調(diào)節(jié)肌細(xì)胞增殖和分化的microrna的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)肌細(xì)胞基因表達(dá)、分化和/或增殖的方法，特別涉及使用microRNAs(miRNA)調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，及其在制備藥物中的用途。
【專利說明】調(diào)節(jié)肌細(xì)胞增殖和分化的MICRORNA
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日2006年12月12日的申請(qǐng)?zhí)?00680052681.X標(biāo)題為“調(diào)節(jié)肌細(xì)胞增殖和分化的MICR0RNA”的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)
[0002]相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0003]本文公開的主題要求2005年12月12日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/749，544的利益，該申請(qǐng)全文并入作參考。
[0004]資金聲明
[0005]本申請(qǐng)由國(guó)立健康研究院的資金R01-HL075251資助，因此，美國(guó)政府在本文公開的主題中有一些權(quán)利。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0006]本發(fā)明一般性涉及調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中基因表達(dá)的方法和組合物。本發(fā)明更特別涉及使用microRNAs (miRNA)調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中基因表達(dá)水平的方法，并涉及包含miRNA的組合物。
[0007]發(fā)明背景
[0008]了解調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的分子機(jī)制是發(fā)育生物學(xué)的核心問題。MicroRNA (miRNA)是近年來揭示的轉(zhuǎn)錄后調(diào)芐基因表達(dá)的大約22類核苷酸調(diào)節(jié)性RNA中的一類U2。越來越多的證據(jù)表明miRNA在多種生物學(xué)進(jìn)程中的關(guān)鍵作用3_8。
[0009]然而，本領(lǐng)域仍長(zhǎng)期且持續(xù)需要鑒別miRNA在生物學(xué)進(jìn)程中的作用。本發(fā)明專注于本領(lǐng)域的這種及其它需要。
[0010]發(fā)明概述
[0011]本發(fā)明概述列出了本發(fā)明的一些實(shí)施方案，以及在許多情況中這些實(shí)施方案的變化和改變。本發(fā)明概述只是例證了多個(gè)不同的實(shí)施方案。同樣只是例證了指定實(shí)施方案的一或多個(gè)特征。這種實(shí)施方案可以典型地具有或不具有所提及的特征；同樣，那些特征可以用于本發(fā)明概述中列出或未列出的本發(fā)明的其它實(shí)施方案。為了避免重復(fù)，本發(fā)明概述未列出或提出這種特征的所有可能的組合。
[0012]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種治療對(duì)象中肌損傷的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給予對(duì)象中的肌損傷部位有效量的miRNA或者編碼miRNA的載體或者miRNA的抑制劑，其中所述miRNA靶向于肌損傷部位的肌細(xì)胞中的基因。在一些實(shí)施方案中，miRNA的抑制劑能與靶miRNA雜交；在一些實(shí)施方案中，所述靶miRNA選自miR-1、miR-133、miR-206、miR-208、miR-22、miR-26、miR-29、miR-30、miR-128、miR-143 和 miR-145組成的組。在一些特殊的實(shí)施方案中，首先將miRNA-133和miRNA-Ι的抑制劑組合給予肌損傷部位，其次將miRNA-Ι和miRNA-133的抑制劑組合給予肌損傷部位，從而治療所述肌損傷。在一些實(shí)施方案中，所述肌損傷是由于機(jī)械性肌組織創(chuàng)傷(mechanical muscletrauma)、肌退行性病變(muscular degenerative disorder)、心肌損傷(cardiac insult)或者這些原因的組合所致。在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物。
[0013]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化、增殖或者這兩者的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將肌細(xì)胞與靶向于所述肌細(xì)胞中基因的可調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化、增殖或這二者的miRNA或者編碼所述miRNA的載體接觸。在一些實(shí)施方案中,所述調(diào)節(jié)是抑制，且在一些實(shí)施方案中，所述miRNA抑制基因的翻譯。
[0014]在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中的基因表達(dá)的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將肌細(xì)胞與靶向于所述肌細(xì)胞中基因的miRNA或者編碼miRNA的載體接觸。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)是抑制，且在一些實(shí)施方案中，所述miRNA抑制所述基因的翻譯。
[0015]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種抑制肌細(xì)胞中的基因表達(dá)的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括用編碼miRNA分子的載體轉(zhuǎn)化所述肌細(xì)胞，其中所述miRNA分子包含與所述基因的17個(gè)-24個(gè)連續(xù)核苷酸的亞序列至少70%相同的核苷酸序列，除外的是所述miRNA包含尿嘧啶代替在所述基因中發(fā)現(xiàn)的任何胸腺嘧啶。在一些實(shí)施方案中，所述miRNA抑制所述基因的翻譯。
[0016]在本發(fā)明揭示的方法的一些實(shí)施方案中，所應(yīng)用的miRNA包含選自由SEQ ID NO:
1-11中任一序列及與SEQ ID NO:1_11至少70%相同的任一核苷酸序列組成的組。在一些實(shí)施方案中，所述 miRNA 選自 miR-1、miR-133、miR-206、miR-208、miR-22、miR-26、miR-29、miR-30、miR-128、miR-143和miR-145組成的組。另外，在一些實(shí)施方案中，所述miRNA靶向于所述基因的3’未翻譯區(qū)域。
[0017]另外，在所述方法的一些實(shí)施方案中，由所述miRNA靶向的基因選自肌細(xì)胞分化基因(例如編碼組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)多肽的基因，或者編碼甲狀腺激素受體蛋白240 (TRAP240)的基因)、肌細(xì)胞增殖基因(例如編碼血清應(yīng)答因子(SRF)多肽的基因)及激素相關(guān)蛋白(例如編碼 甲狀腺激素相關(guān)蛋白的基因I (Thrapl))。
[0018]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了編碼miRNA的載體。在一些實(shí)施方案中，所述載體包含與編碼所述miRNA分子的核酸分子可操縱地連接的啟動(dòng)子，及包含轉(zhuǎn)錄終止序列。另外，在一些實(shí)施方案中，所述載體摻入一個(gè)試劑盒中，該試劑盒進(jìn)一步包含將所述載體導(dǎo)入肌細(xì)胞中的至少一種試劑。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含將所述載體導(dǎo)入肌細(xì)胞中的說明書。
[0019]因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用miRNA介導(dǎo)的方法操縱肌細(xì)胞中基因表達(dá)的方法。通過本發(fā)明可以全部或部分實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。
[0020]本發(fā)明的一個(gè)目的在上文已經(jīng)闡述，本領(lǐng)域技術(shù)人員在研究了如下發(fā)明描述和非限制性實(shí)施例之后將顯而易見本發(fā)明的其它目的。
[0021]附圖簡(jiǎn)述
[0022]圖1a-1e描述了 miR_l和miR-133在發(fā)育期間的心肌和骨骼肌中的表達(dá)數(shù)據(jù)。
[0023]圖1a示出了在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)或者在分化培養(yǎng)基(DM)中分別培養(yǎng)0、1、3和5天的C2C12肌細(xì)胞的miRNA陣列表達(dá)數(shù)據(jù)。歸一化的log(以2為底)數(shù)據(jù)由基因分級(jí)聚類，并繪圖為熱圖(heat map)。信號(hào)范圍為_4倍至+4倍。黃色表示相對(duì)于中值高水平表達(dá)，藍(lán)色表示相對(duì)于中值低水平表達(dá)，并示出了在分化培養(yǎng)基中被上調(diào)的唯一 miRNA節(jié)。
[0024]圖1b描述了 miR-Ι和miR-133表達(dá)的Northern印跡分析,使用分離自在GM或DM中分別培養(yǎng)0、1、3和5天的C2C12肌細(xì)胞的總RNA。tRNA用作加樣對(duì)照。
[0025]圖1c描述了 miR-Ι和miR-133在成年小鼠中表達(dá)的Northern印跡分析。
[0026]圖1d 描述了 miR-Ι 和 miR-133 在胚胎期第 13.5 (E13.5)和 16.5 (E16.5)天的小鼠組織中表達(dá)的Northern印跡分析。
[0027]圖1e描述了 miR-Ι和miR-133在新生小鼠組織中表達(dá)的Northern印跡分析。將來自成年小鼠心肌和骨骼肌的相同量的總RNA加樣于印跡中，以與胚胎和新生兒RNA進(jìn)行對(duì)比(圖1d和Ie)。
[0028]圖2a_2j描述了顯示出miR_l和miR-133調(diào)節(jié)肌細(xì)胞增殖和分化的數(shù)據(jù)。將在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)中培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞用miR-1、miR-133的雙鏈miRNA雙鏈體電穿孔，GFP作為對(duì)照。
[0029]圖2a_2e示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在GM中連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，然后移至分化培養(yǎng)基(DM)中培養(yǎng)12小時(shí)或36小時(shí)之后分別對(duì)肌形成蛋白(myogenin)(圖2a)或MHC (圖2b)免疫染色。將在GM中培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞用miR-1、miR-133 (或其指定突變體)或者作為對(duì)照的miR-208和GFP的雙鏈miRNA雙鏈體電穿孔，在培養(yǎng)24小時(shí)之后使用指定抗體進(jìn)行Western印跡(圖2c)，將細(xì)胞移至DM中培養(yǎng)24小時(shí)，對(duì)指定基因進(jìn)行RT-PCR(圖2d);或者將細(xì)胞移至DM中培養(yǎng)24小時(shí)，使用指定抗體進(jìn)行Western印跡(圖2e)。
[0030]圖2f_2h示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中將在GM中培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞用針對(duì)miR-Ι、miR-133或 者作為對(duì)照的miR-208和GFP的2’_0_甲基反義寡核苷酸抑制劑電穿孔。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在GM中培養(yǎng)24小時(shí)，然后移至DM中進(jìn)行如下步驟:12小時(shí)后用磷酸-組蛋白H3免疫染色(圖2f) ；24小時(shí)之后對(duì)指定基因進(jìn)行RT-PCR(圖2g);或者24小時(shí)之后用指定抗體進(jìn)行Western印跡(圖2h)。
[0031]圖2i和2j示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中將在GM中培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞用指定的miRNA雙鏈體或者2’ -O-甲基反義寡核苷酸抑制劑電穿孔。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在GM中培養(yǎng)24小時(shí)，然后移至DM中培養(yǎng)12小時(shí)后用肌形成蛋白(圖2i)或者磷酸-組蛋白H3(圖2j)免疫染色。計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色的細(xì)胞，并將數(shù)據(jù)以相對(duì)于GFP對(duì)照組的表達(dá)水平(100% )表示。
[0032]圖3a-3k描述了 miR_l和miR-133在體內(nèi)控制心肌和骨骼肌發(fā)育的數(shù)據(jù)。
[0033]圖3a_3h示出得自Xenopus胚胎實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。Xenopus胚胎得自未注射的(圖3a和3b)、注射對(duì)照GFP RNA的(圖3c和3d)、注射miR-Ι的(圖3e和3f)或者注射miR-133的(圖3g和3h)抗原肌球蛋白染色的胚胎，并示出在亮視野(圖3a、3c、3e和3g)或者熒光(圖3b、3d、3f和3h)下的第32階段。注意心肌組織無染色(圖3b和3d，H箭頭)及節(jié)段的體節(jié)破壞(圖3f和3h，S箭頭)。
[0034]圖3i_3k示出Xenopus胚胎的橫切面。Xenopus胚胎的橫切面相應(yīng)于第32階段胚胎的心臟的位置，所述胚胎為未注射的(圖3i)、注射miR-Ι的(圖3j)或者注射miR-133的(圖3k)胚胎，并用抗原肌球蛋白染色以觀測(cè)體節(jié)(S箭頭)和心肌組織(H箭頭)并用抗磷酸-組蛋白H3(紅色)染色以觀測(cè)S期細(xì)胞。每組注射單獨(dú)進(jìn)行至少兩次，在至少90%的最少50個(gè)胚胎中通過全標(biāo)本包埋免疫染色評(píng)分觀測(cè)表型。
[0035]圖4a_4i示出骨骼肌中miR-Ι和miR-133靶基因的鑒別。
[0036]圖4a示出miR-133和miR-Ι對(duì)SRF和HDAC43’ UTR的抑制。將含有來自小鼠SRF3，UTR(SRF-3’ -UTR)的 miR-133 互補(bǔ)位點(diǎn)、小鼠 HDAC43，UTR(HDAC4_3’ -UTR)的 miR-1互補(bǔ)位點(diǎn)或者miR-133 (miR-133-luc)或miR-1 (miR-1-luc)的完全反義序列的螢光素酶報(bào)道基因與指定的miRNA表達(dá)載體或者其突變體共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后確定螢光素酶活性。數(shù)據(jù)以來自一式兩份進(jìn)行的至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(*P < 0.05)。
