豬流行性腹瀉滅活疫苗的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種豬流行性腹瀉滅活疫苗的制備方法及其產(chǎn)品，該方法包括：（1）細(xì)胞的培養(yǎng)：將Vero細(xì)胞按照3×105個(gè)/ml的接種密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋中的微載體上，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)細(xì)胞；（2）病毒液的增殖：沉降微載體，洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞，接種豬流行性腹瀉病毒毒種，加入病毒增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液；（3）將病毒液滅活后，乳化，得到豬流行性腹瀉滅活疫苗。本發(fā)明方法優(yōu)化了波浪生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細(xì)胞的各工藝參數(shù)，有效提升了Vero細(xì)胞的培養(yǎng)效率，顯著提高了豬流行性腹瀉滅活疫苗的生產(chǎn)效能以及免疫保護(hù)效力。
【專利說(shuō)明】豬流行性腹瀉滅活疫苗的制備方法及其產(chǎn)品
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及豬流行性腹瀉滅活疫苗的生產(chǎn)方法，尤其涉及一種利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)預(yù)防或治療豬流行性腹瀉滅活疫苗的方法，屬于豬流行性腹瀉滅活疫苗的生產(chǎn)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]豬流行性腹瀉(PED)是由病毒引起的仔豬和育肥豬的一種急性腸道傳染病。本病與傳染性胃腸炎很相似，是一種高度接觸性傳染性，以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水，致兩周齡內(nèi)仔豬高死亡率為特征的病毒性傳染病。在中國(guó)多發(fā)生在每年12月份至翌年I~2月，夏季也有發(fā)病的報(bào)道?？砂l(fā)生于任何年齡的豬，年齡越小，癥狀越重，死亡率高。本病尚無(wú)有效治療藥物，疫苗免疫接種是預(yù)防和控制豬流行性腹瀉病的根本措施。
[0003]目前，豬流行性腹瀉滅活疫苗的生產(chǎn)主要是轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，進(jìn)而增殖PEDV。但轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞增殖較為緩慢而且生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)細(xì)胞和病毒的培養(yǎng)條件，如PH、溶氧、糖耗等難以監(jiān)控和適時(shí)補(bǔ)給，無(wú)法提供最佳的培養(yǎng)條件，造成該方法自動(dòng)化程度低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，并因?yàn)檗D(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的不可控性，導(dǎo)致生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性不夠，批間差較大，效價(jià)低，產(chǎn)量低等問(wèn)題。而用生物反應(yīng)器替代轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)疫苗株則克服了上述所述不足，成為最具有前途的豬流行性腹瀉滅活疫苗生產(chǎn)技術(shù)之一。
[0004]WAVE波浪生物反應(yīng)器是采用拋棄型生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的一種新型反應(yīng)器。其工作方式是，細(xì)胞接種于可拋棄的細(xì)胞培養(yǎng)袋內(nèi)，接種細(xì)胞的培養(yǎng)袋固定在托盤(pán)上以一定的方式搖動(dòng)，精密控制的搖動(dòng)保證了培養(yǎng)體系的有效混合和傳氧效率。
[0005]采用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬流行性腹瀉滅活疫苗時(shí)，所加入微載體的含量、細(xì)胞接種密度、細(xì)胞培養(yǎng)袋的`搖動(dòng)參數(shù)等生產(chǎn)條件對(duì)于豬流行性腹瀉滅活疫苗的生產(chǎn)效率以及免疫保護(hù)效力的高低等有非常顯著的影響，在生產(chǎn)實(shí)踐中需要對(duì)這些條件進(jìn)行優(yōu)化才能有效提高豬流行性腹瀉滅活疫苗的生產(chǎn)效率及其免疫保護(hù)效力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬流行性腹瀉滅活疫苗的方法，該方法對(duì)微載體的含量、細(xì)胞接種密度、細(xì)胞培養(yǎng)條件等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，有效提升了豬流行性腹瀉滅活疫苗的生產(chǎn)效率以及免疫保護(hù)效力。
[0007]本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
[0008]一種豬流行性腹瀉滅活疫苗的生產(chǎn)方法，包括:(I)細(xì)胞的培養(yǎng):將細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋中的微載體上，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)細(xì)胞；(2)病毒液的增殖:沉降微載體，洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞，接種豬流行性腹瀉病毒毒種，加入病毒增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液；(3)將病毒液滅活后，乳化，得到豬流行性腹瀉滅活疫苗；其中，將Veix)細(xì)胞按照3X IO5個(gè)/ml的接種密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋中的微載體上。
