全人源抗人白介素17a單鏈抗體的制作方法
【專利摘要】全人源抗人白介素17A單鏈抗體，本發(fā)明屬基因工程抗體【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基因工程設(shè)計(jì)、篩選、表達(dá)與人白介素17A（IL-17A）有特異親和力的全人源抗體片段。此基因工程抗體片段由一段柔性連接片段將抗體的重鏈區(qū)與輕鏈區(qū)首尾相連。本發(fā)明通過構(gòu)建大容量天然噬菌體抗體庫(kù)，通過生物淘洗獲得對(duì)IL-17A具有特異吸附能力的抗體片段。該抗體片段構(gòu)建成全長(zhǎng)抗體，通過真核分泌表達(dá)親和純化后能夠抑制IL-17A對(duì)人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080釋放白介素6（IL-6）的反應(yīng)。本發(fā)明的抗體片段可用于檢測(cè)及治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
【專利說明】全人源抗人白介素 1 7A單鏈抗體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種構(gòu)建天然噬菌體抗體庫(kù)的方法以及由該抗體庫(kù)獲得的可與人白 介素17A特異結(jié)合的單鏈抗體。屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 人白細(xì)胞介素17(human interleukin-17，hIL-17)于1993年從一種激活的T細(xì)胞 雜交瘤中分離出來，最初稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原8(CTLA8)。目前已知IL-17即IL-17A主 要由Th-17細(xì)胞分泌，且在IL-17家族中存在6個(gè)成員（IL-17A-F)，他們分別由150?180 個(gè)氨基酸構(gòu)成，通常以二聚體的形式存在。它可以導(dǎo)致趨化性細(xì)胞因子如IL-8、單核細(xì)胞趨 化因子-l(MCP-l)和GRO-α的增高，從而促使中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的募集。此外，IL-17 通過刺激IL-6和PGE2的產(chǎn)生，加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)；誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附因子（ICAM)產(chǎn)生，促 使T細(xì)胞反應(yīng)。IL-17具有強(qiáng)大的促炎作用，其與多種疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA)，氣道炎癥，慢性炎性疾病以及腫瘤的生長(zhǎng)相關(guān)。
[0003] 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎：一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征，以慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表 現(xiàn)的一種自身免疫性疾病。研究表面，在病人關(guān)節(jié)的滑液中可以檢測(cè)到活性的IL-17, IL-17 刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生iNOS和N0及其它與分解代謝相關(guān)的酶，并與IL-1 β，TNF- α -起刺激 成骨細(xì)胞分泌如GM-CSF和IL-6等細(xì)胞因子，從而抑制軟骨細(xì)胞增殖和蛋白多糖合成，調(diào)節(jié) 破骨細(xì)胞，發(fā)生骨破壞。IL-17還可以誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶，直接在疾病進(jìn)展中起到破壞性 作用。因此，阻斷IL-17/IL-17R通路可能是治療RA的新途徑。研究發(fā)現(xiàn)，利用抗鼠 IL-17 抗體治療膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis, CIA)模型中，關(guān)節(jié)局部炎癥， 軟骨破壞，骨質(zhì)侵蝕明顯減輕。