[0037]圖4b 示出轉(zhuǎn)染進(jìn) C2C12 肌細(xì)胞中的 SRF-3’ -UTR、HDAC4-3’ -UTR 和 MCK-1uc 螢光素酶報(bào)道基因的結(jié)果。細(xì)胞在GM中培養(yǎng)24小時(shí)，或者移至DM中培養(yǎng)I天(DMl)或3天(DM3)，之后確定螢光素酶活性。
[0038]圖4c_4e示出在GM中培養(yǎng)的并且用指定的雙鏈miRNA雙鏈體(或其突變體)或者作為對(duì)照的miR-208和GFP電穿孔的C2C12肌細(xì)胞的結(jié)果數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在GM中培養(yǎng)24小時(shí)，之后進(jìn)行如下步驟:使用抗-SRF和抗-HDAC4抗體進(jìn)行Western印跡(圖4c);將細(xì)胞移至DM中培養(yǎng)24小時(shí)并對(duì)指定基因進(jìn)行RT-PCR(圖4d);將細(xì)胞移至DM中培養(yǎng)24小時(shí)并使用指定抗體進(jìn)行Western印跡。將在GM中培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞用指定的2’ -O-甲基反義寡核苷酸抑制劑電穿孔(圖4e)。
[0039]圖4f和4g示出將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在GM中培養(yǎng)24小時(shí)，然后移至DM中培養(yǎng)24小時(shí)，之后針對(duì)指定基因進(jìn)行RT_PCR(圖4f)及使用指定抗體進(jìn)行Western印跡的結(jié)果(圖4g)。
[0040]圖4h示出在GM中培養(yǎng)且用指定的雙鏈miRNA雙鏈體或者/和指定的SRF或HDAC4的表達(dá)質(zhì)粒電穿孔的C2C12肌細(xì)胞的結(jié)果。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在GM中培養(yǎng)24小時(shí)。在移至DM中之后使用指定抗體進(jìn)行Western印跡。
[0041]圖4i示出在GM或DM中培養(yǎng)0、1、3或5天的C2C12肌細(xì)胞的結(jié)果。使用指定抗體進(jìn)行Western印跡。
[0042]圖5示出miR-Ι和miR-133介導(dǎo)的調(diào)節(jié)骨骼肌增殖和分化的模型。 [0043]圖6示出在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)或分化培養(yǎng)基(DM)中分別培養(yǎng)O、1、3和5天的C2C12肌細(xì)胞的miRNA陣列表達(dá)數(shù)據(jù)的分析資料。歸一化的log(以2為底)數(shù)據(jù)是基因分級(jí)聚類數(shù)據(jù)，并且繪制為熱圖。信號(hào)范圍是從-4倍至+4倍。淡陰影表示相對(duì)于中值的高水平表達(dá)，濃陰影表示相對(duì)于中值的低水平表達(dá)。
[0044]圖7a_7d示出miR-1、miR-133和骨骼肌分化標(biāo)記基因在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)。
[0045]圖7a和7b不出對(duì)miR-Ι (圖7a)和miR-133 (圖7b)的表達(dá)進(jìn)行的Northern印跡分析，使用分離自在GM或者在分化培養(yǎng)基(DM)中分別培養(yǎng)0、1、3和5天的C2C12肌細(xì)胞的總RNA進(jìn)行所述分析。成熟的miRNA及其前體(Pre)被指明。tRNA用作加樣對(duì)照。
[0046]圖7c示出骨骼肌分化標(biāo)記基因的半定量RT-PCR分析。GAPDH用作等量加樣的對(duì)照。
[0047]圖7d示出骨骼肌分化標(biāo)記基因的表達(dá)。將C2C12肌細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)或者在分化培養(yǎng)基(DM)中培養(yǎng)O、1、3和5天，使用指定抗體對(duì)細(xì)胞提取物進(jìn)行Western印跡分析。β_微管蛋白用作加樣對(duì)照。
[0048]圖8a_8f示出miR_l和miR-133在成年小鼠及發(fā)育中小鼠的心肌和骨骼肌中的表達(dá)。圖中示出了 miR-Ι (圖8a)和miR-133 (圖8d)在成年小鼠組織中表達(dá)的Northern印跡分析。圖中示出了 miR-Ι (圖8b)和miR-133 (圖8e)在胚胎第13.5天(E13.5)和16.5天(E16.5)小鼠組織中表達(dá)的Northern印跡分析。另外將等量的成熟心肌和骨骼肌的總RNA加樣于所述印跡中以進(jìn)行對(duì)比。圖中示出了 miR-Ι (圖8c)和miR-133 (圖8f)在新生小鼠組織中表達(dá)的Northern印跡分析。另外將等量的成熟心肌和骨骼肌的總RNA加樣于所述印跡中以進(jìn)行對(duì)比。成熟miRNA及其前體(Pre)被指明。tRNA用作加樣對(duì)照。[0049]圖9a_9e示出miR-1和miR-133初級(jí)轉(zhuǎn)錄物在心肌和骨骼肌中的表達(dá)。
[0050]圖9a示出在小鼠染色體2和18上聚集的miR-Ι和miR-133基因。圖中示出了用于圖9b_9e中Northern印跡的探針。
[0051]圖9b-9e示出對(duì)來自染色體2(圖9d和9e)和染色體18(圖9b和9c)的miR-1 (圖9c和9e)及miR-133 (圖9b和9d)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)進(jìn)行的Northern印跡分析。使用來自指定成年小鼠組織的20 μ g總RNA。
[0052]圖1Oa-1Og示出miR-Ι和miR-133增強(qiáng)子可以指導(dǎo)心肌和骨骼肌中報(bào)道基因表達(dá)。
[0053]圖1Oa示出與dsRed連接的小鼠miR-Ι和miR-133基因組序列的轉(zhuǎn)基因的XenopusIaevis的數(shù)據(jù),顯示第28階段的體節(jié)(S,箭頭)表達(dá)。
[0054]圖1Ob在明視野下第46階段的具有miR-Ι和miR-133轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因(Tg)Xenopus Iaevi (下面的胚胎)及陰性對(duì)照組(非轉(zhuǎn)基因，Ct，上面的胚胎)。
[0055]圖1Oc是圖1Ob中相同胚胎在熒光下的照片。 [0056]圖1Od是圖1Ob中所述轉(zhuǎn)基因胚胎在明視野中的高倍顯微照片，示出所述轉(zhuǎn)基因在心肌(H，箭頭)和鰓弓(BA，箭頭)中的表達(dá)。
[0057]圖1Oe是圖1Ob中所述轉(zhuǎn)基因胚胎在熒光下的高倍顯微照片，示出所述轉(zhuǎn)基因在心肌(H，箭頭)和鰓弓(BA，箭頭)中的表達(dá)。
[0058]圖1Of是第46階段轉(zhuǎn)基因胚胎的高倍顯微照片，示出所述轉(zhuǎn)基因在體節(jié)中的表達(dá)(S,箭頭)。
[0059]圖1Og示出小鼠染色體2的miR-1/133增強(qiáng)子的基因組DNA序列(SEQ ID No:82)。圖中標(biāo)出了推定的MEF2位點(diǎn)和CArG box,并且示出了導(dǎo)入這些位點(diǎn)中的突變。
[0060]圖1la-1lh示出在C2C12細(xì)胞中miR-133對(duì)miR-133感應(yīng)器(sensor)的抑制。將穩(wěn)定表達(dá)miR-133感應(yīng)器的C2C12細(xì)胞用GFP (對(duì)照)、野生型miR-133 (miR-133)、其中“種子”序列已經(jīng)被突變的突變的miR-133 (miR-133mut)的表達(dá)載體或者miR-133表達(dá)載體與2’ -O-甲基反義寡聚體的組合(miR-133+2’ -O-甲基)轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞移至分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)，使用相襯(P/C)(圖lla-lld)或熒光成像獲得圖像，示出dsRed報(bào)道基因的表達(dá)(圖lle-llh)。收獲每種條件下培養(yǎng)的細(xì)胞，使用FACS分析量化dsRed報(bào)道基因的表達(dá)(下組)。線下開放(Open)區(qū)表示細(xì)胞的自身熒光素，線下劃線區(qū)表示ds-Red表達(dá)。
[0061]圖12示出HDAC4和SRF基因的3，UTR中miR-Ι和miR-133靶位點(diǎn)的序列。上面一組是來自保守的脊椎動(dòng)物人(SEQ ID NO:24)、黑猩猩(SEQ ID NO:25)、小鼠(SEQ ID NO:26)、大鼠(SEQ ID NO:27)、狗(SEQ ID NO:28)和雞(SEQ ID NO:29)的 HDAC43，UTR 序列，及其與miR-1 (SEQ IDNO:1)和miR-206 (SEQ IDNO:3)的排列對(duì)比。下面一組是人(SEQ IDNO:30和31)和大鼠(SEQ ID NO:32和33)的SRF3，UTR序列及其與miR-133的排列對(duì)比。保守的核苷酸序列以大寫字體示出。
[0062]圖13描述了 miRNA生物學(xué)發(fā)生的模型。(A) pri_miRNA通過RNA聚合酶II在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄，(B)通過Drosha加工為含有莖-環(huán)的pre-miRNA。(C) Exportin-5識(shí)別Drosha左側(cè)的3’突出端，并將pre-miRNA輸出到細(xì)胞質(zhì)中，在此(D)Dicer裂解莖-環(huán)下面的pre-miRNA，產(chǎn)生~22個(gè)核苷酸的雙鏈體。(E)將單鏈摻入RISC中，其中(F)識(shí)別mRNA的3’非翻譯區(qū)內(nèi)的互補(bǔ)序列并通過翻譯抑制或mRNA裂解而調(diào)芐基因表達(dá)。[0063]圖14a-14c描述了 miR-208基因組。圖14a示出小鼠前體miR-208序列(SEQ IDNO:34)被折疊，使用mFold及成熟miR-208 (SEQ ID NO:4)序列向右折疊。圖14b示出小鼠(SEQ ID NO:35)、大鼠(SEQ ID NO:36)和人(SEQ ID NO:37)前體 miR-208 序列的序列排列對(duì)比。成熟miR-208序列在圖14A的右上方示出。星號(hào)表示完全的序列保守。圖14c示出源自a -MHC內(nèi)含子的miR-208。小鼠miR-208位于a -MHC的內(nèi)含子29內(nèi)。相似地，人miR-208位于a -MHC的內(nèi)含子28內(nèi)。
[0064]圖15a_15c示出證實(shí)miR-208受發(fā)育調(diào)節(jié)的資料。對(duì)不同小鼠組織的總RNA進(jìn)行印跡并且用與miR-208互補(bǔ)的5’-放射性標(biāo)記的寡脫氧核苷酸探查。凝膠上總RNA的等量加樣通過在轉(zhuǎn)移之前進(jìn)行溴化乙啶染色而核實(shí)。
[0065]圖15a示出證實(shí)了 miR-208是心肌特異性的資料。上面的信號(hào)是pre-miR-208轉(zhuǎn)錄物，下面的信號(hào)是成熟的22個(gè)核苷酸形式。
[0066]圖15b示出相對(duì)于miR-208在成熟心肌和骨骼肌中的表達(dá)miR-208在新生小鼠組織中的表達(dá)。
[0067]圖15c示出相對(duì)于miR-208在成熟心肌和骨骼肌中表達(dá)miR-208在E13.5和E16.5小鼠不同組織中的表達(dá)。
[0068]圖16a和16b示出miR-208在心肌細(xì)胞中的異位表達(dá)。圖16a示出使用放射性標(biāo)記的miR-208反義寡核苷酸探查的Ad-GFP或Ad_208感染的心肌細(xì)胞的Northern印跡。圖16b示出MOI為I 和10感染的心肌細(xì)胞外熒光(印ifIuorescent)顯微圖。
[0069]圖17示出本發(fā)明揭示的條件轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的圖示。利用兩個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)基因小鼠品系:一種在a-MHC啟動(dòng)子的控制下表達(dá)tTA-VP16融合蛋白，另一種具有在CMV最小啟動(dòng)子控制下的miR-208轉(zhuǎn)基因。所述CMV最小啟動(dòng)子具有位于立即上游的四環(huán)素操縱子(tetO)的幾個(gè)重復(fù)。交配所述兩個(gè)品系(推測(cè)是孟德爾遺傳模式)，4只小鼠中產(chǎn)生I只雙重轉(zhuǎn)基因小鼠。如果將強(qiáng)力霉素(DOX)給予雙重轉(zhuǎn)基因小鼠，則tTA-VP16蛋白由DOX結(jié)合，且miR-208的轉(zhuǎn)錄被抑制。如果不存在D0X，則tTA蛋白結(jié)合tetO多聯(lián)體，使得VP16結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)miR-208從CMV最小啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄。心肌特異性靶基因表達(dá)可以通過加入或除去DOX而被開啟或關(guān)閉。James et al Am J Phys1l273:Η2105_Η2118在此并入作參考。
[0070]圖18A-18C是示出miR-208靶向Thrapl的圖示和序列排列對(duì)比。具有反義miR-208序列(mir-208感應(yīng)器)或者Hemoglobin-β (Hbb)的3’ UTRs及甲狀腺激素相關(guān)蛋白I(Thrapl)(圖18Α)或者從Thrapl3’UTR中推定的miR-208結(jié)合位點(diǎn)的四個(gè)拷貝(圖18B)的螢光素酶報(bào)道基因附著于所述螢光素酶基因的立即下游，在293T細(xì)胞中與增加量的pCDNA3.lmiR-208共轉(zhuǎn)染。miR-208感應(yīng)器、Thrapl和4x Thrapl報(bào)道基因均以劑量依賴性形式被抑制，而陰性對(duì)照CSNK未明顯改變。圖18C示出成熟miR-208序列(SEQ ID NO:4)結(jié)合推定的人(SEQ ID NO:38)和小鼠(SEQ ID NO:39) Thrapl 基因的 3，UTR 中 miR-208靶位點(diǎn)。注意到這兩個(gè)推定的靶位中完全保守的靶種子區(qū)域(在miR-208的5’末端在第
2-8位核苷酸)。
[0071]圖19示出miR-208調(diào)節(jié)心肌肌球蛋白重鏈同種型轉(zhuǎn)變的模型。甲狀腺激素核受體(TR)結(jié)合a-MHC和β-MHC基因的啟動(dòng)子中甲狀腺受體元件(TREs)序列。所述a-MHC啟動(dòng)子含有由兩個(gè)TR結(jié)合的全長(zhǎng)TRE，而β-MHC在TRE的一半處由單個(gè)TR結(jié)合。TR單體和二聚體均能與TRAP復(fù)合物(一種TR輔因子)形成異源二聚體。甲狀腺激素(T3)結(jié)合TR并抑制β-MHC的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)誘導(dǎo)a-MHC表達(dá)。miR-208與a-MHC蛋白同時(shí)表達(dá)，推測(cè)其調(diào)節(jié)Thrapl(TRAP復(fù)合物的最大亞基)。確信miR-208是負(fù)反饋環(huán)的成分，通過抑制T3信號(hào)化而調(diào)節(jié)心肌肌球蛋白重鏈同種型表達(dá)。
[0072]圖20A和20B示出損傷的/再生的骨骼肌的miRNA陣列分析。圖20A示出在損傷的肌細(xì)胞中負(fù)調(diào)節(jié)的miRNA。圖20B示出在損傷的肌細(xì)胞中上調(diào)的miRNA。
[0073]圖21 列出了 SEQ ID NO:6~9 的序列。