[0009]本發(fā)明采用WAVE波浪生物反應(yīng)器，主要優(yōu)點(diǎn)有I)免除生物反應(yīng)器清洗、消毒及其相關(guān)認(rèn)證。2)封閉培養(yǎng)系統(tǒng)，無(wú)需固定的管道，簡(jiǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)廠房，縮短反應(yīng)器安裝和生產(chǎn)產(chǎn)品轉(zhuǎn)換時(shí)間。3)細(xì)胞培養(yǎng)袋Cellbag放在特殊設(shè)計(jì)的搖動(dòng)平臺(tái)上，平臺(tái)的搖動(dòng)在培養(yǎng)液中產(chǎn)生波浪提供培養(yǎng)物混合和氧氣傳遞，產(chǎn)生一個(gè)適于細(xì)胞生長(zhǎng)的完美環(huán)境。
[0010]采用WAVE波浪生物反應(yīng)器培養(yǎng)VeiX)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞接種密度、微載體含量以及搖動(dòng)培養(yǎng)條件對(duì)于Veix)細(xì)胞在微載體上的吸附以及細(xì)胞生長(zhǎng)等有非常顯著的影響，為了篩選到最適宜的培養(yǎng)參數(shù)以最大限度的促進(jìn)Veix)細(xì)胞生長(zhǎng)，本發(fā)明采用正交試驗(yàn)，選擇對(duì)VeiO細(xì)胞生長(zhǎng)影響較大的細(xì)胞接種密度、微載體含量和搖動(dòng)條件作為考察對(duì)象，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索確定相關(guān)水平，并運(yùn)用極差分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化考察，觀察不同的培養(yǎng)條件對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)所帶來(lái)的影響。
[0011]從實(shí)驗(yàn)結(jié)果的極差分析可以看出，影響VeiX)細(xì)胞含量的各因子的強(qiáng)弱順序依次為細(xì)胞接種密度 > 微載體含量 > 搖動(dòng)培養(yǎng)條件；其中，當(dāng)VeiO細(xì)胞接種密度為3 X IO5個(gè)/ml、微載體含量為3g/L、搖動(dòng)培養(yǎng)條件為7°、16rpm時(shí)，Vero細(xì)胞含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它的參數(shù)，Vero細(xì)胞的含量達(dá)到2.96 X IO7個(gè)/毫升。
[0012]本發(fā)明方法優(yōu)化了波浪生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞的各工藝參數(shù)，有效提升了細(xì)胞的培養(yǎng)效率，顯著提高了滅活疫苗的生產(chǎn)效能以及免疫保護(hù)效力；免疫保護(hù)效力實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明方法所制備的豬流行性腹瀉滅活疫苗對(duì)于豬有良好的免疫保護(hù)效果，本發(fā)明滅活疫苗的免疫保護(hù)效力要顯著優(yōu)于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶制備的滅活疫苗對(duì)豬的免疫保護(hù)效力。本發(fā)明的滅活疫苗生產(chǎn)方法體現(xiàn)了連續(xù)培養(yǎng)和規(guī)?；a(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞和病毒的趨勢(shì)，與傳統(tǒng)的搖瓶培養(yǎng)工藝相比，抗原效價(jià)提高顯著，而且產(chǎn)品質(zhì)量均一，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)化，操作簡(jiǎn)單，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施方 案來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0014]生物材料及儀器
[0015]1.1、生物反應(yīng)器:美國(guó)Wave Biotech公司W(wǎng)AVE波浪生物反應(yīng)器。
[0016]1.2、微載體=Cytodex-1 (購(gòu)自美國(guó)通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部)。
[0017]1.3、豬流行性腹瀉病毒株:微生物保藏編號(hào)為C C TCC-V 200608(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)；此外，通過(guò)任何一種商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)得到的豬流行性腹瀉病毒株均能適用于本發(fā)明。
[0018]實(shí)施例1利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬流行性腹瀉滅活疫苗
[0019]1.細(xì)胞的培養(yǎng)
[0020]1.1細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)
[0021]用方瓶培養(yǎng)從液氮罐中復(fù)蘇的VeiO細(xì)胞，培養(yǎng)條件包括:pH值7.2、溫度37°C;培養(yǎng)48-72h，形成良好細(xì)胞單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)；該過(guò)程中使用的培養(yǎng)基為MEM，血清為胎牛血清，使用量為8%。
[0022]1.2微載體處理[0023]按培養(yǎng)的終體積稱取微載體適量，用無(wú)Ca2+、Mg2+-PBS室溫浸泡過(guò)夜，棄去PBS，再用無(wú) Ca2+、Mg2+-PBS 洗一次,棄去,最后加入無(wú) Ca2+、Mg2+_PBS 高壓滅菌。115°C、lOps1、15min。
[0024]1.3微載體培養(yǎng)
