偽狂犬病活疫苗的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種偽狂犬病活疫苗的制備方法，該方法包括：（1）細(xì)胞的培養(yǎng)：將細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋的微載體上，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)細(xì)胞；（2）病毒液的增殖：沉降微載體、洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞，接種偽狂犬病毒毒種，加入病毒增殖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液；（3）將病毒液與保護(hù)劑混合，得到活疫苗。本發(fā)明方法優(yōu)化了波浪生物反應(yīng)器培養(yǎng)ST細(xì)胞的各工藝參數(shù)，有效提升了ST細(xì)胞的培養(yǎng)效率，最終顯著提高了偽狂犬病活疫苗的生產(chǎn)效能以及免疫保護(hù)效力。免疫保護(hù)效力實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明活疫苗對于豬、牛及綿羊有良好的免疫保護(hù)效果，免疫保護(hù)效力要顯著優(yōu)于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶制備的疫苗。
【專利說明】偽狂犬病活疫苗的制備方法及其產(chǎn)品
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種偽狂犬病活疫苗的制備方法，尤其涉及一種利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)偽狂犬病活疫苗的方法，屬于偽狂犬病活疫苗的生產(chǎn)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]偽狂犬病(pseudorabies, PR)又稱Aujeszky氏病,是由豬皰疫病毒I型所引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽和野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主癥的一種急性傳染病。通常引起妊娠母豬流產(chǎn)、木乃伊胎、死胎和產(chǎn)弱仔；初生仔豬出現(xiàn)腹瀉及神經(jīng)癥狀、感染率和死亡率可達(dá)100%;母豬出現(xiàn)返情屢配不孕；育肥豬感染后不發(fā)病，多呈隱性感染，耐過豬，主要表現(xiàn)生長發(fā)育遲緩，飼料報(bào)酬率降低等，并可長期帶毒、排毒，成為最危險(xiǎn)的傳染源。該病最早發(fā)現(xiàn)于美國，后由匈牙利學(xué)者Aujeszky首次分離到該病毒，故又稱為奧耶斯基病(Aujeszkys disease)。據(jù)報(bào)道,全世界已有50多個(gè)國家和地區(qū)爆發(fā)過該病，對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。本病尚無有效治療藥物，疫苗免疫接種是預(yù)防和控制豬偽狂犬病的根本措施。
[0003]目前，偽狂犬病活疫苗的生產(chǎn)主要是轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，進(jìn)而增殖偽狂犬病毒。但轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞增殖較為緩慢而且生產(chǎn)過程中對細(xì)胞和病毒的培養(yǎng)條件，如pH、溶氧、糖耗等難以監(jiān)控和適時(shí)補(bǔ)給，無法提供最佳的培養(yǎng)條件，造成該方法自動(dòng)化程度低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，并因?yàn)檗D(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的不可控性，導(dǎo)致生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性不夠，批間差較大。另外提高病毒毒價(jià)，保證良好的臨床效果是解決偽狂犬病毒活疫苗產(chǎn)業(yè)化的當(dāng)務(wù)之急。而用生物反應(yīng)器替 代轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)疫苗株則克服了上述所述不足，成為最具有前途的偽狂犬病活疫苗生產(chǎn)技術(shù)之一。
[0004]WAVE波浪生物反應(yīng)器是采用拋棄型生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的一種新型反應(yīng)器。其工作方式是，細(xì)胞接種于可拋棄的細(xì)胞培養(yǎng)袋內(nèi)，接種細(xì)胞的培養(yǎng)袋固定在托盤上以一定的方式搖動(dòng)，精密控制的搖動(dòng)保證了培養(yǎng)體系的有效混合和傳氧效率。本發(fā)明采用WAVE波浪生物反應(yīng)器，主要優(yōu)點(diǎn)有I)免除生物反應(yīng)器清洗、消毒及其相關(guān)認(rèn)證。2)封閉培養(yǎng)系統(tǒng)，無需固定的管道，簡化細(xì)胞培養(yǎng)廠房，縮短反應(yīng)器安裝和生產(chǎn)產(chǎn)品轉(zhuǎn)換時(shí)間。3)細(xì)胞培養(yǎng)袋Cellbag放在特殊設(shè)計(jì)的搖動(dòng)平臺(tái)上，平臺(tái)的搖動(dòng)在培養(yǎng)液中產(chǎn)生波浪提供培養(yǎng)物混合和氧氣傳遞，產(chǎn)生一個(gè)適于細(xì)胞生長的完美環(huán)境。