[0074]圖22示出使用miRNA感應(yīng)器miR-Ι在分化的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)。通過將穩(wěn)定表達(dá)miR-Ι感應(yīng)器(dsRed::miR-l)或突變的感應(yīng)器(dsRed::miR-1-Mut)的衛(wèi)星細(xì)胞移至除去了 bFGF的分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化，使用熒光成像獲得圖像，示出dsRed報(bào)道基因(dsRed::miR-l)或者肌細(xì)胞分化標(biāo)記基因肌球蛋白重鏈(MF20)的表達(dá)。dsRed在感應(yīng)器表達(dá)的分化細(xì)胞中的低水平表達(dá)表示這些細(xì)胞中miR-Ι的表達(dá)。DAPI染色細(xì)胞核。
[0075]圖23A和23B示出miR-1/206表達(dá)系統(tǒng)(圖23A)和miR-1/206感應(yīng)器(圖23B)的確立。圖23A示出表達(dá)miR-1/206和GFP蛋白(圖23A，左側(cè))的表達(dá)構(gòu)建體。Northern印跡分析示出miR-Ι的表達(dá)(圖23a，右側(cè))。圖23B示出在293細(xì)胞中miR-Ι抑制miR-1/206感應(yīng)器。將穩(wěn)定表達(dá)miR-1/206感應(yīng)器的293細(xì)胞用miR-1/206 (SDSA:的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，使用相襯(293細(xì)胞)或熒光成像獲得圖像，以示出dsRed報(bào)道基因(dsRed::miR-Ι)或者 miRNA::GFP(SDSA: 或者這二者的 Overlay 的表達(dá)。注意到 dsRed感應(yīng)器和miR-Ι的表達(dá)是唯一的，表明miR-Ι特異性抑制感應(yīng)器報(bào)道基因的表達(dá)。
[0076]圖24A和24B示出miR-1/206對(duì)Pax7和BDNF3’ UTRs的抑制。圖24A是小鼠Pax7UTR(SEQ ID NO:40-41)與MiR-1 (SEQ ID NO:1)和miR_206(SEQ ID NO:3)的序列排列對(duì)t匕。圖 24B 示出含有小 鼠 Pax73’ UTR(Luc_Pax7::UTR)或其突變體(Luc_Pax7::UTR-M)或者BDNF3’ UTR(Luc-BDNF::UTR)或其突變體(Luc-BDNF: =UTR-M)的螢光素酶報(bào)道基因與指定的miRNA表達(dá)載體的共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后確定螢光素酶活性。數(shù)據(jù)以一式兩份進(jìn)行的至少三個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。注意到miR-1/206顯著抑制Pax7和BDNF3’ UTR報(bào)道基因的表達(dá)。
[0077]圖25A-25C示出miR-1/206抑制衛(wèi)星細(xì)胞中Pax7的表達(dá)，但是不抑制Pax3的表達(dá)。圖25A是對(duì)Pax7表達(dá)進(jìn)行的Northern印跡分析,表明Pax7mRNA的轉(zhuǎn)錄水平不被3’ UTR抑制。圖25B是Western印跡分析，表明在miR-1/206過表達(dá)的衛(wèi)星細(xì)胞中是Pax7而非Pax3蛋白質(zhì)水平較低。圖25C示出使用相襯(Phase/Contrast panels)或者突光成像獲得的圖像，示出骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中Pax7或Pax3蛋白(Pax7和Pax3組)或者miRNA::GFP (SDSA::miR-l/206 組)或者 overlay (overlay panels)的表達(dá)。注意到是 Pax7 而不是Pax3的表達(dá)被miR-1/206抑制。
[0078]圖26示出miR-1/206抑制衛(wèi)星細(xì)胞中BDNF的表達(dá)，但是不抑制⑶NF的表達(dá)。使用相襯(Phase/Contrast panels)或熒光成像獲得圖像，以示出骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中BDNF或者⑶NF 蛋白(BDNF和⑶NF 組)或者miRNA::GFP(SDSA::miR_l/206 組)或者 overlay (overlaypanels)的表達(dá)。注意到是BDNF的表達(dá)而不是⑶NF的表達(dá)被miR-1/206抑制。
[0079]圖27A和27B示出miR-1/206抑制衛(wèi)星細(xì)胞增殖。圖27A示出使用相襯或熒光成像獲得的衛(wèi)星細(xì)胞圖像，以示出細(xì)胞增殖指數(shù)，以BrdU (BrdU組)或者miRNA::GFP (SDSA::miR-1+206組)表示。在miR-1/206過表達(dá)的衛(wèi)星細(xì)胞中觀測(cè)到較少的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。圖27B示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中計(jì)數(shù)對(duì)照組及miR-1/206過表達(dá)的細(xì)胞中的BrdU陽(yáng)性染色的細(xì)胞，數(shù)據(jù)以BrdU陽(yáng)性細(xì)胞與總細(xì)胞的比率表示。
[0080]圖28A和28B示出miR-1/206增強(qiáng)衛(wèi)星細(xì)胞分化。圖28A和28B示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定過表達(dá)miR-1/206 (SDSA-miR-1+206)或GFP (對(duì)照)，然后將其移至除去了 bFGF的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)(圖28A)或者48小時(shí)(圖28B)，之后用肌球蛋白重鏈(MyHC)免疫染色。注意到在miR-1/206過表達(dá)的細(xì)胞中增強(qiáng)的MyHC染色。DAPI標(biāo)示細(xì)胞核。
[0081]圖29示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中miR-1/206的過表達(dá)增強(qiáng)衛(wèi)星細(xì)胞分化動(dòng)力學(xué)。將過表達(dá)miR-l/206(_)或者GFP(對(duì)照，?)的衛(wèi)星細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)(O、12、24、36和48小時(shí))在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或者移至其中除去了 bFGF的分化培養(yǎng)基中，對(duì)肌球蛋白重鏈(MyHC)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果以MyHC陽(yáng)性細(xì)胞與總細(xì)胞的比率表示。
[0082]圖30示出miR-1/206調(diào)節(jié)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的模型。
[0083]附表簡(jiǎn)述
[0084]表1列出了本文所用單字母表示的核苷酸縮寫。
[0085]表2示出了 miR -Ι和miR-133對(duì)肌原性(myogenic)增殖和分化的作用。將在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)中培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞用miR-1、miR-133或作為對(duì)照的GFP的雙鏈miRNA雙鏈體或者2’-0_甲基反義寡聚體電穿孔。36小時(shí)后，用分化培養(yǎng)基(DM)取代GM培養(yǎng)8、12和24小時(shí)，固定細(xì)胞以使用肌形成蛋白、磷酸組蛋白H3和肌球蛋白重鏈(MHC)的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。在隨機(jī)選擇的視野中從5000個(gè)DAPI染色的細(xì)胞中計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。使用可比的結(jié)果進(jìn)行三次單獨(dú)測(cè)定。
[0086]表3列出了本發(fā)明揭示的寡核苷酸的名稱和序列。
[0087]序列表簡(jiǎn)述
[0088]所述序列表示出了各種 miRNA、特別是 miR-1、miR-133、miR-206、miR-208、miR-22、miR-26、miR-29、miR-30、miR-128、miR-143 和 miR-145 (分別為 SEQ ID NO:1-11)的序列，以及本發(fā)明揭示的另外的多核苷酸序列。在一些情況中，RNA序列以DNA形式存在(即以胸腺嘧啶代替尿嘧啶)，應(yīng)理解這些序列也相應(yīng)于這些DNA序列的RNA轉(zhuǎn)錄物(即每個(gè)T均由U取代)。
[0089]發(fā)明詳述
[0090]本發(fā)明揭示了可以調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中影響所述肌細(xì)胞分化和/或增殖的特異基因表達(dá)的特定miRNA的確定。如本文所揭示，這種發(fā)現(xiàn)具有治療性應(yīng)用，包括治療各種原因所致的肌損傷，例如機(jī)械性肌創(chuàng)傷、肌組織退行性疾病和心肌損傷。本發(fā)明揭示的發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用進(jìn)一步包括利用對(duì)于所述基因具有特異性的miRNA調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中一或多個(gè)特異基因的表達(dá)，由此調(diào)節(jié)所述肌細(xì)胞的功能性，例如所述肌細(xì)胞的分化和/或增殖?？捎糜诒景l(fā)明揭示目的的非限制性 miRNA 的例子包括 miRNA-Ι、miRNA-133、miRNA-206 和 miRNA_208。
[0091]例如，聚集在相同染色體基因座上的miRNA-Ι (miR-1)和miRNA-133 (miR-133)在發(fā)育期間以組織特異性方式一起轉(zhuǎn)錄。miR-Ι和miR-133在體外培養(yǎng)的肌細(xì)胞和在體內(nèi)Xenopus胚胎中調(diào)節(jié)骨骼肌增殖和分化中均發(fā)揮獨(dú)特作用。miR-Ι通過靶向肌細(xì)胞基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制劑-組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)而促進(jìn)肌生成。相反，miR-133過抑制血清應(yīng)答因子(SRF)而增強(qiáng)肌細(xì)胞增殖。這個(gè)結(jié)果首次揭示了衍生自相同miRNA多順反子并一起轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)成熟miRNA可發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。本發(fā)明因此提供了這樣的分子學(xué)機(jī)制，即其中miRNA參與轉(zhuǎn)錄循環(huán)，控制肌細(xì)胞基因表達(dá)和胚胎發(fā)育。
[0092]另一個(gè)非限制性例子是Thrapl表達(dá)很可能由miR-208調(diào)節(jié)。Thrapl的3’UTR含有兩個(gè)預(yù)測(cè)的miR-208結(jié)合位點(diǎn)(圖18)。所述兩個(gè)靶位于Thrapl終止密碼子的~80bp下游，且彼此僅間隔~50bp。這兩個(gè)祀與miR-208的種子區(qū)域完全互補(bǔ)。Thrapl基因編碼TRAP240，這是遍在表達(dá)的TRAP(甲狀腺激素受體蛋白)復(fù)合物的一個(gè)240kd亞基。TRAP是一種多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物，是核受體的共激活物，且TRAP家族成員對(duì)于適當(dāng)發(fā)育很重要。因此，miR-208可以調(diào)節(jié)TRAP240的產(chǎn)生并促進(jìn)激素依賴性心肌細(xì)胞分化。
[0093]1:總則
[0094]第一個(gè)描述的miRNA, lin-4基因,其控制C.elegans幼體發(fā)育的時(shí)間進(jìn)程,發(fā)現(xiàn)其出乎意料地產(chǎn)生長(zhǎng)度為21個(gè)核苷酸的非編碼RNA，抑制lin-14蛋白質(zhì)表達(dá)而不顯著影響Iin-HmRNA水平。發(fā)現(xiàn)這個(gè)小RNA靶向lin_14的3’非翻譯區(qū)(UTR)中的互補(bǔ)位點(diǎn)49’5°。盡管這種現(xiàn)象最初被作為遺傳奇特現(xiàn)象進(jìn)行處理且實(shí)際上被忽略，但是現(xiàn)在意識(shí)到目前稱作miRNA的幾百個(gè)小RNA與不同物種的基因組中存在的lin_4相似，且調(diào)節(jié)互補(bǔ)mRNA的翻譯。雖然近來的報(bào)道提示少許miRNA在明顯不同的生物學(xué)進(jìn)程中的作用，但是大多數(shù)miRNA在很大程度上仍未鑒定。
[0095]1.A:miRNA牛物學(xué)發(fā)牛及機(jī)制
[0096]miRNA生物學(xué)發(fā)生的一般模型不于圖13。成熟miRNA的長(zhǎng)度為~22個(gè)核苷酸(nt)，是從較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物中加工的51’52。原始的miRNA (pr1-miRNA)可以作為單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄單位由RNA Pol II轉(zhuǎn)錄，或者可以源自宿主基因的剪接內(nèi)含子'miRNA加工途徑可以從RNAseIII核酸內(nèi)切酶Drosha使pr1-miRNA核裂解開始，產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)度為~70個(gè)核苷酸的中間前體-miRNA (pre-miRNA),其具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)54。Exportin-5識(shí)別由Drosha裂解的交錯(cuò)切口并以Ran-GTP依賴性方式將pre-miRNA輸出至細(xì)胞質(zhì)中54_6°。一旦輸出至細(xì)胞質(zhì)中，所述pre-miRNA的兩個(gè)鏈均可以由另一種RNAse III酶Dicer裂解,大約兩個(gè)螺旋從莖-環(huán)的基底部旋轉(zhuǎn)分離61_63。所得~22mer RNA雙鏈體由Dicer釋放,且單鏈的莖-臂(stem-arm)可以摻入RISC (RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)。RISC是一種核糖核蛋白復(fù)合物，含有Argonaute蛋白質(zhì)家族成員和輔因子，以及miRNA和mRNA靶位。據(jù)認(rèn)為所述莖-臂雙鏈體的相對(duì)熱穩(wěn)定性決定哪個(gè)鏈摻入RISC中:進(jìn)入RISC的鏈通常是5’末端不太穩(wěn)定的鏈64’65。翻譯抑制由互補(bǔ)于靶mRNA的3’UTR內(nèi)的靶序列的miRNA通過仍未知的機(jī)制介導(dǎo)66’67。通常，不完全的互補(bǔ)導(dǎo)致翻譯抑制，而完全或接近完全的互補(bǔ)導(dǎo)致mRNA裂解68。關(guān)于miRNA的生物發(fā)生、通訊、RISC裝配及RISC的功能機(jī)制尚未明了，然而特異性miRNA的功能研究及miRNA途徑成分的遺傳和生物化學(xué)分析已經(jīng)揭示了 miRNA在不同生物學(xué)過程中起重要作用。
[0097]1.B:發(fā)育中的 miRNA