[0004] 肺?。喝缏宰枞苑尾。╟hronic obstructive pulmonary diseases)，是一種 具有氣流受限特征的疾病，氣流受限不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展，多與肺部對(duì)有害顆粒物或 有害氣體的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。其病程的惡化，與氣道中中性粒細(xì)胞的數(shù)量增多有關(guān)。研 究表明，在CCPD急性加重期及穩(wěn)定期IL-17水平顯著升高，IL-17引起中性粒細(xì)胞增多，促 進(jìn)釋放IL-6、IL-8,打破基質(zhì)金屬蛋白酶平衡，參與了 CCPD的發(fā)病，是引起肺內(nèi)炎癥細(xì)胞 浸潤(rùn)及肺實(shí)質(zhì)破壞的主要原因之一。
[0005] 其他疾病如：多種慢性纖維化性疾?。∕i等，2011);
[0006] 急性移植物排斥（Antonysamy 等，1999; Yoshida 等，2006; Tang 等，2001);
[0007] 銀屑?。═eunissen等，1998)和銀屑病關(guān)節(jié)炎；
[0008] 全身性硬化癥（Kurasawa 等，2000 );
[0009] 全身性紅斑狼瘡（Wong等，2000);
[0010] 自身免疫炎性腸炎和克羅恩?。∟ielsen等，2003 ;Fujino等，2003 ;Yen等， 2006)；
[0011] 心血管疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化（Csiszar和Ungvari, 2004)，川崎?。⊿ohn等， 2003)，缺血性心臟?。–siszar，2003)和中風(fēng)；
[0012] 癌癥，包括淋巴瘤（Maggio 等，2002)和腫瘤（Numassaki 等，2005);
[0013] 病毒感染導(dǎo)致的疾病等。
[0014] 綜上所訴，此類疾病均出現(xiàn)IL-17異常表達(dá)，利用IL-17拮抗劑治療此類疾病，具 有重要價(jià)值。
[0015] 上世紀(jì)90年代中期以來，抗體藥物在新藥中嶄露頭角。在治療性應(yīng)用中，全人抗 體可以克服鼠源單克隆抗體在臨床應(yīng)用中的諸多缺點(diǎn)：如誘發(fā)人體產(chǎn)生抗鼠抗體（HAMA) 反應(yīng)，不能有效引起CDC及ADCC等。隨著對(duì)人類抗體基因及結(jié)構(gòu)的研究及分子生物學(xué)技術(shù) 的進(jìn)展，利用噬菌體抗體庫(kù)制備人源抗體，已成為獲得全人抗體的最主要手段之一。
[0016] 噬菌體抗體庫(kù)是利用基因重組技術(shù)將外源基因的基因型和表型統(tǒng)一在同一個(gè)噬 菌體顆粒內(nèi)。更重要的是，該類噬菌體抗體，不僅可以與特異的配體結(jié)合，而且保持感染能 力。這樣又將抗體的選擇能力和噬菌體的擴(kuò)增能力偶聯(lián)起來，使得噬菌體展示技術(shù)成為一 種極其有效抗體篩選系統(tǒng)。經(jīng)典的篩選方法是將抗原純化，然后與抗體庫(kù)孵育，通過數(shù)次 "吸附一洗滌一洗脫一擴(kuò)增"的過程（即生物淘選），使得特異克隆得以富集。可以迅速得 到針對(duì)靶抗原的抗體，通過功能篩選最終獲得中和性抗體。
[0017] 針對(duì)IL-17A的抗體已見報(bào)道，例如，R&D公司已生產(chǎn)鼠抗人IL-17單克隆抗體 MAB317。W02006/054059(UCB細(xì)胞技術(shù)公司）描述了 IL-17A中和性抗體分子，該分子最 初從雜交瘤中分離并PEG化抗體片段。采用BIAcore測(cè)定該片段對(duì)IL-17的親和力為 133-365pM。
[0018] CN200580026569. 4 (諾瓦提斯公司）報(bào)道IL-17A的特異性抗體，并應(yīng)用與治療 IL-17介導(dǎo)的相關(guān)疾病。
[0019] CN200680046605. 8 (伊萊利利公司）報(bào)道IL-17A的特異性抗體，并應(yīng)用與治療 IL-17介導(dǎo)的相關(guān)疾病。
[0020] W02006/013107(諾華制藥股份有限公司）報(bào)道了 IL-17A的特異性抗體，特別是稱 為AIN457,從雜交瘤分離人抗IL-17抗體與人IL-17A的親和力為227pM.
