抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA及其表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因表達(dá)的siRNA及其表達(dá)載體和應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)。本發(fā)明是將STAT3-siRNA導(dǎo)入惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，靶向作用于STAT3基因的mRNA，阻斷其翻譯過程，有效地沉默STAT3基因，有效抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤靶向STAT3的基因表達(dá)，能有效抑制惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，用于制備高效、快速、特異性強(qiáng)的抗惡性腦膠質(zhì)瘤治療藥物。
【專利說明】抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA及其表達(dá)載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)，特別是一種抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA及其表達(dá)載體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]STAT3是IL-6/JAK-STATs轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要成員，分子量89KD左右，最初發(fā)現(xiàn)并認(rèn)識(shí)STAT3是從研究細(xì)胞因子IL-6介導(dǎo)的急性期反應(yīng)時(shí)開始，它是一種轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)眾多基因的轉(zhuǎn)錄。后來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)STAT3不僅參與細(xì)胞因子介導(dǎo)的急性期反應(yīng)，而且在人類的多種惡性腫瘤中STAT3是異?；罨模{(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，其中包括惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
[0003]近年的研究發(fā)現(xiàn)，一些小的雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)可以高效、特異地促使體內(nèi)特定基因mRNA降解，誘使細(xì)胞出現(xiàn)特定基因缺失的表型，這種技術(shù)即RNAi。在RNAi作用的起始階段中外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA被Dicer酶切割為19~21bp的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs , siRNAs);隨后siRNA與核酶復(fù)合物結(jié)合后形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA induced silencing complex, RISC) ； RISC激活后通過堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上并切割mRNA，從而部分或完全抑制目的基因的表達(dá)。另一方面，細(xì)胞在RNA依賴性RNA聚合酶作用下，可以siRNA為引物、以mRNA為模板，合成出mRNA的互補(bǔ)鏈，從而使mRNA也變成了 dsRNA，然后在Dicer酶的作用下再次被裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有 誘發(fā)RNAi的作用，通過這個(gè)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，細(xì)胞內(nèi)的siRNA大大增加，顯著增加了對(duì)基因表達(dá)的抑制。
[0004]從RNAi的作用機(jī)制中可見，這種基因表達(dá)調(diào)控方法屬于轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)并具有明顯優(yōu)勢(shì):RNAi基因抑制效果確切，應(yīng)用微量的siRNA即可使其編碼致病基因產(chǎn)物的含量下降90%以上、甚至可以達(dá)到基因敲除的效果；其次，RNAi抑制具有嚴(yán)格的序列特異性，治療的針對(duì)性強(qiáng)，因而應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)能夠同時(shí)抑制同一基因的多個(gè)靶點(diǎn)或多個(gè)不同基因而不致相互干擾；同時(shí)，RNAi的作用具有級(jí)聯(lián)式放大效應(yīng)和高穿透性更適合惡性腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究；此外，RNAi序列識(shí)別的特異性即或?qū)τ梢吧忘c(diǎn)突變形成的癌基因也能夠產(chǎn)生準(zhǔn)確有效的封閉效果而對(duì)野生型基因沒有影響。在對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中也證實(shí):腫瘤細(xì)胞中均存在著RNAi的機(jī)制，化學(xué)合成、質(zhì)粒/病毒或其他方式介導(dǎo)的RNAi可以有效地抑制內(nèi)源性RNA的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明就是為了解決膠質(zhì)瘤等腫瘤基因治療問題，以RNA干擾機(jī)制為基礎(chǔ)，通過人工合成或表達(dá)質(zhì)粒序列轉(zhuǎn)錄形成的STAT3小雙鏈RNA(SiRNA)可以靶向作用于STAT3基因的mRNA，從而阻斷其翻譯過程，達(dá)到使STAT3基因表達(dá)降低的結(jié)果，而提供一種抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA及其表達(dá)載體和應(yīng)用。[0006]本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0007]一種抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA，該siRNA具有特異性抑制惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用，其堿基序列為:5’-TGAAATCATCATGGGCTAT-3’。
所述抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA，其特征在于:該siRNA靶向人的基因序列號(hào)為NM_003150的STAT3轉(zhuǎn)錄本，作用于該基因序列mRNA的第2169至2188位。
[0008]一種抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA慢病毒表達(dá)載體，其包含如權(quán)利要求1所述的siRNA，具有特異性抑制人STAT3基因表達(dá)，特異性抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用。
[0009]所述抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA慢病毒表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含有PGC-LV載體 ，其DNA序列中病毒表達(dá)載體是慢病毒。
[0010]所述抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA在制備抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤治療藥物中的應(yīng)用。