[0098]多細(xì)胞生物體的發(fā)育需要遺傳途徑的空間和時(shí)間控制。有人提出miRNA通過靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)控制或調(diào)整這些復(fù)雜的遺傳途徑。一種確定miRNA在動(dòng)物發(fā)育中的必需性的方法已經(jīng)在Dicer中產(chǎn)生突變，這是miRNA加工為其成熟活性形式所需要的上游酶。確信脊椎動(dòng)物僅具有一個(gè)Dicer拷貝，其很可能是充分處理所有脊椎動(dòng)物miRNA所需要的62’63’69。在小鼠中，Dicer功能的消除導(dǎo)致(E) 7.5天胚胎致死69。Dicer null小鼠不表達(dá)原條標(biāo)記T(brachyury)，表示在原腸胚形成期間機(jī)體成形之前發(fā)育很可能被阻抑。由于在小鼠肢體中胚層中發(fā)揮特異性功能的Dicer的條件喪失，導(dǎo)致肢體長(zhǎng)度減小及細(xì)胞凋亡增加70O在斑馬中通過產(chǎn)生母系合子Dicer突變體而完全阻斷miRNA形成,表明miRNA的喪失不影響胚胎軸(axis)的形成或者胚胎中許多類型細(xì)胞的式樣。然而，在原腸胚形成、腦形成、體質(zhì)發(fā)生和心臟發(fā)育期間的形態(tài)發(fā)生均被證實(shí)是異常的，導(dǎo)致致死性71。總之，對(duì)Dicer功能的遺傳分析提示成熟miRNA為適當(dāng)?shù)陌l(fā)育所需要。除去所有miRNA功能的研究是有教益的，然而其也是鈍工具，未提供關(guān)于特異性miRNA的精確功能的見識(shí)。
[0099]1.C:特異件miRNA的牛物學(xué)作用
[0100]越來越多的證據(jù)提示miRNA參與種種生物學(xué)過程。在胰島細(xì)胞中，miR-375的過表達(dá)抑制葡萄糖胰島的胰島素分泌，同時(shí)抑制內(nèi)源性miR-375增強(qiáng)胰島素分泌72。相似的過表達(dá)和抑制策略鑒別了 miR-143通過調(diào)節(jié)ERK5蛋白質(zhì)表達(dá)而在脂肪細(xì)胞分化中的作用73O在另一個(gè)例子中，編碼5個(gè)miRNA的多順反子性miRNA基因與腫瘤發(fā)生相關(guān)聯(lián)74。已經(jīng)提出了 miRNA在造血作用75、神經(jīng)元分化腳和Hox基因表達(dá)的調(diào)節(jié)78’79中的其它功能。
[0101]目前有超過300種已知的人miRNA，但是僅少數(shù)具有已知的生物學(xué)功能。對(duì)于特異性miRNA的研究為理解miRNA介導(dǎo)的發(fā)育調(diào)節(jié)和病理學(xué)的普遍性和重要性所需要。本發(fā)明首次提供了 miRNA在調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化和增殖中的作用。
[0102]1.D:miRNA在心腫發(fā)育中的作用
[0103]心臟的發(fā)生需要不同遺傳程序的精確控制，因此探索不同表達(dá)的心臟中富集的miRNA也許幫助調(diào)節(jié)這些復(fù)雜途徑。本發(fā)明揭示了一些miRNA的這種組織特異性表達(dá)模式。miR-Ι和miR-133在骨骼肌和心肌組織中均表達(dá)，而miR-208僅在心肌組織中檢測(cè)到。在本發(fā)明之前，這些肌細(xì)胞特異性miRNA的功能還不清楚。 [0104]1.E:miRNA 靶的鑒別
[0105]鑒別特異性miRNA的靶便于理解其在調(diào)節(jié)途徑中的精確作用。大多數(shù)動(dòng)物miRNA與其靶位點(diǎn)不完全互補(bǔ)，阻礙了使用簡(jiǎn)便的同源性檢索來鑒別動(dòng)物miRNA靶位點(diǎn)。為了克服這個(gè)障礙，已經(jīng)揭示了一些計(jì)算方法，其中摻入已知miRNA靶的序列保守性和特征作為標(biāo)準(zhǔn)，以預(yù)測(cè)新的動(dòng)物miRNAi靶8°_85。例如，一些算法考慮到大多數(shù)miRNA在確證的靶位點(diǎn)內(nèi)的第2和第8位核苷酸之間呈現(xiàn)高互補(bǔ)性，將其稱作“種子”區(qū)。其它算法則不是這樣，因?yàn)樵谝恍┣闆r中，在miRNA的3’末端的互補(bǔ)性可以補(bǔ)償較弱的5’末端結(jié)合。這些算法也分級(jí)預(yù)測(cè)兩或多個(gè)物種之中相對(duì)于側(cè)翼區(qū)的靶序列保守。這些類型的計(jì)算方法已經(jīng)成功地預(yù)測(cè)出一些哺乳動(dòng)物miRNA靶位點(diǎn)。對(duì)于任何特定miRNA產(chǎn)生的預(yù)測(cè)幾乎均含有假陽(yáng)性。然而，所述預(yù)測(cè)非常適用作為假說生成元。任何預(yù)測(cè)均可以通過實(shí)驗(yàn)核實(shí)并置于相關(guān)的生物學(xué)環(huán)境中。
[0106]1.F:重要件
[0107]目前在miRNA研究中有一些活躍領(lǐng)域，試圖去理解在miRNA指導(dǎo)的抑制之后的精確分子學(xué)機(jī)制、揭示分析miRNA表達(dá)和鑒別靶位點(diǎn)的更好的工具，及確定調(diào)節(jié)途徑內(nèi)特異性miRNA的生物學(xué)相關(guān)作用。
[0108]心臟發(fā)育和病理學(xué)與復(fù)雜遺傳途徑的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，在試圖理解這些途徑中已經(jīng)盡力而為。大多數(shù)研究針對(duì)于為心臟基因轉(zhuǎn)錄需要的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)增強(qiáng)子序列的作用。已經(jīng)證實(shí)心臟基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是非常復(fù)雜的，各個(gè)心臟基因由多個(gè)獨(dú)立的增強(qiáng)子控制，在心臟中以非常受限的表達(dá)模式表達(dá)。潛在地，miRNA顯著增加這種復(fù)雜性，甚至在轉(zhuǎn)錄后水平加入另一層調(diào)節(jié)。本發(fā)明在某種程度上提供了關(guān)于心肌和骨骼肌基因表達(dá)怎樣被調(diào)節(jié)的新認(rèn)識(shí)，并揭示了基于這種認(rèn)識(shí)的治療和研究性應(yīng)用。另外，本發(fā)明關(guān)于miRNA控制肌細(xì)胞分化和增殖的揭示作為理解miRNA在其它途徑中功能的模型。
[0109]H:定義
[0110]為方便起見，在此收集了本說明書、實(shí)施例和所附權(quán)利要求書中應(yīng)用的某些術(shù)語(yǔ)。雖然確信本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知如下術(shù)語(yǔ)的含義，但是為了便于解釋本發(fā)明而闡述了如下定義。
[0111]除非另有陳述，本文所用所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的含義。盡管與本發(fā)明所述相似或相同的方法、設(shè)備和材料均可用于實(shí)施或檢測(cè)本發(fā)明，但是在此仍描述了代表性的方法、設(shè)備和材料。
[0112]根據(jù)長(zhǎng)期存在的專利法規(guī)，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)”當(dāng)用于本說明書、包括權(quán)利要求書中時(shí)是指“一或多個(gè)”。因此，本文中“一個(gè)”是指一或多個(gè)(即至少一個(gè))對(duì)象。例如，“一個(gè)元件”是指一或多個(gè)元件。
[0113]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“大約”當(dāng)指數(shù)值或者質(zhì)量、重量、時(shí)間、體積、濃度或百分比時(shí)是指在一些實(shí)施方案中與指定量具有±20%或±10%、±5%、±1%、±0.5%及±0.1%的偏差，這種偏差適于實(shí)踐本發(fā)明。除非另有陳述，則本說明書和權(quán)利要求書中使用的表示成分、反應(yīng)條件等的量的 所有數(shù)字均應(yīng)理解為是“大約值”。因此，除非相反陳述，則本說明書和所附權(quán)利要求書中陳述的值可以根據(jù)希望獲得的性質(zhì)而變化。
[0114]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”和“氨基酸殘基”可互換應(yīng)用，是指任何20種天然發(fā)生的氨基酸以及其類似物、衍生物和同源物，以及具有變體側(cè)鏈的氨基酸類似物，及前述任何氨基酸的所有立體異構(gòu)體。因此，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指包含具有氨基功能性和酸功能性且能包含在天然發(fā)生的氨基酸的聚合物中的所有分子，無論是天然還是合成的分子。
[0115]氨基酸可以基于多肽在其肽鍵處的化學(xué)消化(水解)而形成。本文描述的氨基酸殘基在一些實(shí)施方案中是L異構(gòu)體形式。然而，D異構(gòu)體形式的殘基也可以取代任何L-氨基酸殘基，只要所述多肽保留希望的功能性即可。NH2是指在多肽的氨基末端存在的游離氨基基團(tuán)。COOH是指在多肽的羧基末端存在的游離羧基基團(tuán)。在標(biāo)準(zhǔn)多肽命名法中，氨基酸殘基的縮寫在上文以表格形式示出。
[0116]注意本文的所有氨基酸殘基序列均以常規(guī)的從左至右表示從氨基末端至羧基末端的方式列出。另外，短語(yǔ)“氨基酸”和“氨基酸殘基”廣義包括修飾的和非尋常的氨基酸。
[0117]再者，注意在氨基酸殘基序列的開始或結(jié)束處的破折號(hào)表示與一或多個(gè)氨基酸殘基的進(jìn)一步序列的肽鍵連接，或者與氨基末端基團(tuán)如NH2或者?；蛘吲c羧基末端基團(tuán)如COOH的共價(jià)鍵連接。
[0118]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”是以其通常的生物學(xué)含義使用。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在生物體例如脊椎動(dòng)物對(duì)象中存在。細(xì)胞可以是真核細(xì)胞(例如肌細(xì)胞，如骨骼肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞)或者原核細(xì)胞(例如細(xì)菌)。細(xì)胞可以是體細(xì)胞或者種系來源，全能細(xì)胞，多能細(xì)胞，或者分化為任何程度，分裂或未分裂。細(xì)胞也可以衍生自或者可以包含生殖細(xì)胞或胚胎、干細(xì)胞、或者完全分化的細(xì)胞。
[0119]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”可互換應(yīng)用，是指其中可以導(dǎo)入本發(fā)明的組合物(例如編碼miRNA的表達(dá)載體)的細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)。此外，該術(shù)語(yǔ)不僅是指其中最初導(dǎo)入了表達(dá)構(gòu)建體的特定細(xì)胞，而且也包括這種細(xì)胞的后代或者潛在后代。由于突變或者環(huán)境影響可以在隨后的世代中出現(xiàn)某些修飾，事實(shí)上這種后代可以與親代細(xì)胞不相同，但是仍包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0120] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因”是指編碼RNA的核酸，例如包括但非限于編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因。術(shù)語(yǔ)“基因”也廣泛用于描述生物功能相關(guān)的DNA節(jié)段。如此，術(shù)語(yǔ)“基因”涵蓋了包括但非限于如下的序列:編碼序列；啟動(dòng)子區(qū)域；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列；是調(diào)節(jié)性蛋白的特異性識(shí)別序列的非表達(dá)的DNA節(jié)段；有助于基因表達(dá)的非表達(dá)的DNA節(jié)段，例如可以轉(zhuǎn)錄為mRNA的3’非翻譯區(qū)的DNA節(jié)段，其隨之由本發(fā)明的miRNA靶向和結(jié)合；設(shè)計(jì)為具有希望的參數(shù)的DNA節(jié)段；或者這些序列的組合?；蚩梢酝ㄟ^多種方法獲得，包括從生物學(xué)樣本克隆、基于已知或預(yù)測(cè)的序列信息合成、及衍生自一或多個(gè)現(xiàn)有序列的重組序列。
[0121 ] 正如本領(lǐng)域所已知，基因典型包含一個(gè)編碼鏈和一個(gè)非編碼鏈。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“編碼鏈和“有義鏈”可互換使用，是指與從中基因產(chǎn)物被翻譯的mRNA具有相同核苷酸序列的核酸序列。也正如本領(lǐng)域所已知，當(dāng)編碼鏈和/或有義鏈用于描述DNA分子時(shí)，所述編碼/有義鏈包含胸腺嘧啶代替在相應(yīng)mRNA中發(fā)現(xiàn)的尿嘧啶。另外，當(dāng)該術(shù)語(yǔ)用于描述DNA分子時(shí)，所述編碼/有義鏈也可以包含在所述mRNA中未發(fā)現(xiàn)的另外的元件，包括但非限于啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和內(nèi)含子。相似地，術(shù)語(yǔ)“模板鏈”和“反義鏈”可互換使用，是指與所述編碼/有義鏈互補(bǔ)的核酸序列。然而，應(yīng)注意對(duì)于不編碼多肽產(chǎn)物的那些基因例如miRNA而言，術(shù)語(yǔ)“編碼鏈”用于描述包含所述miRNA的鏈。在這個(gè)用法中，包含所述miRNA的鏈對(duì)于miRNA前體是有義鏈，但是對(duì)于其靶RNA則是反義鏈(即所述miRNA與靶RNA雜交，因?yàn)槠浒瑢?duì)于革ElRNA是反義的序列)。在這個(gè)用法中,包含所述miRNA的鏈對(duì)于所述miRNA前體是有義鏈，但是對(duì)于其靶RNA是反義鏈。
[0122]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“ 互補(bǔ)性”和“互補(bǔ)”是指核酸通過傳統(tǒng)Watson-Crick或者其它非傳統(tǒng)類型的相互作用可以與另一核酸序列形成一或多個(gè)氫鍵。在一些實(shí)施方案中，關(guān)于本發(fā)明的核酸分子，與具有其互補(bǔ)序列的核酸分子的結(jié)合自由能足以使得所述核酸的相關(guān)功能發(fā)揮核糖核酸酶活性。例如，miRNA前體的有義和反義鏈之間的互補(bǔ)程度與miRNA前體的含有miRNA的鏈與靶核酸序列之間的互補(bǔ)程度可以相同或不同。核酸分子的結(jié)合自由能的確定為本領(lǐng)域所熟知。見例如Freier et al.，198631 ；Turner et al.，198732所述。
[0123]如本文所用，短語(yǔ)“互補(bǔ)性百分比”、“相同性百分比”與“相同百分比”可互換使用，是指一個(gè)核酸分子中可以與另一個(gè)核酸序列形成氫鍵(例如Watson-Crick堿基配對(duì))的連續(xù)殘基的百分?jǐn)?shù)(例如10個(gè)殘基中有5、6、7、8、9或10個(gè)互補(bǔ)為50%、60%、70%、80%、90%和100%互補(bǔ))。術(shù)語(yǔ)“100%互補(bǔ)”、“完全互補(bǔ)”是指一個(gè)核酸序列的所有連續(xù)殘基均可以與另一個(gè)核酸序列中相同數(shù)目的連續(xù)殘基形成氫鍵。由于miRNA為大約17-24個(gè)核苷酸，且在miRNA指導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)中典型容許至多5個(gè)錯(cuò)配(例如1、2、3、4或5個(gè)錯(cuò)配)，因此miRNA與其靶向的RNA之間至少為70%的互補(bǔ)性應(yīng)足以使得所述miRNA調(diào)節(jié)從所述靶RNA中衍生的基因的表達(dá)。