[0021] CN200780023566. 4(阿斯特拉捷利康股份公司），報(bào)道利用噬菌體庫(kù)分離獲得抗 IL-17單鏈抗體片段。
[0022] CN200780029886. 0 (UCB醫(yī)藥有限公司）報(bào)道IL-17A的特異性抗體，并應(yīng)用與治 療IL-17介導(dǎo)的相關(guān)疾病。
[0023] CN200780003925. X (諾瓦提斯公司)報(bào)道了將IL-17A特異性抗體用于治療實(shí)體或 造血系統(tǒng)性腫瘤。
[0024] 其本發(fā)明中的與人IL-17A相結(jié)合的片段，與上述片段序列完全不同，并抑制 IL-17A相關(guān)生物學(xué)活性可用于治療IL-17A相關(guān)疾病，其為全新的IL-17A的抗體分子，特別 是人抗體分子。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0025] 本發(fā)明的目的是提供具有潛在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)價(jià)值的一組全人源抗人白介素17A抗 體可變區(qū)序列。全人源抗人白介素17A抗體可變區(qū)核苷酸序列全長(zhǎng)234個(gè)核苷酸，其由可 變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū)組成，下劃線部分為可變區(qū)序列。
[0026] 重鏈可變區(qū)：
[0027] QVQLQQSGPG LVKPSQTLSL TCAISGDSVS 30
[0028] SNSAAffNVIR QSPSRGLEWL GRTYYRSKffS 60
[0029] HDYAVSVKSR ITINPDTSKN QFSLQLNSVT 90
[0030] PEDTAVYYCA REGEYGDYGY ffGQGTLVTVS 120
[0031] S
[0032] 輕鏈可變區(qū)：
[0033] SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY 30
[0034] YASWYQQKPG QAPVLVIYYD DDRPTGIPER60
[0035] FSGSNSGNTA TLTISRVEAG DEADYYCAAff 90
[0036] DDSLNGPVFG GGTKVTVLSG GST 113
[0037] 本發(fā)明公開了一種能夠和人成熟白介素17A結(jié)合的抗體，其特征在于，所述的抗 體含有的如下的結(jié)合片段，
[0038] 該片段的重鏈氨基酸序列為：SEQ ID N0:1 ;
[0039] 該片段的輕鏈氨基酸序列為：SEQ ID NO:3。
[0040] 所述的結(jié)合片段的核苷酸序列如下：
[0041] 該片段的重鏈核苷酸序列為：SEQ ID N0:2 ;
[0042] 該片段的輕鏈核苷酸序列為：SEQ ID N0:4。
[0043] 本發(fā)明公開的一種能夠和人成熟白介素17A結(jié)合的抗體，其特征在于，所述的抗 體含有的如下的結(jié)合片段，包含一組CDR :HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3,其 中該組CDR的至少與下列序列的同源性具有30% :
[0044] HCDR1 的氨基酸序列 SEQ ID N0:5 ;
[0045] HCDR2 的氨基酸序列 SEQ ID N0:6 ;
[0046] HCDR3 的氨基酸序列 SEQ ID N0:7 ;
[0047] LCDR1 的氨基酸序列 SEQ ID N0:8 ;
[0048] LCDR2 的氨基酸序列 SEQ ID N0:9 ;
[0049] LCDR3 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 10。
[0050] 本發(fā)明公開的一種能夠和人成熟白介素17A結(jié)合的抗體，其特征在于，所述的抗 體含有的如下的結(jié)合片段，所述結(jié)合片段中包含含有抗體VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域，
[0051] 其中所述VH結(jié)構(gòu)域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3及重鏈框架區(qū)FR1、FR2、FR3和 FR4 ；
[0052] 其中所述VL結(jié)構(gòu)域包含LCDR1、LCDR2和LCDR3及輕鏈框架區(qū)FR1、FR2、FR3和 FR4。
[0053] 所述的重鏈框架區(qū)FR根據(jù)抗體框架分類，可以屬于人或其他物種的
[0054] VH1、VH2、VH3、VH4、VH5 或 VH6 ;
[0055] 所述的輕鏈框架區(qū)FR根據(jù)抗體框架分類，可以屬于人的或其他物種
