一種乳桿菌三聯(lián)活菌制劑及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種植物乳桿菌，其分類命名為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum），該菌株已于2014年2月24號(hào)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.8848。本發(fā)明還公開(kāi)了一種乳桿菌三聯(lián)活菌制劑，該制劑是由益生菌混合物和保護(hù)劑組成，所述益生菌混合物為植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌冷凍干燥活菌粉組成。本發(fā)明還公開(kāi)了制備乳桿菌三聯(lián)活菌制劑的方法。本發(fā)明在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上篩選出黏附定植力最強(qiáng)的植物乳桿菌為主要益生菌，與嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌以及保護(hù)劑混合，制成活菌凍干菌粉，成為保健作用更強(qiáng)，并可常溫長(zhǎng)期保存的復(fù)合益生菌制劑。
【專利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物產(chǎn)品，具體涉及一種乳桿菌三聯(lián)活菌制劑及制備方法。 一種乳桿菌三聯(lián)活菌制劑及制備方法

【背景技術(shù)】
[0002] 乳桿菌是人體腸道內(nèi)的重要的生理性有益菌，它具有維持胃腸道正常的微生態(tài)平 衡，抑制病原菌的入侵和感染，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，預(yù)防和抑制腫瘤發(fā)生，降低膽固醇以及抗 氧化等作用。早在1 9〇5年，俄國(guó)微生物學(xué)家梅切尼科夫就發(fā)現(xiàn)，高加索地區(qū)居民長(zhǎng)壽者較 多，其原因是食用了大量含乳酸菌的酸奶，并指出含有保加利亞乳桿菌的酸奶能使人長(zhǎng)壽。 此后，大量的乳桿菌菌株被分離篩選出來(lái)，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和保健食品中。嗜酸乳桿菌 NCFM (Zacio知s NCFM)是一株已被廣泛應(yīng)用的商業(yè)化菌株，它最初是由 美國(guó)北卡羅納州立大學(xué)的Μ. Speck、S. Cilliland和Τ· KlaenhammerTO年代從人體中分離 得到的，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于液態(tài)奶、酸奶、固態(tài)液化食品、嬰幼兒食品和果汁。研究資料表明， 嗜酸乳桿菌NCFM產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)金黃色葡萄球菌、傷寒沙門(mén)氏菌、大腸桿菌以及梭菌等具 有較強(qiáng)的抑制能力，在體外對(duì)腸上皮樣細(xì)胞Caco-2、HT-29也具有較強(qiáng)的粘附性能，能夠緩 解乳糖不耐癥和調(diào)節(jié)腸道菌群。鼠李糖乳桿菌LGG (ATCC53103) aaciMaciBi/rfe應(yīng) LGG)是由美國(guó)的Sherwood Gorbach和Barry Goldin兩位研究人員于1980年從健康人體 的腸道中分離出來(lái)的。LGG可有效的降低革蘭氏陰性菌產(chǎn)生內(nèi)毒素的水平，抑制腸素性大腸 桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的粘附和侵襲，增強(qiáng)IgA對(duì)食物抗原的抵抗力，維持 腸粘膜的完整性和功能；鼠李糖乳桿菌LGG對(duì)抗生素治療所引起的腹瀉、腹痛有明顯的治 療效果，且鼠李糖乳桿糖LGG在任何研究情況下都無(wú)不良反應(yīng)。Oksanen等[Oksanen PJ， Salminen S,Saxelin M,Hamalainen Ρ,Ihantola-Vormisto A,Muurasniemi-Isoviita L, Nikkari S, Oksanen T, Porsti I, Salminen E. Prevention of travellers' diarrhoea by Lactobacillus GG. Ann Med. 1990,22:53-56.] 在土耳其對(duì)來(lái)自芬蘭的旅行者進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)43. 