[0025]用EDTA-胰酶細(xì)胞消化液制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按3 X IO5個(gè)/ml的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)的方法參數(shù)為:微載體濃度為3g/L、DO值50%、溫度37°C、擺動(dòng)角度7°、擺動(dòng)速度16次/min。在培養(yǎng)過(guò)程中監(jiān)控細(xì)胞培養(yǎng)袋中葡萄糖的消耗以及乳酸和氨的產(chǎn)生，同時(shí)在不同的節(jié)點(diǎn)上細(xì)胞計(jì)數(shù)(Cytodexl上的細(xì)胞計(jì)數(shù)先用PBS漂洗2次，經(jīng)0.1%結(jié)晶紫的檸檬酸溶液染色，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞核)，當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到I X 106-2X IO6個(gè)/ml時(shí)開(kāi)始灌注，依據(jù)細(xì)胞的密度、葡萄糖的消耗以每天灌注0.7-2個(gè)工作體積的速度，以維持細(xì)胞的生成。
[0026]2病毒液的增殖
[0027]當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到達(dá)第四天時(shí)沉降微載體，排出細(xì)胞培養(yǎng)袋中液體，加入PBS洗滌細(xì)胞，重復(fù)洗滌3次，加入病毒維持液并接種豬流行性腹瀉病毒(PEDV)，其中病毒接種劑量為5%、病毒增值的培養(yǎng)基為含2%血清的MEM，pH值7.4，溫度35°C。接毒后每隔一定時(shí)間取生物反應(yīng)器中的微載體，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，并檢測(cè)樣品TCID5tl,當(dāng)微載體上的細(xì)胞大部分脫落，停止培養(yǎng)，收獲病毒液，于-40°C凍融三次，得到豬流行性腹瀉病毒(PEDV)液。
[0028]3病毒含量的測(cè)定
[0029]利用TCID5tl方法進(jìn)行病毒含量的測(cè)定。病毒TCID5tl測(cè)定時(shí)，以MEM培養(yǎng)液將培養(yǎng)得到的PEDV液作連續(xù)10倍稀釋，即ΙΟ'ΙΟ-2……10_8，每個(gè)稀釋度取100 μ L加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中，隨后加入經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化分散的VeiO細(xì)胞懸液，每孔100 μ L (細(xì)胞含量以3X 105/ml左右為宜)，每個(gè)稀釋度作8個(gè)重復(fù)，并設(shè)正常細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)照，置5%C02培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變和對(duì)照，共觀察2~5日，并記錄細(xì)胞病變的孔數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID5(I。同時(shí)以相同的方法對(duì)用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的PEDV液進(jìn)行TCID5tl測(cè)定。以此作為對(duì)照組。
[0030]實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1,表1的結(jié)果表明，利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)的PEDV液病毒含量不小于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的PEDV液病毒含量。由此可見(jiàn)利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)的病毒要優(yōu)于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的病毒。
【權(quán)利要求】
1.一種豬流行性腹瀉滅活疫苗的生產(chǎn)方法，包括:(I)細(xì)胞的培養(yǎng):將細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋中的微載體上，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)細(xì)胞；(2)病毒液的增殖:沉降微載體，洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞，接種豬流行性腹瀉病毒毒種，加入病毒增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液；(3)將病毒液滅活后，乳化，得到豬流行性腹瀉滅活疫苗；其中，將細(xì)胞按照3X 105個(gè)/ml的接種密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋中的微載體上。
2.按照權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的細(xì)胞是VeiO細(xì)胞。
3.按照權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于:細(xì)胞培養(yǎng)袋中的微載體含量為3g/L。
4.按照權(quán)利要求1或3所述的生產(chǎn)方法,其特征在于:所述的微載體是Cytodex-1。
5.按照權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)細(xì)胞的搖動(dòng)培養(yǎng)條件為擺動(dòng)角度為7°、擺動(dòng)轉(zhuǎn)速為16rpm。
6.由權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述方法制備得到的豬流行性腹瀉滅活疫苗。
7.權(quán)利要求7所述的豬流行性腹瀉滅活疫苗在制備預(yù)防或治療由豬流行性腹瀉病毒所導(dǎo)致疾病藥物中的用途。
8.一種預(yù)防或治療由豬流行性腹瀉病毒所導(dǎo)致疾病的藥物組合物，其特征在于:含有預(yù)防或治療上 有效量的權(quán)利要求6所述的豬流行性腹瀉滅活疫苗。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK103861097SQ201410109321
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】何玉友, 王國(guó)輝, 王全杰, 吉有紅, 黎淵, 嚴(yán)成, 楊澤彬, 柳志光, 馮會(huì), 王石, 吳艷麗, 田麗華, 馮建民, 廉維, 劉斌, 楊鍵 申請(qǐng)人:吉林正業(yè)生物制品股份有限公司