[0124]術(shù)語(yǔ)“基因表達(dá)”通常是指細(xì)胞過程，通過這種過程生物學(xué)活性多肽從DNA序列中產(chǎn)生，且在細(xì)胞中呈現(xiàn)生物學(xué)活性。正是如此，基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，但是也包括可影響基因或基因產(chǎn)物的生物學(xué)活性的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后過程。這些過程包括但非限于RNA合成、加工和轉(zhuǎn)運(yùn)，以及多肽合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和多肽的翻譯后修飾。另外，影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的過程也可以影響所述基因表達(dá)。
[0125]然而，在不編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因例如miRNA基因的情況中，術(shù)語(yǔ)“基因表達(dá)”是指前體miRNA從所述基因中產(chǎn)生的過程。典型地，這個(gè)過程是指轉(zhuǎn)錄，盡管與蛋白質(zhì)編碼基因的RNA聚合酶II指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄不同，但是miRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不被翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)。盡管如此，成熟miRNA從miRNA基因中的產(chǎn)生仍涵蓋在本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“基因表達(dá)”的含義中。
[0126]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分離”是指基本上沒有其它核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和/或其通常相關(guān)聯(lián)的其它材料的分子，這種相關(guān)聯(lián)的材料是細(xì)胞材料或合成培養(yǎng)基中的材料。因此，術(shù)語(yǔ)“分離的核酸”是指天然的或者合成的或者其一些組合的核糖核酸分子或者脫氧核糖核酸分子(例如基因組DNA、cDNA、mRNA、miRNA等)，其(I)與在其中天然發(fā)現(xiàn)所述“分離的核酸”的細(xì)胞不相關(guān)聯(lián)，或者(2)與其天然不連接的多核苷酸可操縱地連接。相似地，術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”在一些實(shí)施方案中是指從重組DNA或RNA中制備的、或者合成的、或者其一些組合的多肽，其(I)與天然發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)不相關(guān)，(2)分離自其通常出現(xiàn)在其中的細(xì)胞，(3)經(jīng)分離而基本上沒有相同細(xì)胞來源中的其它蛋白質(zhì)，(4)由不同物種的細(xì)胞表達(dá)，或者(5)非天然發(fā)生。
[0127]術(shù)語(yǔ)“分離的”當(dāng)用于描述“分離的細(xì)胞”時(shí)，是指已經(jīng)從其天然環(huán)境例如器官、組織或生物體的一部分中分離。
[0128]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”和“標(biāo)記的”是指能通過分光法、放射性方法或其它方法檢測(cè)到的一種組分與探針分子的附著。因此，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”或者“標(biāo)記的”是指將一種可檢測(cè)的標(biāo)記任選通過共價(jià)或非共價(jià)方式摻入或者附著于分子如多肽。本領(lǐng)域已知且可以利用多種標(biāo)記多肽的方法。多肽的標(biāo)記的例子包括但非限于:放射性同位素、熒光標(biāo)記、重原子、酶標(biāo)記或報(bào)道基因、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、生物素?；⒂啥?jí)報(bào)道子(例如亮氨酸拉鏈對(duì)序列、抗體結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié) 合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)記)識(shí)別的預(yù)定的多肽表位。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記通過各種長(zhǎng)度的間隔臂附著，以降低潛在的位阻。
[0129]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”是指增加、降低或者以其它方式改變生物化學(xué)實(shí)體的任何或全部化學(xué)和生物學(xué)活性或性質(zhì)。例如，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”可以是指基因表達(dá)水平或者編碼一或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的RNA分子或等效RNA分子水平的改變；或者一或多種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的活性被上調(diào)或負(fù)調(diào)節(jié)，由此其表達(dá)水平或活性高于或低于在沒有所述調(diào)節(jié)物的情況中觀測(cè)到的水平或活性。例如，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”可以意味著“抑制”和“阻抑”，但是非限于這個(gè)含義。
[0130]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”是指對(duì)應(yīng)答的上調(diào)(即激活或刺激)和負(fù)調(diào)節(jié)(即抑制或阻抑)。因此，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”當(dāng)用于描述功能性質(zhì)或者生物學(xué)活性或過程(例如酶活性或受體結(jié)合)時(shí)，是指上調(diào)(例如激活或刺激)、負(fù)調(diào)節(jié)(例如抑制或阻抑)或者以其它方式改變這種性質(zhì)、活性或過程的品質(zhì)的能力。在某些情況中，這種調(diào)節(jié)可以隨特定事件的發(fā)生而定，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，和/或可以僅在特定細(xì)胞類型中出現(xiàn)。
[0131]術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)物”是指能導(dǎo)致調(diào)節(jié)作用的多肽、核酸、大分子、復(fù)合物、分子、小分子、化合物、物質(zhì)(species)等(天然發(fā)生或者非天然發(fā)生的)，或者從生物學(xué)材料如細(xì)菌、植物、真菌或動(dòng)物細(xì)胞或組織中產(chǎn)生的提取物?？梢酝ㄟ^測(cè)定評(píng)估調(diào)節(jié)物作為功能性質(zhì)、生物學(xué)活性或過程或者其組合的抑制劑或激活物(直接或間接)的潛在活性(例如激動(dòng)劑、部分拮抗劑、部分激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑、拮抗劑、抗微生物制劑、微生物感染或增殖的抑制劑等)。在這種測(cè)定中，可以一次篩選許多調(diào)節(jié)物。調(diào)節(jié)物的活性可以是已知、未知或者部分已知的。
[0132]調(diào)節(jié)物可以是選擇性或非選擇性的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“選擇性”當(dāng)用于描述調(diào)節(jié)物(例如抑制劑)時(shí)，是指在所述調(diào)節(jié)物與一種分子(例如感興趣的RNA)及與另一種相似但不相同的分子(例如衍生自與所述感興趣的靶RNA相同的基因家族成員的RNA)相互作用方式中的可測(cè)的或者另外生物學(xué)相關(guān)差異。
[0133]必須理解對(duì)于據(jù)認(rèn)為是選擇性調(diào)節(jié)物的調(diào)節(jié)物而言，其與靶RNA的相互作用的性質(zhì)不需要完全排除其與所述靶RNA相關(guān)的其它分子(例如除了靶RNA自身之外的家族成員的轉(zhuǎn)錄物)的相互作用。換句話說，術(shù)語(yǔ)“選擇性調(diào)節(jié)物”不限于僅結(jié)合感興趣的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的那些分子及相關(guān)家族成員的那些分子。該術(shù)語(yǔ)還包括可以與感興趣的基因及相關(guān)家族成員的轉(zhuǎn)錄物相互作用的調(diào)節(jié)物，但是為此可以設(shè)計(jì)一些條件，在這些條件下與靶RNA及與所述家族成員的不同的相互作用具有生物學(xué)相關(guān)結(jié)果。這種條件可包括但非限于所述調(diào)節(jié)物與所述家族成員的序列相同性程度的不同，及所述調(diào)節(jié)物在表達(dá)一些但非全部家族成員的特定組織或細(xì)胞類型中應(yīng)用。在后者的條件下，如果調(diào)節(jié)物與靶相互作用導(dǎo)致生物學(xué)相關(guān)事件，則可以認(rèn)為調(diào)節(jié)物對(duì)于指定的組織中的指定靶是選擇性的，盡管在表達(dá)另外的家族成員的另外的組織中所述調(diào)節(jié)物和所述靶根本不相互作用以產(chǎn)生生物學(xué)作用，因?yàn)樗稣{(diào)節(jié)物由于其它家族成員的存在而被組織“浸出”。
[0134]當(dāng)鑒別了選擇性調(diào)節(jié)物后，所述調(diào)節(jié)物以與結(jié)合另一種分子(例如與感興趣的基因相關(guān)的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物)不同的方式(例如較強(qiáng)的方式)結(jié)合一種分子(例如感興趣的基因的mR NA轉(zhuǎn)錄物)。如本文所用，所述調(diào)節(jié)物與所述分子的結(jié)合比與所述調(diào)節(jié)物可以結(jié)合的一些其它可能的分子的結(jié)合更強(qiáng)，則稱作“選擇性結(jié)合”或者“優(yōu)先結(jié)合”。
[0135]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抑制”、“阻抑”、“負(fù)調(diào)節(jié)”等可互換使用，是指基因產(chǎn)物(例如多肽)的活性、基因表達(dá)、多核苷酸例如miRNA活性或者編碼一或多種基因產(chǎn)物的RNA的水平被降低，低于在未執(zhí)行本發(fā)明的方法的情況中觀測(cè)到的結(jié)果。
[0136]在一些實(shí)施方案中，用miRNA分子抑制導(dǎo)致靶RNA的穩(wěn)定表達(dá)水平的降低。在一些實(shí)施方案中，用miRNA分子抑制導(dǎo)致靶基因的表達(dá)水平低于在存在不能負(fù)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)水平的失活或弱化的分子的情況中觀測(cè)到的水平。在一些實(shí)施方案中，用本發(fā)明的miRNA分子對(duì)基因表達(dá)的抑制在存在所述miRNA分子的情況中高于不存在所述miRNA分子的情況。在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)的抑制與所述基因編碼的mRNA的降解速度增強(qiáng)相關(guān)(例如miRNA-介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制)。在一些實(shí)施方案中，用本發(fā)明的miRNA分子抑制導(dǎo)致靶基因的基因產(chǎn)物的表達(dá)水平低于在不存在所述miRNA的情況中觀測(cè)到的表達(dá)水平。
[0137]在一些實(shí)施方案中，miRNA例如內(nèi)源性miRNA可以由miRNA抑制劑抑制，導(dǎo)致由所述miRNA靶向的基因的表達(dá)與所述miRNA未被抑制時(shí)基因表達(dá)(例如基因產(chǎn)物的產(chǎn)生)水平相比增加。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“miRNA抑制劑”和“miRNA的抑制劑”可互換應(yīng)用，是指抑制miRNA活性的分子。
[0138]在一些實(shí)施方案中，miRNA抑制劑是在指定條件下與特定的靶miRNA雜交、從而抑制所述靶miRNA活性的一種多核苷酸。所述miRNA抑制劑可以與靶miRNA雜交的條件包括例如生理?xiàng)l件。所述miRNA抑制劑基于所述miRNA抑制劑多核苷酸序列與所述靶miRNA多核苷酸的互補(bǔ)性而可以與靶miRNA較高或較低程度雜交。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的特定應(yīng)用或在特異性的需要，所述miRNA可以與所有或部分靶miRNA完全互補(bǔ)，或者不完全互補(bǔ)，包括例如與所述靶miRNA具有99%、98%、97%、96%、95%、90%、80%或70%互補(bǔ)性。所述miRNA抑制劑僅需要與所述靶miRNA具有互補(bǔ)性，因?yàn)檫@是在特定系列條件下抑制靶miRNA活性的需要量所必需的?？捎糜诒景l(fā)明中的miRNA抑制劑的例子包括但非限于修飾的多核苷酸如2’-0_甲基多核苷酸。代表性的非限制性例子在表2和表3中列出，包括2’ -O-甲基-miR-l、2’ -O-甲基-miR-133和2，-O-甲基-miR-208，其可分別特異性抑制miR-1、miR-133或miR-208的活性。
[0139]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“突變”具有其傳統(tǒng)的含義，是指核酸或多肽序列中通過繼承、天然發(fā)生或者導(dǎo)入的變化，在本文以其本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的含義應(yīng)用。
[0140]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“肌細(xì)胞”廣義是指在所有發(fā)育階段的所有類別的肌細(xì)胞。因此，“肌細(xì)胞”涵蓋了未分化的肌細(xì)胞例如成肌細(xì)胞以及分化的肌細(xì)胞例如終末分化的肌管?！凹〖?xì)胞”也涵蓋了不同組織學(xué)類型的肌細(xì)胞，包括但非限于橫紋肌細(xì)胞(例如骨骼肌細(xì)胞)、平滑肌細(xì)胞(例如腸肌細(xì)胞)和心肌細(xì)胞。另外，本文所用術(shù)語(yǔ)“肌細(xì)胞”不是物種特異性的。
[0141]術(shù)語(yǔ)“天然發(fā)生的”當(dāng)用于描述一個(gè)對(duì)象時(shí)，是指該對(duì)象可以在自然界發(fā)現(xiàn)。例如，存在于可以從自然來源中分離的生物體(包括細(xì)菌)中且未經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室中人工有意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然發(fā)生的。然而，必須意識(shí)到人工進(jìn)行任何處理均可使得“天然發(fā)生的”對(duì)象成為本文所用術(shù)語(yǔ)“分離的”對(duì)象。
[0142]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核酸”、“多核苷酸”及“核酸分子”是指任何脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段，及通過任何連接、切斷、內(nèi)切核酸酶作用及外切核酸酶作用產(chǎn)生的片段。核酸可以包含天然發(fā)生的核苷酸(如脫氧核糖核苷酸和核糖核酸)或者天然發(fā)生的核苷酸的類似物(例如天然發(fā)生的核苷酸的α -對(duì)映異構(gòu)體形式)，或者這二者組合的單體。修飾的核苷酸在糖成分和/或嘧啶或嘌呤堿基成分中具有修飾。糖成分的修飾包括例如一或多個(gè)羥基基團(tuán)由鹵素、烷基、胺和疊氮基置換，或者糖可以官能化為醚或酯。另外，全部的糖成分均可以用空間和電子相似的結(jié)構(gòu)如疊氮糖和碳環(huán)形糖類似物置換。堿基成分中修飾的例子包括烷化的嘌呤和嘧啶，?；泥堰屎袜奏ぃ蛘咂渌熘碾s環(huán)取代基。核酸單體可以通過磷酸二酯鍵或者這種鍵的類似物連接。磷酸二酯鍵的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、phosphoroselenoate>phosphorodiselenoate、phosphoroaniloth1ate> phosphoranilidate、氨基憐酸酯等。術(shù)語(yǔ)“核酸”還包括所謂的“肽核酸”，其包含與聚酰胺主鏈附著的天然發(fā)生的或者修飾的核酸堿基。核酸可以是單鏈或雙鏈的。