[0056] 的 Vk1、Vk2、Vk3*Vk4*VA1、VA2、VA3*VA4〇
[0057] 所述的其他物種優(yōu)選是鼠。
[0058] 本發(fā)明公開的一種能夠和人成熟白介素17Α結(jié)合的抗體，其特征在于，所述的抗 體含有的如下的結(jié)合片段，包含一組重鏈FR :HFR1、HFR2、HFR3,以及輕鏈FR :LFR1、LFR2和 LFR3,其中該組FR的至少與下列序列的同源性具有30% :
[0059] HFR1 的氨基酸序列 SEQ ID N0:11 ;
[0060] HFR2 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 12 ;
[0061] HFR3 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 13 ;
[0062] LFR1 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 14 ;
[0063] LFR2 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 15 ;
[0064] LFR3 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 16。
[0065] 本發(fā)明的抗體，其特征在于，含有上述結(jié)合片段的改型片段，及抗體基因片段，以 及同源性在30%以上的免疫結(jié)合片段。
[0066] 所述的改型片段選自 Diabody、Triabody、Tetrabody、Fab、scFv-Fv、IgG。
[0067] 所述的抗體基因片段如VH或VL。
[0068] 本發(fā)明的抗體，為全人源抗體。
[0069] 本發(fā)明公開了一種產(chǎn)生結(jié)合人IL-17A的結(jié)合片段的方法，該方法包括：提供編 碼VH結(jié)構(gòu)域的起始核酸和編碼VL結(jié)構(gòu)域的起始核酸的序列庫(kù)，該起始核酸具有可替換的 HCDR1、HCDR2和/或HCDR3編碼序列；利用隨機(jī)突變VH和VL結(jié)構(gòu)域起始核酸序列，和/或 將一個(gè)或多個(gè)核酸插入HCDR3起始序列庫(kù)區(qū)域，進(jìn)而產(chǎn)生親和力更高的結(jié)合片段。
[0070] 適應(yīng)癥：由于IL-17A信號(hào)通路參與許多自身免疫病(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、慢性炎癥 疾病（慢性阻塞性肺炎）及腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，激活I(lǐng)L-17A信號(hào)通路，促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子 釋放可以抑制以上疾病的進(jìn)程，該全人源抗人白介IL-17A單鏈抗體具有親和力高，全人源 化，免疫原性低，其生物學(xué)功能在于阻斷IL-17A信號(hào)通路和抑制相關(guān)細(xì)胞因子釋放，因此 其適應(yīng)癥在于治療以上自身免疫病及慢性炎癥疾病。
[0071] 本發(fā)明的抗體優(yōu)選在制備治療IL-17A相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
[0072] 優(yōu)選的IL-17A相關(guān)疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0073] 本發(fā)明的結(jié)合成員偶聯(lián)于可檢測(cè)物質(zhì)和治療劑，包含權(quán)利要求的結(jié)合成員用于的 診斷試劑盒。
[0074] 術(shù)語及簡(jiǎn)稱
[0075]

【權(quán)利要求】
1. 一種能夠和人成熟白介素17A結(jié)合的抗體，其特征在于，所述的抗體含有的如下的 結(jié)合片段， 該片段的重鏈氨基酸序列為：SEQ ID N0:1 ; 該片段的輕鏈氨基酸序列為：SEQ ID NO:3。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其特征在于，所述的結(jié)合片段的核苷酸序列如下： 該片段的重鏈核苷酸序列為：SEQ ID NO:2 ; 該片段的輕鏈核苷酸序列為：SEQ ID NO:4。
3. -種能夠和人成熟白介素17A結(jié)合的抗體，其特征在于，所述的抗體含有的如下的 結(jié)合片段，包含一組 CDR :HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2 和 LCDR3,其中該組 CDR 的至 少與下列序列的同源性具有30% : HCDR1的氨基酸序列SEQ ID N0:5 ; HCDR2的氨基酸序列SEQ ID N0:6 ; HCDR3的氨基酸序列SEQ ID N0:7 ; LCDR1的氨基酸序列SEQ ID N0:8 ; LCDR2的氨基酸序列SEQ ID N0:9 ; LCDR3的氨基酸序列SEQ ID NO: 10。