8%旅行者患了腹瀉，若一天兩次 口服鼠李糖乳桿菌LGG后，治愈率可達(dá)98%以上；Hilton等【Hilton E，Kolakowski P， Singer C, Smith M. Efficacy of Lactobacillus GG as a Diarrheal Preventive in Travelers. J Travel Med. 1997，4:41-43】對(duì)美國(guó)去亞洲、東非、南美等地的旅行者腹瀉 發(fā)病情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)每人口服1粒鼠李糖乳桿菌LGG膠囊可預(yù)防旅行腹瀉的發(fā)生，且 發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌LGG對(duì)以前從未發(fā)生旅行者腹瀉的人群具備更為有效的治療效果。總 之，鼠李糖乳桿菌是一種安全的，且具有顯著調(diào)節(jié)腸道菌群、改善腸道功能、預(yù)防和治療腹 瀉、提高機(jī)體免疫力等功能的菌株，目前已在全球30多個(gè)國(guó)家廣泛應(yīng)用。另外，還有植物桿 菌 2"V 299V)、干酪乳桿菌Z. casei Shirota、嗜酸乳桿菌 LB LB)以及大腸奸菌 Nisslel917 Nissle 1917)等菌株也在大量應(yīng)用，且在臨床治療中具有較好的效果。
[0003] 乳酸菌進(jìn)入腸道后，首先和腸黏膜表面相接觸，通過(guò)識(shí)別特異性的受體并與之結(jié) 合，黏附定植于腸黏膜表面。這種黏附一方面通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的占位定植形成生物屏障，以阻止 病原菌與腸黏膜受體結(jié)合；另一方面也延長(zhǎng)了乳酸菌影響宿主腸道免疫系統(tǒng)和微生態(tài)區(qū)系 的時(shí)間，以維持腸道的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。因此，乳酸菌對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞的黏附和定植是其發(fā)揮生理 作用的前提和基礎(chǔ)。
[0004]雖然目前在臨床和保健食品中已大量應(yīng)用了一些乳酸菌菌株，但由于乳酸菌的益 生性能具有菌株特異性，各分離菌株在黏附性能方面存在很大的差異。另外分離源和宿主 也會(huì)影響菌株的黏附性能，從而使得一些產(chǎn)品中的菌株不能長(zhǎng)期定植于腸道發(fā)揮其應(yīng)有的 益生作用，極大地影響了此類產(chǎn)品的作用效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的：本發(fā)明的第一個(gè)目的提供了一種植物乳桿菌。本發(fā)明的第二個(gè)目的 是提供了一種乳桿菌三聯(lián)活菌制劑。本發(fā)明的第三個(gè)目的提供了上述乳桿菌三聯(lián)活菌制劑 的制備方法。
[0006] 技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種植物乳桿菌，其 分類命名為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum),該菌株已于2014年2月24號(hào)保藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 8848。
[0007] -種乳桿菌三聯(lián)活菌制劑，該制劑是由益生菌混合物和保護(hù)劑組成，所述益生菌 混合物為植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌冷凍干燥活菌粉組成。
[000S]按重量份數(shù)，上述植物乳桿菌5?15份、嗜酸乳桿菌3?5份、鼠李糖乳桿菌3?5份、 保護(hù)劑1(Γ20份。
[0009] 其中，上述益生菌混合物組成比為植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌分別 為 5 :3 :3。
[0010] 其中，上述保護(hù)劑為15-20%的脫脂奶粉、5-10%的植物淀粉和5-20%的β -環(huán)糊 精。
[0011] -種制備乳桿菌三聯(lián)活菌制劑的方法，該方法包括下列步驟：將MRS液體培養(yǎng)基 置于高壓鍋內(nèi)，121°C滅菌2(Γ25分鐘，冷卻至30?37°C后，在無(wú)菌條件下分別接10%-15%的 植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌以及鼠李糖乳桿菌，然后置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h，獲 得細(xì)菌培養(yǎng)物，將菌液以250(T3000rpm/min離心15~20min，得濕菌泥，加入等量保護(hù)劑后， 冷凍干燥獲得凍干菌粉，然后將三種菌的凍千粉混合后，加入保護(hù)劑，過(guò)40目篩混合后灌 裝膠囊或按常規(guī)方法制成顆粒劑。 t〇〇12] 本發(fā)明的菌種來(lái)源及生物學(xué)特性如下： 1.菌種來(lái)源 1)植物乳桿菌L2,由本室分離自健康人的腸道。腸鏡檢查時(shí)采用活檢鉗夾取腸黏膜組 織，立即置入無(wú)菌的勻漿器內(nèi)研磨。