[0143]術(shù)語(yǔ)“可操縱地連接”當(dāng)用于描述兩個(gè)核酸區(qū)域之間的關(guān)系時(shí)，是指所述區(qū)域是以使它們以指定方式發(fā)揮功能的位置關(guān)系并列。例如，控制序列與編碼序列的“可操縱地連接”可以是這種方式的連接，其中編碼序列的表達(dá)在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)，例如當(dāng)合適的分子(例如誘導(dǎo)子和聚合酶)與控制或調(diào)節(jié)序列結(jié)合時(shí)。因此，在一些實(shí)施方案中，短語(yǔ)“可操縱地連接”是指啟動(dòng)子與編碼序列的連接，由此所述編碼序列的轉(zhuǎn)錄由所述啟動(dòng)子控制和調(diào)節(jié)?？刹倏v地連接啟動(dòng)子與編碼序列的技術(shù)為本領(lǐng)域所已知，關(guān)于感興趣的編碼序列的精確定向和定位依賴于所述啟動(dòng)子的特殊性質(zhì)。
[0144]因此，術(shù)語(yǔ)“可操縱地連接”可以描述與核苷酸序列連接的啟動(dòng)子區(qū)域，由此所述核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄由所述啟動(dòng)子區(qū)域控制和調(diào)節(jié)。相似地，稱核苷酸序列在與其可操縱地連接的啟動(dòng)子的“轉(zhuǎn)錄控制下”。可操縱地連接啟動(dòng)子區(qū)域與核苷酸序列的技術(shù)為本領(lǐng)域所已知。
[0145]術(shù)語(yǔ)“可操縱地連接”也是指轉(zhuǎn)錄終止序列與核苷酸序列的連接，由此所述核苷酸序列的的轉(zhuǎn)錄終止由所述轉(zhuǎn)錄終止序列控制。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄終止序列包含通過RNA聚合酶III導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄在終止子序列TTTTTTT的第三個(gè)或者第四個(gè)T終止的序列。因此，初始的小轉(zhuǎn)錄物典型在3’末端具有3或4個(gè)U。
[0146]描述兩個(gè)核酸或蛋白質(zhì)序列的短語(yǔ)“相同性百分比”和“相同百分比”是指在一些實(shí)施方案中當(dāng)排列對(duì)比最大對(duì)應(yīng)的兩或多個(gè)序列或亞序列時(shí)，其具有至少eo^jo^、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%核苷酸或氨基酸殘基相同性，通過使用如下序列對(duì)比算法或通過目測(cè)進(jìn)行測(cè)量。一些實(shí)施方案中的相同性百分比存在于長(zhǎng)度為至少大約10個(gè)、20個(gè)、50個(gè)、100個(gè)及150個(gè)殘基的序列區(qū)域中。在一些實(shí)施方案中，相同性百分比存在于全長(zhǎng)的指定區(qū)域中，如編碼區(qū)或者完整的miRNA。
[0147]為了進(jìn)行序列對(duì)比，典型將一個(gè)序列作為參考序列以與檢測(cè)序列進(jìn)行對(duì)比。當(dāng)使用序列對(duì)比算法時(shí)，將檢測(cè)序列和參考序列輸入計(jì)算機(jī)中，如果需要?jiǎng)t指定亞序列對(duì)應(yīng)物，并指定序列對(duì)比算法參數(shù)。然后所述序列對(duì)比算法基于指定的程序參數(shù)計(jì)算檢測(cè)序列與參考序列的序列相同性百分比。
[0148]可以進(jìn)行最佳的序列對(duì)比方法，例如Smith&Waterman, 198133描述的局部同源算法，Needleman&Wunsch, 197034 描述的同源序列排列對(duì)比算法，Pearson&Lipman, 198835所述的搜索相似性方法，這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行程序(GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA inthe (iWISCONSIN PACKAGE?，得自 Accelrys，Inc.,San Diego, California,UnitedStates of America)， 或者通過目測(cè)。見 Ausubel et al.，198936 所述。
[0149]適于確定序列相同性百分比和序列相似性的算法的一個(gè)例子是Altschul et al.，199037所述BLAST算法。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過全球信息網(wǎng)公開得自國(guó)家生物技術(shù)信息中心。這個(gè)算法包括首先通過鑒別查詢序列中長(zhǎng)度W的短字而鑒別高得分的序列對(duì)(HSP)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字排列對(duì)比時(shí)其匹配或滿足一些正值的閾值得分T15T是指鄰域字得分閾值37。這些初始的擊中作為種子開始搜索以發(fā)現(xiàn)含有其的較長(zhǎng)HSP。然后將所述字擊中沿著每個(gè)序列的兩個(gè)方向擴(kuò)展，直至可以增加序列排列對(duì)比的累積得分。對(duì)于核苷酸序列，累積得分使用參數(shù)M( —對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)分；總是> 0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分；總是<0)計(jì)算。對(duì)于氨基酸序列，使用得分矩陣計(jì)算累積得分。當(dāng)累積序列排列對(duì)比得分從其達(dá)到的最大值減少數(shù)量X時(shí)，字hits在每個(gè)方向的延伸停止，累積得分趨于為O或低于0，由于一或多個(gè)負(fù)分值的殘基對(duì)比的累積或者每個(gè)序列達(dá)到終點(diǎn)所致。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了序列排列對(duì)比的靈敏性和速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)使用默認(rèn)值，字長(zhǎng)度(W) = 11，期望值(E) = 10，cutoff = 100，M = 5，N = -4，兩個(gè)鏈均進(jìn)行對(duì)比。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用默認(rèn)值，字長(zhǎng)度(W) = 3，期望值(E) = 10，及BL0SUM62得分矩陣38。
[0150]除了計(jì)算序列相同性百分比之外，BLAST算法對(duì)于兩個(gè)序列之間的相似性也進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。見例如Karlin&Altschull99339所述。由BLAST算法提供的一種相似性測(cè)量是最小和概率(P(N))，其提供了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的匹配將隨機(jī)發(fā)生的概率。例如，如果檢測(cè)核酸序列與參考核酸序列對(duì)比的最小和概率在一些實(shí)施方案中低于大約0.1、
0.01及0.001，則認(rèn)為所述檢測(cè)核酸序列與參考序列相似。
[0151 ] 描述兩個(gè)核苷酸序列的術(shù)語(yǔ)“基本相同”是指兩或多個(gè)序列或亞序列當(dāng)最大相應(yīng)性對(duì)比和排列時(shí)，使用如下序列對(duì)比算法之一或者通過目測(cè)進(jìn)行測(cè)量，在一些實(shí)施方案中具有至少大約70%核苷酸相同性,在一些實(shí)施方案中具有至少大約75%核苷酸相同性,在一些實(shí)施方案中具有至少大約80%核苷酸相同性，在一些實(shí)施方案中具有至少大約85%核苷酸相同性，在一些實(shí)施方案中具有至少大約90%核苷酸相同性,在一些實(shí)施方案中具有至少大約95%核苷酸相同性,在一些實(shí)施方案中具有至少大約97%核苷酸相同性及在一些實(shí)施方案中具有至少大約99%核苷酸相同性。在一個(gè)實(shí)施例中,所述基本相同性存在于至少17個(gè)殘基的序列中,在一些實(shí)施方案中存在于至少大約18個(gè)殘基的序列中,在一些實(shí)施方案中存在于至少大約19個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約20個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約21個(gè)殘基的序列中,在一些實(shí)施方案中存在于至少大約22個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約23個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約24個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約25個(gè)殘基的序列中,在一些實(shí)施方案中存在于至少大約26個(gè)殘基的序列中,在一些實(shí)施方案中存在于至少大約27個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約30個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約50個(gè)殘基的序列中,在一些實(shí)施方案中存在于至少大約75個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中存在于至少大約100個(gè)殘基的序列中，在一些實(shí)施方案中 存在于至少大約150個(gè)殘基的序列中，在另一個(gè)實(shí)施例中存在于包含完整編碼序列的核苷酸序列中。在一些實(shí)施方案中，多態(tài)性序列可以是基本相同的序列。術(shù)語(yǔ)“多態(tài)性”是指群體中兩或多個(gè)遺傳確定的備選序列或等位基因的存在。等位基因差異可以僅是一個(gè)堿基對(duì)。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到所述多態(tài)性序列相應(yīng)于相同基因。
[0152]兩個(gè)核苷酸序列是基本相同的另一指征是這兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下彼此特異性或者充分雜交。在核酸雜交的情況中，對(duì)比的兩個(gè)核酸序列可以稱作“探針序列”和“檢測(cè)序列”。“探針序列”是參考核酸分子，“檢測(cè)序列”是檢測(cè)核酸分子，通常在核酸分子的異質(zhì)群體中發(fā)現(xiàn)。
[0153]用于雜交研究或測(cè)定的核苷酸序列的一個(gè)例子包括探針序列，其在一些實(shí)施方案中互補(bǔ)于或模擬本發(fā)明的核酸分子的至少大約14-40個(gè)核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施例中，探針包含14-20個(gè)核苷酸，或者當(dāng)需要時(shí)會(huì)更長(zhǎng)，例如30、40、50、60、100、200、300或500個(gè)核苷酸或者直至給定基因的全長(zhǎng)。這種片段可易于通過例如化學(xué)合成直接合成、通過應(yīng)用核酸擴(kuò)增技術(shù)、或者通過將選擇的序列導(dǎo)入重組載體中以重組產(chǎn)生而制備。
[0154]短語(yǔ)“靶向”包括“特異性雜交”，是指一種分子僅與特定的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下結(jié)合、形成雙鏈體或雜交，所述序列存在于復(fù)合的核酸混合物中(例如總細(xì)胞DNA或RNA)。
[0155]非限制性例如，雜交可以在5x SSC、4x SSC、3x SSC、2x SSC，、lx SSC 或者 0.2x SSC中進(jìn)行至少大約I小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)或者24小時(shí)(見Sambrook&Russell，2001關(guān)于SSC緩沖液及其它雜交條件的描述)?？梢蕴岣唠s交溫度以調(diào)節(jié)反應(yīng)的嚴(yán)格性，例如從大約25°C (室溫)提高至大約451:、501:、551:、601:或651:。雜交反應(yīng)也可以包括影響嚴(yán)格性的另一種物質(zhì)，例如在存在50%甲酰胺的條件下進(jìn)行雜交增加在指定溫度下雜交的嚴(yán)格性。
[0156]雜交反應(yīng)之后可以跟隨一個(gè)洗滌步驟，或者兩或多個(gè)洗滌步驟，所述洗滌可以是相同或不同的鹽度和溫度。例如，洗滌溫度可以從大約25°C (室溫)提高至大約45°C、50°C、55°C、60°C、65°C或更高以調(diào)節(jié)嚴(yán)格性。洗滌步驟可以在存在洗滌劑例如SDS的條件下進(jìn)行。例如，雜交之后可跟隨兩個(gè)洗滌步驟，每一次洗滌均在65°C在2x SSC、0.1% SDS中洗滌大約20分鐘，及任選兩個(gè)額外洗滌步驟，每次洗滌均在65°C在0.2x SSC、0.1% SDS中洗滌大約20分鐘。
[0157]如下是可用于克隆與本發(fā)明的參考核苷酸序列基本相同的同源核苷酸序列的雜交和洗滌的實(shí)施例:在一個(gè)實(shí)施例中探針核苷酸序列與靶核苷酸序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaP04、Imm 乙二胺四乙酸(EDTA)中在 50°C雜交，隨后在 2X SSC,0.1% SDS中在50°C洗滌；在一些實(shí)施方案中，探針與檢測(cè)序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4Umm EDTA中在50°C雜交，隨后在IX SSC、0.1% SDS中在50°C洗滌；在一些實(shí)施方案中，探針與檢測(cè)序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4Umm EDTA中在50°C雜交，隨后在0.5X SSC、0.1%SDS中在50°C洗滌；在一些實(shí)施方案中，探針與檢測(cè)序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaP04、l_EDTA 中在 50°C雜交，隨后在 0.1X SSC,0.1%505中在50°〇洗滌；在另一個(gè)實(shí)施例中，探針與檢測(cè)序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4Umm EDTA中在50°C雜交，隨后在0.1X SSC、0.1% SDS中在65°C洗滌。 [0158]嚴(yán)格雜交條件的其它例子包括在42 °C在包含或者由50 %甲酰胺、1xDenhardtJ s (0.2 % Ficoll、0.2 %聚乙烯吡咯烷酮、0.2 %牛血清白蛋白)和200mg/ml變性載體DNA例如剪切的鮭精DNA組成的溶液中過夜雜交，隨后進(jìn)行兩次洗滌，每次洗滌均在65°C在2x SSC、0.1% SDS中洗滌大約20分鐘，及另外兩次洗滌，每次洗滌均在65°C在
0.2xSSC、0.1% SDS中洗滌大約20分鐘。
