀，過濾或離心取沉淀，即為提取濃縮物； 3)提取濃縮物用1-2倍量水調(diào)節(jié)混懸液后，分別用1-2倍量二氯甲烷萃取3次，合并萃取液； 4)萃取液減壓濃縮回收二氯甲烷，至濃縮，合并濃縮液，放涼，干燥； 5)干燥品研磨后經(jīng)過200-300目硅膠柱層析，先用1-2倍量正己烷為流動相進(jìn)行洗脫，之后用3-5倍量二氯甲烷與甲醇按10:1比例洗脫液洗脫，收集該洗脫液，將洗脫液常溫減壓濃縮，干燥，得本發(fā)明提取物 ，用HPLC法測定發(fā)明提取物I中羽扇豆醇的含量不低于20%，上述的有機(jī)醇包括甲醇、乙醇等醇類有機(jī)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于白樺樹樹皮回流提取所用得有機(jī)醇濃度大于或等于80%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述白樺樹皮藥用部位在治療和預(yù)防各種高血脂、動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥藥物中應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白樺樹皮藥用部位在脂代謝紊亂中的降體重用途。
【文檔編號】A61P3/06GK103933083SQ201410095190
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月17日
【發(fā)明者】崔龍, 張南, 李娜, 李佳琳, 馬坤, 脫振東, 邢姍姍 申請人:北華大學(xué)