[0011]所述抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA慢病毒表達(dá)載體在制備抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤治療藥物中的應(yīng)用。
[0012]結(jié)果表明:STAT3siRNA可通過慢病毒體介導(dǎo)作用成功轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染STAT3siRNA后的細(xì)胞代謝受抑制，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，CCK8吸收值較對(duì)照組和空載組明顯下降；Western blot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染了 STAT3siRNA的細(xì)胞STAT3的總蛋白和磷酸化蛋白表達(dá)均受抑制；流式細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)表明:STAT3-siRNA在轉(zhuǎn)染96小時(shí)后凋亡比例較對(duì)照組和空載組明顯增多。
[0013]這樣，本發(fā)明是將STAT3_siRNA導(dǎo)入惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，靶向作用于STAT3基因的mRNA，阻斷其翻譯過程，有效地沉默STAT3基因，有效抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤靶向STAT3的基因表達(dá)，能有效抑制惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)的目的。該siRNA及其慢病毒表達(dá)載體可用于制備高效、快速、特異性強(qiáng)的抗腫瘤藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是U87細(xì)胞qRT-PCR法篩選靶點(diǎn)柱狀圖分析圖；
圖2是U251細(xì)胞qRT-PCR法篩選靶點(diǎn)柱狀圖分析圖；
圖3是Western blot方法驗(yàn)證LV_STAT3siRNA在U87細(xì)胞中的敲除效果圖；
圖4是Western blot方法驗(yàn)證LV_STAT3siRNA在U251細(xì)胞中的敲除效果圖；
圖5是慢病毒重組載體的酶切鑒定圖；
圖6是PGC-LV載體圖譜；
圖7是U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染后96小時(shí)綠色熒光蛋白表達(dá)情況；
圖8是U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染后96小時(shí)綠色熒光蛋白表達(dá)情況；
圖9是Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞后凋亡蛋白的表達(dá)情況；
圖10是Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后凋亡蛋白的表達(dá)情況；
圖11是U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各時(shí)間點(diǎn)CCK8吸收值；
圖12是U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各時(shí)間點(diǎn)CCK8吸收值；圖13是U87對(duì)照組轉(zhuǎn)染后流式測(cè)定細(xì)胞凋亡情況；
圖14是U87空載組轉(zhuǎn)染后流式測(cè)定細(xì)胞凋亡情況；
圖15是U87實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后流式測(cè)定細(xì)胞凋亡情況；
圖16是U251對(duì)照組轉(zhuǎn)染后流式測(cè)定細(xì)胞凋亡情況；
圖17是U251空載組轉(zhuǎn)染后流式測(cè)定細(xì)胞凋亡情況；
圖18是U251實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后流式測(cè)定細(xì)胞凋亡情況；
圖19是本發(fā)明siRNA的堿基序列。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0016]實(shí)施例一:干擾人STAT3基因表達(dá)的siRNA序列設(shè)計(jì)和篩選
1.siRNA序列設(shè)計(jì)
本發(fā)明以RNA干擾技術(shù)為基礎(chǔ)，利用NCBI Genbank檢索基因序列號(hào)為NM_003150的STAT3mRNA的全長(zhǎng)序列，參照siRNA設(shè)計(jì)原則，并運(yùn)用RNA structure軟件模擬祀mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，盡量避免自身 結(jié)合的莖區(qū)，選擇配對(duì)區(qū)域較少的序列，如線區(qū)和環(huán)區(qū)。分別篩選出5條siRNA均為19個(gè)核苷酸的序列，并將它們帶入BLAST基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，排除了和其他編碼序列/EST同源。并將其分別命名為STAT3-siRNA-l、STAT3-siRNA_2、STAT3-siRNA-3、STAT3_siRNA_4、STAT3_siRNA_5 (見表 I)如圖 19 所示(由上海吉?jiǎng)P公司合成)。
[0017]表1干擾人STAT3基因表達(dá)的siRNA序列
【權(quán)利要求】
1.一種抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA，其特征在于:該siRNA具有特異性抑制惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用，其堿基序列為:5’ -TGAAATCATCATGGGCTAT-3’O
2.如權(quán)利要求1所述抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA，其特征在于:該siRNA靶向人的基因序列號(hào)為NM_003150的STAT3轉(zhuǎn)錄本，作用于該基因序列mRNA的第2169至2188位。
3.一種抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA慢病毒表達(dá)載體，其特征在于:該表達(dá)載體包含如權(quán)利要求1所述的siRNA，具有特異性抑制人STAT3基因表達(dá)，特異性抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用。
4.如權(quán)利要求3所述所述抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA慢病毒表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含有PGC-LV載體，其DNA序列中病毒表達(dá)載體是慢病毒。
5.權(quán)利要求1所述抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA在制備抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤治療藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3所述抑制人惡性腦膠質(zhì)瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA慢病毒表達(dá)載體在制備抑制人惡 性腦膠質(zhì)瘤治療藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103952406SQ201410101962
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】馮學(xué)泉, 王金環(huán), 李牧, 徐新女, 張飚, 吳靜超 申請(qǐng)人:天津市第一中心醫(yī)院