[0159]雜交可包括兩個(gè)核酸于溶液中雜交，或者于溶液中的一個(gè)核酸與附著于固體支持物例如濾膜上的一個(gè)核酸雜交。當(dāng)一個(gè)核酸位于固體支持物上時(shí)，在雜交之前可以進(jìn)行預(yù)雜交步驟。預(yù)雜交可以是在與雜交相同溶液、相同溫度下(但是無互補(bǔ)多核苷酸鏈)進(jìn)行至少大約I小時(shí)、3小時(shí)或者10小時(shí)。
[0160]因此，在回顧現(xiàn)有揭示內(nèi)容的基礎(chǔ)上，嚴(yán)格條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，或者可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員不用進(jìn)行過多實(shí)驗(yàn)而確定36’4°_44。
[0161]短語(yǔ)“充分雜交”是指探針核酸分子與靶核酸分子之間的互補(bǔ)雜交，且包含最小的錯(cuò)配，可以通過降低雜交的嚴(yán)格性調(diào)節(jié)以實(shí)現(xiàn)希望的雜交。
[0162]術(shù)語(yǔ)“表型”是指例如具有任一種性狀或任意性狀的細(xì)胞或生物體的全部物理、生物化學(xué)和生理學(xué)組成。由此，表型得自細(xì)胞或生物體內(nèi)基因的表達(dá)，并與潛在可觀測(cè)或可測(cè)定的性狀相關(guān)。
[0163]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多肽”、“蛋白質(zhì)”和“肽”在本文可互換使用，是指20個(gè)的氨基酸或氨基酸類似物的聚合物，無論其大小和功能如何。盡管“蛋白質(zhì)”通常用于描述相對(duì)較大的多肽，而“肽”通常用于描述小的多肽，但是這些術(shù)語(yǔ)在本領(lǐng)域的應(yīng)用是重疊和變化的。除非特別指出，則術(shù)語(yǔ)“多肽”在本文用于描述肽、多肽和蛋白質(zhì)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”當(dāng)在本文描述基因產(chǎn)物時(shí)可互換應(yīng)用。術(shù)語(yǔ)“多肽”涵蓋了所有功能的蛋白質(zhì)，包括酶。因此，多肽例如包括基因產(chǎn)物、天然發(fā)生的蛋白質(zhì)、其同系物、直向同源物、共生同源物、片段、及其它等價(jià)物、變體和類似物。
[0164]術(shù)語(yǔ)“多肽片段”或“片段”當(dāng)用于描述參考多肽時(shí)，是指與所述參考多肽自身相比缺失了氨基酸殘基的多肽，但是剩余的氨基酸序列與所述參考多肽中的相應(yīng)位置通常相同。這種缺失可以發(fā)生在參考多肽的氨基末端或者羧基末端或者這兩端。片段長(zhǎng)度典型為至少5、6、8或者10個(gè)氨基酸，至少14個(gè)氨基酸，至少20、30、40或50個(gè)氨基酸，至少75個(gè)氨基酸，或者至少100、150、200、300、500或更多個(gè)氨基酸。片段可以保留所述參考多肽的一或多種生物學(xué)活性。另外，片段可包括特定區(qū)域的亞片段，這種亞片段保留其從中產(chǎn)生的區(qū)域的功能。
[0165]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“引物”是指在一些實(shí)施方案中包含外顯子或內(nèi)含子區(qū)域的兩或多個(gè)脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的序列，在一些實(shí)施方案中包含3個(gè)以上、8個(gè)以上及在一些實(shí)施方案中包含至少大約20個(gè)核苷酸。這種寡核苷酸在一些實(shí)施方案中長(zhǎng)度為10-30個(gè)喊基。
[0166]術(shù)語(yǔ)“純化的”是指所述對(duì)象以優(yōu)勢(shì)存在(即在摩爾基礎(chǔ)上其較組合物中任何其它各個(gè)物質(zhì)更豐富)?！凹兓糠帧笔侵敢环N組合物，其中所述對(duì)象包含至少大約50% (在摩爾基礎(chǔ)上)的所有存在的物質(zhì)。在確定溶液或分散液中物質(zhì)的純度中，其中所述物質(zhì)溶解或分散于其中的溶劑 或基質(zhì)通常不包括在這種確定中；相反，僅考慮溶解或分散的物質(zhì)(包括感興趣的物質(zhì)之一)。通常地，純化的組合物具有一種物質(zhì)，其包含所述組合物中存在的大約80%、85%、90%、95%、99%以上或更多的所有物質(zhì)。所述物質(zhì)可以純化為基本同質(zhì)的(通過常規(guī)檢測(cè)方法在所述組合物中不能檢測(cè)到污染物)，其中所述組合物基本上由一種物質(zhì)組成。多肽的純度可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法確定，包括例如氨基末端氨基酸序列分析、凝膠電泳和質(zhì)譜分析。
[0167]“參考序列”是指用作序列對(duì)比基礎(chǔ)的指定序列。參考序列可以是較大序列的亞類，例如全長(zhǎng)核苷酸或者氨基酸序列的一個(gè)節(jié)段，或者可以包含完整的序列。由于兩個(gè)蛋白質(zhì)均以是(I)包含與所述兩個(gè)蛋白質(zhì)相似的一個(gè)序列(即完整的蛋白質(zhì)序列的一部分)，及(2)可進(jìn)一步包含與所述兩個(gè)蛋白質(zhì)不同的一個(gè)序列，因此兩個(gè)(或多個(gè))蛋白質(zhì)之間的序列對(duì)比典型通過“對(duì)比窗”對(duì)比這兩個(gè)蛋白質(zhì)的序列(見上述)，以鑒別和對(duì)比呈現(xiàn)序列相似性的局部區(qū)域。
[0168]術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”在本說明書中是一個(gè)專業(yè)術(shù)語(yǔ)，是指為影響編碼序列和非編碼序列的表達(dá)所必需或希望的多核苷酸序列，如起始信號(hào)、增強(qiáng)子、調(diào)節(jié)子、啟動(dòng)子和終止序列，所述調(diào)節(jié)序列與所述編碼序列和非編碼序列可操縱地連接。調(diào)節(jié)序列的例子在Goeddel，199043中描述，包括例如猿病毒4040 (SV40)的早期和晚期啟動(dòng)子、腺病毒或巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子、CMV最小啟動(dòng)子、Iac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)、T7啟動(dòng)子(其表達(dá)由T7RNA聚合酶指導(dǎo))、噬菌體λ的主要操縱子和啟動(dòng)子、fd外殼蛋白的控制區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶或者其它糖解酶的啟動(dòng)子、酸性磷酸酶的啟動(dòng)子例如Pho5、酵母a-交配因子的啟動(dòng)子、桿狀病毒系統(tǒng)的多角體蛋白啟動(dòng)子，及已知控制原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒的基因表達(dá)的其它序列，以及這些序列的各種組合。這種控制序列的性質(zhì)和應(yīng)用根據(jù)宿主生物體而可以不同。在原核生物中，這種調(diào)節(jié)序列通常包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”最小限度包括其存在可以影響表達(dá)的成分，且也可以包括其存在是有利的其它成分，例如前導(dǎo)序列和融合配體序列。[0169]在某些實(shí)施方案中，多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子序列(或者其它調(diào)節(jié)序列)的控制下，所述啟動(dòng)子序列控制所述多核苷酸在指定類型細(xì)胞中的表達(dá)。也應(yīng)理解所述多核苷酸可以在調(diào)節(jié)序列的控制下，所述調(diào)節(jié)序列與控制天然發(fā)生形式的多核苷酸的表達(dá)的那些序列相同或不同。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列選自CMV最小啟動(dòng)子、肌酸激酶(MCK)、及α-肌球蛋白重鏈(MHC)啟動(dòng)子。例如，肌酸激酶(MCK)啟動(dòng)子指導(dǎo)骨骼肌中基因表達(dá)，可以用于在組織包括骨骼肌組織中表達(dá)miRNA，例如miR-1、miR-133或miR-206，使用目前可以利用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行。應(yīng)理解不需要應(yīng)用針對(duì)任何啟動(dòng)子鑒別的全部啟動(dòng)子(例如本文列出的啟動(dòng)子)，可以使用其功能衍生物。如本文所用，短語(yǔ)“功能衍生物”是指一種核酸序列，其包含足以指導(dǎo)另一個(gè)可操縱地連接的核酸分子轉(zhuǎn)錄的序列。正是如此，“功能衍生物”可以作為最小啟動(dòng)子而起作用。
[0170]多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的終止典型由可操縱地連接的轉(zhuǎn)錄終止序列(例如RNA聚合酶III終止序列)調(diào)節(jié)。在某些情況中，轉(zhuǎn)錄終止子對(duì)于校正mRNSA聚腺苷酸化也起作用。所述3’非轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)DNA序列在一些實(shí)施方案中包括大約50-1，000、100-1，000個(gè)核苷酸堿基對(duì)，且含有轉(zhuǎn)錄和翻譯終止序列。在一些實(shí)施方案中，RNA聚合酶III終止序列包含核苷酸序列TTTTTTT。
[0171]術(shù)語(yǔ)“報(bào)道基因”是指一種核酸，其包含編碼可易于檢測(cè)其存在或活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，包括但非限于螢光素酶、熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、β -半乳糖苷酶、分泌的胎盤堿性磷酸酶、β -內(nèi)酰胺酶、人生長(zhǎng)激素，及其它分泌的酶報(bào)道基因。通常地，報(bào)道基因編碼不是由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的一種多肽，其通過細(xì)胞分析可以檢測(cè)到，例如通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行直接熒光分析、放射性同位素分析或者分光光度分析，及典型不需要?dú)⑺兰?xì)胞進(jìn)行的信號(hào)分析。在某些情況中，報(bào)道基因編碼一種酶，其導(dǎo)致宿主細(xì)胞的熒光性質(zhì)發(fā)生改變，這可通過定性、定量或者半定量功能或者轉(zhuǎn)錄激活而檢測(cè)。所述酶的例子包括酯酶、β -內(nèi)酰胺酶、磷酸酶、過氧化物酶、蛋白酶(組織纖溶酶原激活物或尿激酶)，及可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的或者未來將揭示的合適的生色或熒光底物檢測(cè)其功能的其它酶。
[0172]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“測(cè)序”是指使用常規(guī)的人工或自動(dòng)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)確定DNA、RNA或者蛋白質(zhì)靶樣本的核酸或氨基酸的有序線性序列。
[0173]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基本純的”是指所述多核苷酸或多肽基本上沒有與其在天然狀態(tài)下關(guān)聯(lián)的序列和分子及分離步驟中使用的那些分子。術(shù)語(yǔ)“基本行沒有”是指在一些實(shí)施方案中所述樣本中至少50 %、70 %、80 %和90 %沒有與其自然狀態(tài)下關(guān)聯(lián)的材料和化合物。
[0174]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“靶細(xì)胞”是指其中希望插入核酸序列或多肽或者另外在已知未修飾的細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行修飾的細(xì)胞。導(dǎo)入靶細(xì)胞中的核酸序列可以是可變長(zhǎng)度。另外，核酸序列可以作為質(zhì)?；蚱渌d體的一種成分或者作為裸序列進(jìn)入靶細(xì)胞中。
[0175]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“靶基因‘是指一種基因，使用本發(fā)明的方法和組合物靶向于其加以調(diào)節(jié)。因此，靶基因包含一個(gè)核酸序列，所述核酸序列的表達(dá)水平(在mRNA或者多肽水平)由miRNA負(fù)調(diào)節(jié)。相似地，術(shù)語(yǔ)“靶RNA”或者“靶mRNA”是指靶基因的轉(zhuǎn)錄物，miRNA與其結(jié)合，導(dǎo)致調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。所述靶基因可以是衍生自細(xì)胞的基因、內(nèi)源基因、轉(zhuǎn)基因、外源基因如病原體基因，例如在感染后存在于細(xì)胞中的病毒。含有靶基因的細(xì)胞可以衍生自或者包含在任何生物體中，例如植物、動(dòng)物、原生動(dòng)物、病毒、細(xì)菌或者真菌中。
[0176]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄”是指一個(gè)細(xì)胞過程，包括RNA聚合酶與基因的相互作用，指導(dǎo)所述基因的編碼序列中存在的結(jié)構(gòu)信息的RNA表達(dá)。所述過程包括但非限于如下步驟:(a)轉(zhuǎn)錄開始；(b)轉(zhuǎn)錄物延長(zhǎng)；(C)轉(zhuǎn)錄物剪接；(d)轉(zhuǎn)錄物加帽；(e)轉(zhuǎn)錄終止；(f)轉(zhuǎn)錄物聚腺苷酸化；(g)轉(zhuǎn)錄物的核輸出；(h)轉(zhuǎn)錄物編輯 '及(i)穩(wěn)定所述轉(zhuǎn)錄物。
[0177]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄因子”是指胞質(zhì)或核蛋白，其結(jié)合基因，或者結(jié)合基因的RNA轉(zhuǎn)錄物，或者結(jié)合另一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)結(jié)合一個(gè)基因或RNA轉(zhuǎn)錄物或者反過來結(jié)合基因或RNA轉(zhuǎn)錄物的另一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)所述基因的表達(dá)。這種調(diào)節(jié)可另外通過其它機(jī)制實(shí)現(xiàn)；“基因的轉(zhuǎn)錄因子”的含義是指以一些方式改變所述基因的轉(zhuǎn)錄水平的因子。
[0178]術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”是指在受體細(xì)胞中導(dǎo)入核酸，例如表達(dá)載體，在某些情況中包括核酸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”是指其中細(xì)胞基因型由于細(xì)胞吸收外源核酸的結(jié)果而改變的過程。例如，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可表達(dá)本發(fā)明的miRNA。
