一種具有誘導基因表達的骨生物修復制劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有誘導基因表達的骨生物修復制劑的制備方法。制得的生物材料可用于制造生物骨修復牙膏、組織工程再生、創(chuàng)傷修復醫(yī)用材料等。特別是在：組織工程骨、周圍神經(jīng)、血管、肌腱、體外人工肝人工腎裝置、組織工程口腔粘膜，骨修復材料，預防齲齒、牙齒松動、牙齦出血、牙齒修復，創(chuàng)傷修復等方面的有著重大的科學價值和意義，為人類組織再生工程作出重大貢獻。
【專利說明】一種具有誘導基因表達的骨生物修復制劑的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有誘導基因表達的生物修復制劑的制備方法，特別涉及一種長期持續(xù)使用可解決骨修復等問題的生物活性制劑。本發(fā)明的產(chǎn)品可用于制造生物骨修復牙膏、組織工程再生、創(chuàng)傷修復醫(yī)用材料等。可廣泛的應用在:組織工程骨、周圍神經(jīng)、血管、肌腱、體外人工肝人工腎裝置、組織工程口腔粘膜，骨修復材料，預防齲齒、牙齒松動、牙齦出血、牙齒修復，創(chuàng)傷修復等方面的廣泛應用。
【背景技術】
[0002]一、牙膏市場:
[0003]當今中國牙膏市場中，每年我國共生產(chǎn)牙膏約80億標準支(65克包裝)，實現(xiàn)總產(chǎn)值140億元。我國牙膏的市場容量應在220億元至240億元之間，還有近1/3的功能性牙骨市場沒開發(fā)。
[0004]牙膏的類型不外乎這四大類:脫敏牙膏，爭對牙齒敏感的人群；第二類:防齲齒，兒童面臨酸性飲食環(huán)境，對蛀牙的傷害。第三類:藥物類牙膏，針對牙周炎等不同的病狀；簡單止血功能，無法修復受損牙齒部分。第四類:是美白、清新口氣，只起到清潔作用。
[0005]中國人口老齡化嚴重，牙齒松動、牙齦出血等口腔疾病比較普遍；兒童防蛀，主要加入含氟牙膏，在地中海性質區(qū)域，造成大量氟斑牙。
[0006]二、組織工程應用:
[0007]目前組織工程應用主要出現(xiàn):合成材料，高分子人工合成材料PLAPGA PLGA，鈣磷類人工合成陶瓷材料TCP HAP CPC BGC,復合材料PLA+HAP/TCP/CPC等生物材料的研究。
[0008]創(chuàng)傷市場目前主要靠以豬皮為原料，制造人工植皮技術，有生物免疫原性的副作用。
[0009]骨修復材料，主要來源有同種異體骨，人工骨等材料。遠遠無法滿足醫(yī)學發(fā)展的需要。

【發(fā)明內容】

[0010]針對上述問題，本發(fā)明提供一種本發(fā)明涉及一種具有誘導基因表達的生物修復制劑的制備方法。該產(chǎn)品可用于制造生物骨修復牙膏、組織工程再生、創(chuàng)傷修復醫(yī)用材料等?？蓮V泛的應用在:組織工程骨、周圍神經(jīng)、血管、肌腱、體外人工肝人工腎裝置、組織工程口腔粘膜，骨修復材料，預防齲齒、牙齒松動、牙齦出血、牙齒修復，創(chuàng)傷修復等方面的廣泛應用。
[0011]本發(fā)明的制劑的制備方法包括如下步驟:
[0012](I)制備氧化鈣:取石灰石在鉬金罐中密封，在1900°c的條件下高溫煅燒，冷卻后經(jīng)粉碎成為10-20nm的CaO粉末；
[0013] (2)生成具有生物活性的羥基磷灰石:取規(guī)格為10_20nm的CaO和P2O5納米粉末，按照質量比1: 1.67混合均勻(500g)，在36-38°C的情況下，無光條件下陳化至少12小時；加入醫(yī)用純凈水500g攪拌成糊狀，隨后加入Na2O2 (3g) 38°C下攪拌45分鐘，過10-20目篩，得到粒徑為10-20nm的羥基磷灰石Caltl (PO4)6 (OH)2 (HA)；