[0005]采用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)偽狂犬病活疫苗時(shí)，所加入微載體的含量、細(xì)胞接種密度、細(xì)胞培養(yǎng)袋的搖動(dòng)參數(shù)等生產(chǎn)條件對于偽狂犬病活疫苗的生產(chǎn)效率以及免疫保護(hù)效力的高低等有非常顯著的影響，在生產(chǎn)實(shí)踐中需要對這些條件進(jìn)行優(yōu)化才能有效提高偽狂犬病活疫苗的生產(chǎn)效率以及免疫保護(hù)效力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)偽狂犬病活疫苗的方法，該方法對微載體的含量、細(xì)胞接種密度、細(xì)胞培養(yǎng)條件等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，有效提升了偽狂犬病活疫苗的生產(chǎn)效率以及免疫保護(hù)效力。
[0007]本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0008]一種利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)偽狂犬病活疫苗的方法，包括:(I)細(xì)胞的培養(yǎng):將ST細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋中的微載體上，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)細(xì)胞；(2)病毒液的增殖:沉降微載體，洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞，接種偽狂犬病毒毒種，加入病毒增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液；(3)將病毒液與適宜穩(wěn)定劑混合均勻，經(jīng)冷凍真空干燥得到偽狂犬病活疫苗；其中，所述的搖動(dòng)條件為擺動(dòng)角度6°、擺動(dòng)速度為14rpm。
[0009]采用WAVE波浪生物反應(yīng)器培養(yǎng)ST細(xì)胞時(shí)，搖動(dòng)培養(yǎng)參數(shù)對于細(xì)胞在微載體上的吸附以及細(xì)胞生長有非常顯著的影響，為了篩選到最適宜的搖動(dòng)培養(yǎng)參數(shù)以最大限度的促進(jìn)細(xì)胞生長，本發(fā)明對搖動(dòng)培養(yǎng)時(shí)的擺動(dòng)角度以及擺動(dòng)速度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化考察，觀察不同的培養(yǎng)條件對于細(xì)胞的生長所帶來的影響。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在對于細(xì)胞培養(yǎng)袋中的細(xì)胞進(jìn)行搖動(dòng)培養(yǎng)時(shí)，擺動(dòng)角度以及擺動(dòng)速度對于細(xì)胞的生長有非常顯著的影響；本發(fā)明最終發(fā)現(xiàn)，當(dāng)搖動(dòng)培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)條件為擺動(dòng)角度6°、擺動(dòng)速度為14rpm能夠最為顯著的促進(jìn)細(xì)胞的生長，該培養(yǎng)條件下的細(xì)胞生長速度顯著高于其它的培養(yǎng)條件。
[0010]此外，細(xì)胞接種密度與微載體含量對細(xì)胞生長的影響也密切相關(guān)，其中重要的標(biāo)志是接種時(shí)要保證合適的細(xì)胞密度與載體的比例關(guān)系。在每克微載體接種相同細(xì)胞數(shù)的前提下，本發(fā)明考察微載體(Cytodexl)含量為 lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L時(shí)細(xì)胞生長情況，用來確定合適的載體用量。為了生產(chǎn)高滴度的病毒，需要細(xì)胞密度較高，同時(shí)，為了較快和高效的培養(yǎng)細(xì)胞，又要求細(xì)胞的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)較高。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著微載體含量的增加，ST細(xì)胞密度會(huì)有所增加，但ST細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)卻有所降低。微載體含量為2g/L時(shí)，ST細(xì)胞生長較快，培養(yǎng)時(shí)間為5天時(shí)，ST細(xì)胞密度達(dá)到了 1.86 X IO7g/L，非常顯著的高于其它的微載體的細(xì)胞密度；此外，當(dāng)微載體含量高于2g/L時(shí)，ST細(xì)胞生長的增加速度不顯著。因此，本發(fā)明在細(xì)胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)ST細(xì)胞時(shí)，所加入的微載體的含量優(yōu)選為2g/L。因此綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)微載體含量優(yōu)選為2g/L。