[0179]如本文所用，概率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中“顯著性”或者“顯著的”是描述兩或多個(gè)實(shí)體之間存在非隨機(jī)的關(guān)聯(lián)性。為了確定一種關(guān)系是否是“顯著性”或者具有“顯著性”，可以對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以計(jì)算概率，以P值表示。這些P值低于自定義的截?cái)帱c(diǎn)則認(rèn)為是顯著的。在一個(gè)實(shí)施例中，認(rèn)為P值低于或等于0.05具有顯著性，在一些實(shí)施方案中，認(rèn)為P值低于0.01具有顯著性，在一些實(shí)施方案中，認(rèn)為P值低于0.005具有顯著性，在一些實(shí)施方案中，認(rèn)為P值低于0.001具有顯著性。 [0180]如本文所用，短語(yǔ)“靶RNA”是指作為調(diào)節(jié)靶位的一種RNA分子(例如編碼基因產(chǎn)物的mRNA分子)。在一些實(shí)施方案中，所述靶RNA由靶基因編碼。相似地，短語(yǔ)“靶位點(diǎn)”是指靶RNA內(nèi)的序列，其被“靶向”由miRNA構(gòu)建體介導(dǎo)裂解，所述miRNA構(gòu)建體在其反義鏈中含有與靶位點(diǎn)互補(bǔ)的序列。也相似地，短語(yǔ)“靶細(xì)胞”是指表達(dá)靶RNA且其中導(dǎo)入指定miRNA的細(xì)胞。靶細(xì)胞在一些實(shí)施方案中是肌細(xì)胞。
[0181]如果一種miRNA與一種RNA分子具有足夠的核苷酸相似性，則所述miRNA “靶向”所述RNA分子，預(yù)期其在足以使得所述miRNA與所述RNA分子相互作用的條件下調(diào)節(jié)所述RNA的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中,所述相互作用發(fā)生在肌細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，所述相互作用在生理學(xué)條件下發(fā)生。如本文所用，短語(yǔ)“生理學(xué)條件”是指在體內(nèi)肌細(xì)胞內(nèi)條件，無論該肌細(xì)胞是對(duì)象的一部分還是對(duì)象的組織，或者該肌細(xì)胞正在體外生長(zhǎng)。因此，如本文所用，短語(yǔ)“生理學(xué)條件”是指作為對(duì)象的一部分或者當(dāng)在體外生長(zhǎng)時(shí)的肌細(xì)胞內(nèi)的所述肌細(xì)胞可以暴露于其下的任何條件。
[0182]如本文所用，短語(yǔ)“可檢測(cè)水平的裂解”是指靶RNA的裂解程度(及裂解產(chǎn)物RNA的形成)，其足以使得可以在靶RNA的隨機(jī)降解產(chǎn)生的RNA背景之上檢測(cè)到裂解產(chǎn)物。miRNA-介導(dǎo)的裂解產(chǎn)物從至少1-5%的靶RNA中的產(chǎn)生足以使得可以在大多數(shù)檢測(cè)方法的背景之上進(jìn)行檢測(cè)。
[0183]術(shù)語(yǔ)“mi croRNA ”和“miRNA ”可互換應(yīng)用，是指大約17_24個(gè)核苷酸的核酸分子，其從pr1-miRNA、pre_miRNA或者其功能等價(jià)物中產(chǎn)生。miRNA與小干擾RNA(siRNAs)相反，盡管在外源供應(yīng)miRNA和SiRNA的情況中這種差別也許是人為的。所述差別是miRNA是核酸酶活性對(duì)于如本文已經(jīng)描述的發(fā)夾分子的產(chǎn)物，siRNA可以從完全雙鏈的RNA分子或者發(fā)夾分子中產(chǎn)生。關(guān)于miRNA的進(jìn)一步的信息以及已知的公開的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)和該數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索工具可見于并入本文作參考的Wellcome Trust Sanger InstitutemiRBase: !Sequences website 所述。也見于并入本文作參考的 ThemicroRNA Registry,Griffiths-Jones S.，NAR, 2004, 32, Database Issue, D109-D111 所述。
[0184]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“RNA”是指包含至少一個(gè)核糖核苷酸殘基的分子?！昂颂呛塑账帷笔侵冈讦?D-呋喃核糖成分的2’位置具有羥基基團(tuán)的核苷酸。該術(shù)語(yǔ)涵蓋了雙鏈RNA、單鏈RNA、具有雙鏈區(qū)和單鏈區(qū)的RNA、分離的RNA如部分純化的RNA、基本純的RNA、合成的RNA及重組產(chǎn)生的RNA。因此，RNA包括但非限于mRNA轉(zhuǎn)錄物、miRNA和miRNA前體，及siRNAs。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“RNA”也涵蓋了改變的RNA或者RNA類似物，這是通過添加、缺失、取代和/或改變一或多個(gè)核苷酸而與天然發(fā)生的RNA而有所不同的RNA。這種改變可以包括在如RNA的末端或內(nèi)部例如RNA的一或多個(gè)核苷酸處添加非核苷酸材料。本發(fā)明的RNA分子中的核苷酸也可以包含不標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸，如非天然發(fā)生的核苷酸或者化學(xué)合成的核苷酸或者脫氧核苷酸。這些改變的RNA可以稱作類似物或者天然發(fā)生的RNA的類似物。
[0185]如本文所用，短語(yǔ)“雙鏈RNA”是指一種RNA分子，其至少一部分是形成雙鏈體的Watson-Crick堿基對(duì)。由此，該術(shù)語(yǔ)涵蓋了完全或者僅部分雙鏈的RNA分子。雙鏈RNA的例子包括但非限于包含至少兩個(gè)獨(dú)特RNA鏈的分子，其通過分子間雜交而部分或全部形成雙鏈。另外，該術(shù)語(yǔ)還包括通過分子內(nèi)雜交可以形成雙鏈區(qū)(例如發(fā)夾)的一個(gè)RNA分子。因此，如本文所用，短語(yǔ)“分子間雜交”和“分子內(nèi)雜交”是指雙鏈分子，其中參與雙鏈體形成的核苷酸分別存在于不同分子或相同分子上。
[0186]如本文所用，短語(yǔ)“雙鏈區(qū)”是指通過核苷酸之間的氫鍵形成的雙鏈構(gòu)象的核酸分子的任何區(qū)域及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它核酸雙鏈體，所述核苷酸之間的氫鍵包括但非限于胞嘧啶與鳥苷、腺苷與胸苷、腺苷與尿嘧啶之間的氫鍵。雙鏈區(qū)的長(zhǎng)度可以是大約15個(gè)連續(xù)堿基對(duì)至幾 千個(gè)堿基對(duì)。在一些實(shí)施方案中，所述雙鏈區(qū)為至少15個(gè)堿基對(duì)，在一些實(shí)施方案中是15至300個(gè)、15至大約60個(gè)堿基對(duì)。如上文所述，雙鏈區(qū)的形成得自互補(bǔ)RNA鏈的雜交(例如有義鏈與反義鏈的雜交)，通過分子間雜交(即包含2或多個(gè)獨(dú)特的RNA分子)或者通過分子內(nèi)雜交形成，當(dāng)一個(gè)RNA分子含有能在同一 RNA分子上彼此雜交的自身互補(bǔ)區(qū)時(shí)可發(fā)生后者的雜交。這些自身互補(bǔ)區(qū)典型由一段短核苷酸序列(例如大約5-10個(gè)核苷酸)分隔，由此形成本領(lǐng)域稱作“發(fā)夾”或“莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的”分子內(nèi)雜交。
[0187]II1:核酸
[0188]本發(fā)明中應(yīng)用的核酸分子包括編碼肌細(xì)胞基因產(chǎn)物的核酸分子，以及本發(fā)明中用于調(diào)節(jié)肌細(xì)胞基因表達(dá)的核酸分子(例如miRNA核酸分子)。因此，本發(fā)明中應(yīng)用的核酸分子包括但非限于本文描述的核酸分子。例如，本發(fā)明中應(yīng)用的核酸分子包括但非限于:miR-l(UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA，SEQ ID NO:1), miR-133(UUG⑶CCCCUUCAACCAGCUGU，SEQ ID NO:2) , miR-206 (UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG，SEQ ID NO:3),miR-208(AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU，SEQ ID NO:4)，miR-22(AAGCUGCCA⑶UGAAGAACU⑶，SEQ ID NO:5)，miR-26(UUCAAGUAAUyCAGGAUAGGy(U)，SEQ ID NO:6)，miR-29(UAGCACCAUyUGAAAUCrGU(kUU)，SEQ ID NO:7)，miR-30(ykUwmAswysshhswyUvnvv(bC)，SEQ ID NO:8)，miR-128(UCACAGUGAACCG⑶CUCUUUy，SEQ ID NO:9)，miR-143(UGAGAUGAAGCACUGUAGCUCA，SEQ ID NO:10)和 miR-145(⑶CCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU，SEQ ID NO:11);及與這些序列基本相同的序列(例如在一些實(shí)施方案中，與SEQ ID NO:1-11任一序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的序列);及這些序列的亞序列和延長(zhǎng)的序列。本發(fā)明還涵蓋了包含所述核酸序列的基因、cDNA、錢和基因和載體。
[0189]上文及本文別處應(yīng)用的單字母表示的核苷酸代碼根據(jù)并入本文作參考的WIPOStandard ST.25(1998)，Appendix2, Tablel, (Μ.P.Ε.P.2422，Tablel)而定。特別地，如下表1示出了單字母代碼表示的相關(guān)核苷酸。括號(hào)中的核苷酸(例如(η))是指可以存在或不存在的核苷酸。另外，圖21列出了基于SEQ ID NO:5_11核苷酸排列的SEQ ID NO:5_11的各個(gè)可能序列。
[0190]表1:單字母代碼的核苷酸縮寫
[0191]
【權(quán)利要求】
1.有效量的miR-206多核苷酸在制備用于治療對(duì)象中肌損傷的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述肌損傷得自機(jī)械性肌創(chuàng)傷、肌組織退行性疾病、心肌損傷或者其組合。
3.權(quán)利要求2的用途，其中所述肌組織退行性疾病是肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病、炎癥性肌病、神經(jīng)肌肉接頭病變、內(nèi)分泌性肌病、或代謝性肌病。
4.權(quán)利要求3的用途，其中所述肌營(yíng)養(yǎng)不良癥是Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良癥。
5.權(quán)利要求1的用途，其中所述miR-206多核苷酸包含miR-206前體序列。
6.權(quán)利要求1的用途，其中所述miR-206多核苷酸包含SEQID NO:3的序列。
7.權(quán)利要求1的用途，其中所述miR-206多核苷酸由載體編碼。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述載體包含: (a)與編碼所述miR-206多核苷酸的核酸分子可操縱地連接的啟動(dòng)子；及 (b)轉(zhuǎn)錄終止序列。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子。
10.權(quán)利要求8的 用途，其中所述啟動(dòng)子是肌酸激酶啟動(dòng)子。
11.權(quán)利要求7的用途，其中所述載體是病毒載體。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或者腺病毒載體。
13.增加肌細(xì)胞分化、或抑制肌細(xì)胞增殖的體外方法，所述方法包括將肌細(xì)胞與miR-206多核苷酸接觸。
14.權(quán)利要求13的體外方法，其中所述miR-206多核苷酸包含miRNA前體序列。
15.權(quán)利要求13的體外方法，其中所述miR-206多核苷酸包含SEQID NO:3的序列。
16.權(quán)利要求13的體外方法，其中所述miR-206多核苷酸由載體編碼。
17.權(quán)利要求16的體外方法，其中所述載體包含: (a)與編碼所述miR-206多核苷酸的核酸分子可操縱地連接的啟動(dòng)子'及 (b)轉(zhuǎn)錄終止序列。
18.權(quán)利要求17的體外方法，其中所述啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子。
19.權(quán)利要求17的體外方法，其中所述啟動(dòng)子是肌酸激酶啟動(dòng)子。
20.權(quán)利要求16的體外方法，其中所述載體是病毒載體。
21.權(quán)利要求20的體外方法，其中所述病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或者腺病毒載體。
22.有效量的miR-145的抑制劑在制備用于治療對(duì)象中肌損傷的藥物中的用途，其中所述抑制劑包含與miR-145序列互補(bǔ)的多核苷酸。
23.權(quán)利要求22的用途，其中所述肌損傷得自機(jī)械性肌創(chuàng)傷、肌組織退行性疾病、心肌損傷或者其組合。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述肌組織退行性疾病是肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病、炎癥性肌病、神經(jīng)肌肉接頭病變、內(nèi)分泌性肌病、或代謝性肌病。
25.權(quán)利要求24的用途，其中所述肌營(yíng)養(yǎng)不良癥是Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良癥。
26.權(quán)利要求22的用途，其中所述多核苷酸包含與SEQIDNO:11的序列至少90%互補(bǔ)的序列。
27.權(quán)利要求22的用途，其中所述多核苷酸包含與SEQID NO:11的序列完全互補(bǔ)的序列。
28.權(quán)利要求22的用途，其中所述多核苷酸是2’-O-甲基修飾的多核苷酸。
29.調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化和/或增殖的體外方法，所述方法包括將肌細(xì)胞與miR-145的抑制劑接觸，其中所述抑制劑包含與miR-145序列互補(bǔ)的多核苷酸。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述多核苷酸包含與SEQIDNO:11的序列至少90%互補(bǔ)的序列。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述多核苷酸包含與SEQID NO:11的序列完全互補(bǔ)的序列。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述多核苷酸是2’-O-甲基修飾的多核苷酸。
33.權(quán)利要求29的方法，其中在與miR-145的抑制劑接觸后，所述肌細(xì)胞的分化或增殖被抑制。
34.用于調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中基因表達(dá)的體外方法，所述方法包括將肌細(xì)胞與miR-145的抑制劑接觸，其中所述抑制劑包含與miR-145序列互補(bǔ)的多核苷酸。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述調(diào)節(jié)是增加基因表達(dá)。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述基因是肌細(xì)胞分化基因或肌細(xì)胞增殖基因。
37.權(quán)利要求3 4的方法，其中所述多核苷酸包含與SEQIDNO:11的序列至少90%互補(bǔ)的序列。
38.權(quán)利要求34的方法，其中所述多核苷酸包含與SEQID NO:11的序列完全互補(bǔ)的序列。
39.權(quán)利要求34的方法，其中所述多核苷酸是2’-O-甲基修飾的多核苷酸。
【文檔編號(hào)】A61P9/00GK104027818SQ201410112733
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2006年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2005年12月12日
【發(fā)明者】王大之, 陳健夫 申請(qǐng)人:北卡羅來納大學(xué)查珀?duì)栂柗中?br>