[0014](3)向步驟(2)所得羥基磷灰石中加入SiO2 (5g)混合均勻后，在-15~_20°C下凍干機冷凍干燥成粉末，并加入醫(yī)用甘油10g、醫(yī)用聚乙二醇10g、醫(yī)用級鈦白粉3g、香精lg、卡波姆2-3g、AK糖3g和十二烷基硫酸鈉2g,均勻混合；
[0015](4)滅菌:將步驟⑶混合所得膏狀體在10°C條件下，輻照滅菌2小時；
[0016](5)干燥:將步驟⑷所得生物制劑，在_15°C條件下凍干成固體狀；
[0017](6)粉碎:將該固體粉碎成為20nm的粉末狀。
[0018](7)包裝:將滅菌膏體灌裝在無菌低密度聚乙烯管內，每管質量為60g。
[0019]其中，SiO2與Caltl (PO4)6 (OH)2形成具有三維網(wǎng)狀生物多孔結構的無機礦物質。SiO2與Caltl (PO4) 6 (OH) 2與唾液中的H2O發(fā)生迅速的反應，PH值在7.5左右，合成具有誘導基因表達能力的羥基磷灰石。釋放Ca離子和P離子，從而補充損傷骨結構礦物質，產(chǎn)生沉積在受損骨創(chuàng)面之上和之內的穩(wěn)定的結晶狀羥基磷酸鹽灰石層(礦化)，促使骨組織生長，抑制和殺滅細菌，誘導新的新生組織形成，同時殺菌等作用也能有效緩解創(chuàng)傷發(fā)炎腫脹等癥狀。
[0020]誘導基因表達能力:
[0021]普通的羥基磷灰石僅僅可以修復，不具有誘導基因表達能力，細胞組織不能有序排列。而本發(fā)明的材料形成無水無機礦物，該礦物質具有三維的網(wǎng)狀多孔結構，其深入損傷部分深處的細胞和毛細血管沿著與人體骨骼和組織相一致的孔裝結構中，有序生長，再生細胞爬行在三維網(wǎng)狀結構中。讓新生組織有序的排列，具有基因的表達的能力。
[0022]生物降解，爬行替代:
[0023]本發(fā)明的材料在組織再生后，原三維多孔結構無機礦物質。新生組織在30日內，逐步爬行替代原結晶礦物質，原結晶礦物質降解為二氧化碳和水，隨毛細血管排出。其新生組織恢復為原有形狀。
[0024]本發(fā)明的材料可用于制造生物骨修復牙膏、組織工程再生、創(chuàng)傷修復醫(yī)用材料等。特別是在:組織工程骨、周圍神經(jīng)、血管、肌腱、體外人工肝人工腎裝置、組織工程口腔粘膜，骨修復材料，預防齲齒、牙齒松動、牙齦出血、牙齒修復，創(chuàng)傷修復等方面的有著重大的科學價值和意義，為人類組織再生工程作出重大貢獻。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是X射線下的新生羥基磷灰石成像圖。
[0026]圖2是牙齒骨修復后的效果圖。
[0027]圖3是骨修復效果圖。其形成的三維多孔網(wǎng)狀結構，和人體結構基本一致。
[0028]圖4是骨關節(jié)軟組織的修復效果圖。
[0029]圖5是對軟組織的修復作用。其中，誘導組為使用本發(fā)明的產(chǎn)品的結果圖?！揪唧w實施方式】
[0030]以下實施方式僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護范圍并非僅僅局限于以下實施例。所述【技術領域】的普通技術人員依據(jù)本發(fā)明的公開內容，均可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0031]本發(fā)明的制劑的制備方法包括如下步驟:[0032](I)制備氧化鈣:取石灰石在鉬金罐中密封，在1900°C的條件下高溫煅燒，冷卻后經(jīng)粉碎成為10-20nm的CaO粉末；