[0011]在確定了微載體最適宜用量的基礎(chǔ)上，本發(fā)明為2g/L的微載體用量，分別以不同的接種密度接種細(xì)胞，每天取樣分析，以篩選最適宜的細(xì)胞接種密度。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)微載體含量相等，不同的接種密度對ST細(xì)胞生長影響較大。不同的接種密度對ST細(xì)胞生長影響較大。以5 X 104、I X IO5個(gè)/mL接種時(shí)，接種密度低接種后5天仍在緩慢生長，沒有進(jìn)入穩(wěn)定生長期的明顯標(biāo)志；以2 X 105、3 X 105、4 X 105、5 X 105、6 X IO5個(gè)/mL接種時(shí)接種密度高，ST細(xì)胞在接種后第2天進(jìn)入穩(wěn)定生長期；從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，隨著細(xì)胞接種密度的增高，ST細(xì)胞生長速度的增加并不與細(xì)胞接種密度增加保持同步；當(dāng)ST細(xì)胞接種密度為2 X IO5個(gè)/mL時(shí)，ST細(xì)胞在第4天和第5天后的生長速度要明顯高于其它接種密度的生長速度，因此，本發(fā)明優(yōu)選采用2 X IO5個(gè)/mL的接種量接種ST細(xì)胞。
[0012]本發(fā)明方法優(yōu)化了波浪生物反應(yīng)器培養(yǎng)ST細(xì)胞的各工藝參數(shù)，有效提升了 ST細(xì)胞的培養(yǎng)效率，最終顯著提高了偽狂犬病活疫苗的生產(chǎn)效能以及免疫保護(hù)效力；免疫保護(hù)效力實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明方法所制備的偽狂犬病活疫苗對于家畜有確切的免疫保護(hù)效力；本發(fā)明方法可用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)偽狂犬病活疫苗。
【具體實(shí)施方式】[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施方案來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0014]生物材料及儀器
[0015]1.1、生物反應(yīng)器:美國Wave Biotech公司W(wǎng)AVE波浪生物反應(yīng)器。
[0016]1.2、微載體=Cytodex-1 (購自美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部)。
[0017]1.3、偽狂犬病毒(Bartha_K61株)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；通過其它途徑獲得偽狂犬病毒株也可適用于本發(fā)明；例如，從中國典型培養(yǎng)物保藏中心分發(fā)獲得的保藏編號為CCTCC N0.V201114的偽狂犬病毒株也能適用于本發(fā)明。
[0018]實(shí)施例1利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)偽狂犬病活疫苗
[0019]1.細(xì)胞的培養(yǎng)
[0020]1.1微載體處理:按培養(yǎng)的終體積稱取微載體(Cytodex-1)適量，用無Ca2+、Mg2+-PBS室溫浸泡過夜，棄去PBS，再用無Ca2+、Mg2+-PBS洗一次，棄去，最后加入無Ca2+、Mg2+-PBS 高壓滅菌(115°C、lOps1、15min)。
[0021]1.2細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng):用方瓶培養(yǎng)從液氮罐中復(fù)蘇的ST細(xì)胞，培養(yǎng)條件包括:pH值
7.2、溫度37°C;培養(yǎng)48-72h，形成良好細(xì)胞單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)；該過程中使用的培養(yǎng)基為MEM，血清為胎牛血清，使用量為8%。
[0022]1.3微載體培養(yǎng):用EDTA-胰酶細(xì)胞消化液制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按2 X IO5個(gè)/mL的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)的方法參數(shù)為:微載體濃度為2g/L、DO值50%、溫度37°C、擺動(dòng)角度6°、擺動(dòng)速度14次/min。在培養(yǎng)過程中監(jiān)控細(xì)胞培養(yǎng)袋中葡萄糖的消耗以及乳酸和氨的產(chǎn)生，同時(shí)在不同的節(jié)點(diǎn)上細(xì)胞計(jì)數(shù)(Cytodexl上的細(xì)胞計(jì)數(shù)先用PBS漂洗2次，經(jīng)0.1%結(jié)晶紫的檸檬酸溶液染色，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞核)，當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到I X 106-2X IO6個(gè)/mL時(shí)開始灌注，依據(jù)細(xì)胞的密度、葡萄糖的消耗以每天灌注0.7-2個(gè)工作體積的速度，以維持細(xì)胞的生成。