4. 一種能夠和人成熟白介素17A結(jié)合的抗體，其特征在于，所述的抗體含有的如下的 結(jié)合片段，所述結(jié)合片段中包含含有抗體VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域， 其中所述VH結(jié)構(gòu)域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3及重鏈框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4 ; 其中所述VL結(jié)構(gòu)域包含LCDR1、LCDR2和LCDR3及輕鏈框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的抗體，其特征在于， 所述的重鏈框架區(qū)FR根據(jù)抗體框架分類，可以屬于人或其他物種的VH1、VH2、VH3、 VH4、VH5 或 VH6 ; 所述的輕鏈框架區(qū)FR根據(jù)抗體框架分類，可以屬于人的或其他物種的Vk 1、VK 2、 Vk3 或 Vk4 或 νλ1、νλ2、νλ3*νλ4〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的抗體，其特征在于，所述的其他物種選自鼠。
7. -種能夠和人成熟白介素17Α結(jié)合的抗體，其特征在于，所述的抗體含有的如下的 結(jié)合片段，包含一組重鏈FR :HFR1、HFR2、HFR3,以及輕鏈FR :LFR1、LFR2和LFR3,其中該組 FR的至少與下列序列的同源性具有30% : HFR1的氨基酸序列SEQ ID N0:11 ; HFR2的氨基酸序列SEQ ID NO: 12 ; HFR3的氨基酸序列SEQ ID NO: 13 ; LFR1的氨基酸序列SEQ ID NO: 14 ; LFR2的氨基酸序列SEQ ID NO: 15 ; LFR3的氨基酸序列SEQ ID NO: 16。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的抗體，其特征在于，含有上述結(jié)合片段的改型片段，及 抗體基因片段，以及同源性在30%以上的免疫結(jié)合片段。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的抗體，其特征在于，所述的改型片段選自Diabody、Triabody、 Tetrabody、Fab、scFv-Fv、IgG〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求8的抗體，其特征在于，所述的抗體基因片段如VH或VL。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的抗體，其中所述的特征為全人源抗體。
12. -種產(chǎn)生結(jié)合人IL-17A的結(jié)合片段的方法，該方法包括： 提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的起始核酸和編碼VL結(jié)構(gòu)域的起始核酸的序列庫(kù)，該起始核酸具 有可替換的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3編碼序列；利用隨機(jī)突變VH和VL結(jié)構(gòu)域起始核酸 序列，和/或?qū)⒁粋€(gè)或多個(gè)核酸插入HCDR3起始序列庫(kù)區(qū)域，進(jìn)而產(chǎn)生親和力更高的結(jié)合片 段。
13. 權(quán)利要求1-X的抗體在制備治療IL-17A相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
14. 根據(jù)權(quán)利要求X的應(yīng)用，其特征在于，所述的IL-17A相關(guān)疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎。
15. 權(quán)利要求1-11中的結(jié)合片段，其中所述的結(jié)合成員偶聯(lián)于可檢測(cè)物質(zhì)和治療劑， 包含權(quán)利要求的結(jié)合成員用于的診斷試劑盒。
【文檔編號(hào)】A61P19/02GK104231080SQ201410098197
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月15日
【發(fā)明者】胡卓偉, 孫巍, 林珩, 米粟, 解靜 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所, 北京偉峰益民科技有限公司