[0033](2)生成具有生物活性的羥基磷灰石:取規(guī)格為10_20nm的CaO和P2O5納米粉末，按照質量比1: 1.67混合均勻為500g的粉末，在36-38°C的情況下，無光條件下陳化至少12小時；加入醫(yī)用純凈水500g攪拌成糊狀，隨后加入Na202 (3g)38°C下攪拌45分鐘，過10-20目篩，得到粒徑為10-20nm的羥基磷灰石Caltl (PO4)6 (OH)2 (HA)；
[0034](3)向步驟⑵所得羥基磷灰石中加入SiO2 (5g)混合均勻后，在-15~_20°C下凍干機冷凍干燥成粉末，并加入醫(yī)用甘油10g、醫(yī)用聚乙二醇10g、醫(yī)用級鈦白粉3g、香精lg、卡波姆2-3g、AK糖3g和十二烷基硫酸鈉2g,均勻混合；
[0035](4)滅菌:將步驟(3)混合所得膏狀體在10°C條件下，輻照滅菌2小時；
[0036](5)干燥:將步驟(4)所得生物制劑，在_15°C條件下凍干成固體狀；
[0037](6)粉碎:將該固體粉碎成為20nm的粉末狀。
[0038](7)包裝:將滅菌膏體灌裝在無菌低密度聚乙烯管內，每管質量為60g。
[0039]技術效果
[0040]臨床試驗研究報告:含本發(fā)明的骨修復生物制劑的牙膏與標準含氟牙膏對減輕牙齦炎癥及菌斑效果的臨床研究報告 [0041]研究人群和方法
[0042]本研究為隨機、雙盲、對照、平行的臨床研究。試驗牙膏為本發(fā)明實施方式的骨修復制劑制成的牙膏，陰性對照標準含氟牙膏。所有牙膏統(tǒng)一包裝。所有受試用者使用同一廠家生產(chǎn)的同一型號牙刷。
[0043]受試者參加口腔軟組織及硬組織檢查，齦炎及菌斑檢查，按照納入和排除標準決定實驗對象是否入選。
[0044]納入標準:
[0045](I)全身健康狀況良好；
[0046](2)年齡在18~70周歲；
[0047](3)如果為女性，不得處于妊娠期和哺乳期內；
[0048](4)改良 Quigley-Hein 菌斑指數(shù)≥ 1.5 ；
[0049](5)Loe-Silness 銀炎指數(shù)≥ 1.0 ；
[0050](6)沒有同時參加其他類似試驗研究。
[0051]排除標準:
[0052](I)至少20顆牙無活性齲、冠和V類型修復體；
[0053](2) 口腔有明顯未治療齲(肉眼觀)；
[0054](3)無進展性牙周炎，如超過4_的牙周袋不超過2個位置；
[0055](4)懷孕或哺乳期；
[0056](5)有全身疾病如中風、結核病、糖尿病、癲癇、傳染性疾病(如肝炎)、濫用藥物、對牙膏及其他口腔衛(wèi)生產(chǎn)品過敏；
[0057](6)長期食用抗生素治療；
[0058](7)戴正畸帶環(huán)，部分或全口活動義齒，橋修復體超過4顆天然牙；
[0059](8)有嚴重的牙齦炎和牙周?。籟0060](9)有嚴重的牙科病變:觸。牙周病、癌前病變、口腔炎性狀態(tài)；
[0061](10)正在參加其他研究；
[0062](11)對牙膏的成分發(fā)生過敏。
[0063]共100位研究對象參加了本發(fā)明產(chǎn)品的臨床研究，將其隨機分為試驗組與對照組。給受試者統(tǒng)一發(fā)放各自相應的牙膏和軟質牙刷，要求受試者按規(guī)定I日刷牙2次(早、晚)，每次時間lmin。要求試驗過程中不使用任何其他口腔衛(wèi)生用品，如其他種類的牙膏、牙刷、漱口液、牙線等。對飲食和抽煙不作限制。6周時補充試驗的牙膏和牙刷。在使用藥膏牙刷6周和12周時，對受試者牙菌斑和牙齦炎狀況按照基線檢查的程序進行再評估。
[0064]在基線、6周和12周評價 前8小時不進行口腔清潔。采用改良的Q-H菌斑指數(shù)和牙銀指數(shù)(Silness&L0e Plaque Index)評價牙周狀況。
[0065]銀炎指數(shù)及檢查方法:牙銀炎采用改良Loe-Silness銀炎指數(shù)測量,在測量菌斑指數(shù)之前測量牙齦情況。牙齦炎計數(shù)方法及標準如下:
[0066]0=無齦炎
[0067]1=輕度齦炎，牙齦色澤和質地略有變化，但探診無出血
[0068]2=中度炎癥，牙齦光亮。紅、腫，增生、探診出血
[0069]3 =重度炎癥，牙齦明顯發(fā)紅、增生、有自發(fā)性出血
[0070]檢查每個牙頰面及舌面，除第三磨牙、假牙和有頸部修復體的牙，其余的牙均包括在計數(shù)之列。Loe-Silness齦炎指數(shù)的均數(shù)是指所有牙計數(shù)值的總和除以總的測量面數(shù)所得數(shù)值。
[0071]菌斑指數(shù)及檢查方法:采用Quigley-Hein改良Turesky菌斑指數(shù)評價銀上菌斑。牙菌斑染色，首先滴5滴染色劑,用舌頭將染色劑布滿整個牙面(30秒)，含一小口水,在囑咐受試者含漱30秒，使染色劑充分與牙面接觸，清水漱口。使用菌斑染色劑染色后根據(jù)下列標準記錄:
[0072]0=無菌斑
[0073]1=牙頸部邊緣存在散在的菌斑
[0074]2 =牙頸邊緣可見連續(xù)的薄菌斑帶(達1_寬)
[0075]3 =牙頸部菌斑帶大于Imm但少于牙面的1/3
[0076]4=菌斑覆蓋牙面的1/3-2/3
[0077]5=菌斑覆蓋牙面2/3以上，
[0078]檢查每個牙齒的頰面和舌面。出第三磨牙、假牙和有頸部修復體的牙，其余的牙均在記數(shù)之列。每一受試者菌斑指數(shù)的均數(shù)由個人全部牙齒檢查所得計數(shù)之和除以總的測量數(shù)得到。
[0079]統(tǒng)計方法:數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件的ANOVA及t檢驗進行統(tǒng)計分析，采用雙側檢驗，檢驗水準a為0.05.[0080]結果:
[0081]100位受試者參加本研究，6周檢查時隨訪98例，12周隨訪96例，失訪率為4.0%。試驗對象及檢查者均沒有牙膏副作用的報告，失訪的主要原因是外出、生病，使用抗生素等，失訪受試者退出本研究的原因與使用研究牙膏無關。試驗結果如下:
[0082]表1完成研究人群的基線檢查結果
【權利要求】
1.一種具有誘導基因表達的骨生物修復制劑的制備方法，其特征在于所述方法包括如下步驟: (1)制備氧化鈣:取石灰石在鉬金罐中密封，在1900°c的條件下高溫煅燒，冷卻后經(jīng)粉碎成為10-20nm的CaO粉末； (2)生成羥基磷灰石:取規(guī)格為10-20nm的CaO和P2O5納米粉末，質量比I: 1.67混合均勻(500g)，在36-38°C的情況下，無光條件下陳化至少12小時；加入醫(yī)用純凈水500g攪拌成糊狀，隨后加入Na2O2 (3g) 38°C下攪拌45分鐘，過10-20目篩，得到粒徑為10_20nm的羥基磷灰石； (3)向步驟(2)所得羥基磷灰石中加入SiO2(5g)混合均勻后，在-15~-20°C下冷凍干燥成粉末，并加入醫(yī)用甘油10g、醫(yī)用聚乙二醇10g、醫(yī)用級鈦白粉3g、香精lg、卡波姆2-3g、AK糖3g和十二烷基硫酸鈉2g,均勻混合； (4)滅菌:將步驟(3)混合所得膏狀體在10°C條件下，輻照滅菌2小時； (5)干燥:將步驟(4)所得的生物制劑，在_15°C條件下凍干成固體狀； (6)粉碎:將該固體粉碎成為20nm的粉末狀； (7)包裝:將滅菌膏體灌裝在無菌低密度聚乙烯管內，每管質量為60g。
【文檔編號】A61P1/02GK104013993SQ201410104328
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權日:2014年3月20日
【發(fā)明者】胡方 申請人:胡方