待組織塊完全勻漿后，加入無(wú)菌PBS進(jìn)行系列稀釋，最 后取相應(yīng)稀釋樣品涂布于LAMVAB選擇性培養(yǎng)基上，分別置于37°C的生化培養(yǎng)箱和厭氧培 養(yǎng)箱內(nèi)孵育24lT48h。待平板長(zhǎng)出菌落后，挑取黃綠色平板中呈淺綠色或淺白色光滑的中 小菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，確定為革蘭氏陽(yáng)性桿菌的菌落進(jìn)行反復(fù)劃線分離，直至菌株形 態(tài)均一。篩選的菌株L2在LAMVAB平板上呈現(xiàn)出淺綠色或綠色的光滑菌落，直徑約Γ2πιπι, 邊緣整齊，呈白色環(huán)狀，在MRS固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出無(wú)色或白色的光滑菌落。革蘭氏染色陽(yáng) 性，無(wú)芽孢，菌體呈桿狀或短桿狀，長(zhǎng)約1. 5飛μ m。在有氧和厭氧條件下均可生長(zhǎng)，且在厭氧 狀態(tài)下生長(zhǎng)良好，產(chǎn)酸，不還原硝酸鹽，不液化明膠，不產(chǎn)生H2S，吲哚試驗(yàn)陰性，觸酶和氧化 酶試驗(yàn)均為陰性，聯(lián)苯胺反應(yīng)陰性，最適生長(zhǎng)溫度為35°C、0°C。采用API 50 CHL試劑盒的 不同種類的碳水化合物進(jìn)行生化反應(yīng)，生化結(jié)果鑒定為植物乳桿菌(見(jiàn)表1)。以菌株L2的 總DNA為模板，用引物10F和1500R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一段長(zhǎng)約1. 4kb的PCR產(chǎn)物（圖 1)，菌株 L2 的 1仍 rRNA 基因序列 GenBank 登錄號(hào)為（Accession number: ER)88327)。將 菌株L2的16S rDNA序列與GenBank中的序列進(jìn)行比較，表明與其同源性最高的模式菌株 相似性最局的是植物乳桿菌(Zactofecii/iAs 所以該菌株命名為植物乳桿菌 L2。該菌株已于2014年2月24號(hào)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101，保 藏編號(hào)為 CGMCCNo. 8848。
[0013] 表1 L2對(duì)碳水化合物代謝的分析

【權(quán)利要求】
1. 一種植物乳桿菌，其特征在于，其分類命名為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum),該菌株已于2014年2月24號(hào)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 8848。
2. -種乳桿菌三聯(lián)活菌制劑，該制劑是由益生菌混合物和保護(hù)劑組成，其特征在于，所 述益生菌混合物為權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌冷凍干燥活 菌粉組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的乳桿菌三聯(lián)活菌制劑，其特征在于，按重量份數(shù)，所述植物乳 桿菌5?15份、嗜酸乳桿菌3飛份、鼠李糖乳桿菌3?5份、保護(hù)劑1(Γ20份。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的乳桿菌三聯(lián)活菌制劑，其特征在于，所述益生菌混合物組成 比為植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌分別為5 :3 :3。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的乳桿菌三聯(lián)活菌制劑，其特征在于，所述保護(hù)劑為15-20%的 脫脂奶粉、5-10%的植物淀粉和5-20%的β -環(huán)糊精。
6. -種制備權(quán)利要求2的乳桿菌三聯(lián)活菌制劑的方法，其特征在于，該方法包括下列 步驟：將MRS液體培養(yǎng)基置于高壓鍋內(nèi)，121°C滅菌20?25分鐘，冷卻至30~37°C后，在無(wú)菌 條件下分別接1〇%_15%的植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌以及鼠李糖乳桿菌，然后置于37°C恒溫 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h，獲得細(xì)菌培養(yǎng)物，將菌液以2500?3000 rpm/min離心15~20min，得濕 菌泥，加入等量保護(hù)劑后，冷凍干燥獲得凍干菌粉，然后將三種菌的凍千粉混合后，加入保 護(hù)劑，過(guò)40目篩混合后灌裝膠囊或按常規(guī)方法制成顆粒劑。
【文檔編號(hào)】A61K35/74GK104189015SQ201410110029
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】王斌, 曹振芳 申請(qǐng)人:南京久騰醫(yī)藥科技有限公司