[0023]2.病毒液的增殖
[0024]當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到達(dá)第四天時(shí)沉降微載體，排出細(xì)胞培養(yǎng)袋中液體，加入PBS洗滌細(xì)胞，重復(fù)洗滌3次，加入病毒維持液并接種偽狂犬病病毒，其中病毒接種劑量為3%、病毒增值的培養(yǎng)基為含1%血清的MEM，pH值7.4，溫度35°C。接毒后每隔一定時(shí)間取生物反應(yīng)器中的微載體，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，并檢測樣品TCID50，當(dāng)微載體上的細(xì)胞大部分脫落，停止培養(yǎng)，收獲病毒液，于-20°C凍融兩次，得到偽狂犬病毒液。
[0025]2.1病毒含量的測定
[0026]利用TCID50方法進(jìn)行病毒含量的測定。病毒TCID50測定時(shí)，以MEM培養(yǎng)液將培養(yǎng)得到的偽狂犬病毒液作連續(xù)10倍稀釋，即10' 10_2……10_8，每個(gè)稀釋度取100 μ L加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中，隨后加入經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化分散的ST細(xì)胞懸液，每孔100 μ L(細(xì)胞含量以3 X 105/mL左右為宜)，每個(gè)稀釋度作8個(gè)重復(fù)，并設(shè)正常細(xì)胞培養(yǎng)對照，置5%C02培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變和對照，共觀察2~4日，并記錄細(xì)胞病變的孔數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。同時(shí)以相同的方法對用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的偽狂犬病毒液進(jìn)行TCID50測定。以此， 作為對照組。[0027]實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1,由結(jié)果表明，利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)的偽狂犬病毒液病毒含量不小于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的偽狂犬病毒液病毒含量。由此可見利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)的病毒要明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的病毒。
[0028]表1偽狂犬病毒含量
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一種偽狂犬病活疫苗的制備方法，包括:(1)細(xì)胞的培養(yǎng):將細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋的微載體上，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)細(xì)胞；(2)病毒液的增殖:沉降微載體，洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞；接種偽狂犬病毒毒種，加入病毒增殖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液；(3)將病毒液與保護(hù)劑混合，得到偽狂犬病活疫苗；其特征在于:步驟(1)中所述的搖動(dòng)參數(shù)為擺動(dòng)角度6°、擺動(dòng)速度為14rpm。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的細(xì)胞是ST細(xì)胞。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的微載體是Cytodex-1。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:微載體在細(xì)胞培養(yǎng)袋中的含量是2g/L。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:將細(xì)胞按照2X IO5個(gè)/mL的接種量接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋的微載體上。
6.由權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述方法制備得到的偽狂犬病活疫苗。
7.權(quán)利要求7所述的偽狂犬病活疫苗在制備預(yù)防或治療由偽狂犬病毒所導(dǎo)致疾病藥物中的用途。
8.一種預(yù)防或治療由偽狂犬病毒所導(dǎo)致疾病的藥物組合物，其特征在于:含有預(yù)防或治療上有效量的權(quán)利要求6所述的偽狂犬病活疫苗。
【文檔編號】A61P31/22GK103877573SQ201410109323
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】馮建民, 王石, 王國輝, 何玉友, 劉斌, 楊鍵, 李長艷, 廉維, 楊澤彬, 馮會(huì), 柳志光, 白楊, 吳艷麗, 田麗華 申請人:吉林正業(yè)生物制品股份有限公司