一種白癜風(fēng)動物模型的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種白癜風(fēng)動物模型的構(gòu)建方法，所述白癜風(fēng)動物模型按如下方法構(gòu)建：用質(zhì)量濃度20～60%莫諾苯宗溶液或乳化制劑，在小鼠背部涂藥，涂藥量以莫諾苯宗計(jì)為每平方厘米的體表面積予以5～20mg，然后在小鼠使用莫諾苯宗溶液或乳化制劑部位的皮下注射胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸溶液，隔三天一次，每次注射量以胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸質(zhì)量計(jì)為10～15μg/g體重，經(jīng)過21～50天的培養(yǎng)即造模成功；本發(fā)明提供了一種簡單方便的白癜風(fēng)動物模型構(gòu)建方法，為白癜風(fēng)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供了研究基礎(chǔ)。
【專利說明】一種白癜風(fēng)動物模型的構(gòu)建方法
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及利用莫諾苯宗聯(lián)合胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸(cytosine-phophate-guanine oligodeoxynucleotide, CpG 0DN)誘導(dǎo)小鼠白癒風(fēng)模型的構(gòu)建方法。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]白癜風(fēng)是一種皮膚T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，以為局部或泛發(fā)性色素脫失為主要表現(xiàn)。近年來白癜風(fēng)發(fā)病率逐年上升，其病因尚未明確，發(fā)病機(jī)制學(xué)說眾多，如自身免疫學(xué)說、黑素細(xì)胞自身破壞學(xué)說、神經(jīng)化學(xué)因子學(xué)說、黑素細(xì)胞生長因子缺乏學(xué)說、遺傳因素等。很多學(xué)者在白癜風(fēng)實(shí)驗(yàn)研究方面做了大量的工作，取得了很大進(jìn)展，建立合理的白癜風(fēng)動物模型有助于我們更加深入研究白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制和防治措施。
[0003]莫諾苯宗的脫色作用主要是通過酪氨酸酶與活性氧自由基(reactive oxygenspecies, R0S)的相互作用完成。起初通過黑素小體自噬作用和酪氨酸酶的泛素化作用，提呈黑素小體相關(guān)抗原并在表面產(chǎn)生MHC (主要組織相容性復(fù)合物)I和II分子，直接誘導(dǎo)⑶8+T和⑶4+T反應(yīng)，形成黑素細(xì)胞特異性抗體，這一現(xiàn)象在白癜風(fēng)患者體內(nèi)可觀察到。此外，低水平表達(dá)的ROS可以加快外源性抗原分泌物的排泄，從而促進(jìn)樹突細(xì)胞提呈黑素細(xì)胞特異性抗原，形成CD8+T細(xì)胞自身抗原；莫諾本宗接觸皮膚后形成的醌半抗原可能激活自身免疫反應(yīng)，NLRP3的病毒相關(guān)性抗原觸發(fā)炎癥反應(yīng)，并且在局部有樹突細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞，這種自身免疫反應(yīng)激活DCs分泌TLR-7和TLR-9及角質(zhì)形成細(xì)胞分泌TLR-9。ROS可能間接促進(jìn)來自莫諾苯宗暴 露細(xì)胞的ATP釋放，進(jìn)一步促進(jìn)局部DC刺激病毒感染相關(guān)抗原引起NLRP3炎癥反應(yīng)，這些促炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子激活NK細(xì)胞作用。半抗原特異性CD8+T細(xì)胞通過殺滅處于表面的莫諾本宗暴露的黑素細(xì)胞，這些黑素細(xì)胞分解碎片并被吞噬細(xì)胞攝取，從而增加血清中抗原特異性抗體形成免疫復(fù)合物，通過溶解莫諾本宗暴露細(xì)胞和釋放相關(guān)細(xì)胞因子，引起遠(yuǎn)處出現(xiàn)免疫反應(yīng)。
[0004]CpG就是其中的一種新型佐劑，是人工合成的以未甲基化的CpG 二核苷酸為核心的寡核苷酸序列，CpG除對非特異性免疫有影響外，還能提高共免疫抗原的特異性免疫應(yīng)答，不僅提高細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，而且能提高免疫球蛋白的產(chǎn)量，因而已引起人們的廣泛關(guān)注。CpG可能直接活化B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)它們分泌IL-6、IL-12和TNF_a等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子激活B、T細(xì)胞或受Thl型細(xì)胞因子的作用，使機(jī)體特異性細(xì)胞與體液免疫反應(yīng)同時(shí)增強(qiáng)?；谝陨?，我們通過莫諾苯宗聯(lián)合CPG誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生白癜風(fēng)具有可行性。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供一種新的白癜風(fēng)動物模型，特別是利用莫諾苯宗和胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸構(gòu)建白癜風(fēng)動物模型。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0007]本發(fā)明提供一種白癜風(fēng)動物模型的構(gòu)建方法，所述白癜風(fēng)動物模型按如下方法構(gòu)建:用質(zhì)量濃度20~60%莫諾苯宗乳膏溶液或乳化制劑(所述溶液或乳化制劑是指能夠溶解莫諾苯宗且對皮膚無其他副作用的介質(zhì))，在小鼠背部涂藥，每日一次，涂藥量以莫諾苯宗質(zhì)量計(jì)為每平方厘米的體表面積予以5-20mg (優(yōu)選5~15mg)，然后在小鼠使用莫諾苯宗溶液或乳化制劑部位的皮下注射胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸溶液(CPG)JS三天一次，每次注射量以胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸質(zhì)量計(jì)為每克小鼠體重予以10~15 μ g，經(jīng)過21~50天的培養(yǎng)即造模成功；所述CPG溶液是將CPG用pH值為7.4的PBS緩沖液配置成CPG溶液。
[0008]進(jìn)一步，優(yōu)選所述莫諾苯宗乳化制劑為水包油型莫諾苯宗乳膏。
[0009]進(jìn)一步，所述水包油型莫諾苯宗乳膏質(zhì)量組成為:莫諾苯宗200~600g，硬脂酸27g,十八醇27g,液體石臘54.15g，月桂氮卓酮6.075g,三乙醇胺2.1g,甘油104.325g,輕苯乙酯0.3g，乙二胺四乙酸二鈉0.3g，蒸餾水補(bǔ)足至1000g。
[0010]進(jìn)一步，所述水包油型莫諾苯宗乳膏的質(zhì)量濃度優(yōu)選為35~40%，更優(yōu)選40%。
[0011]本發(fā)明所述水包油型莫諾苯宗乳膏按如下方法配制:按配方量，將乙二胺四乙酸二鈉、甘油、羥苯乙酯、三乙醇胺加入適量水中，在水浴上加熱至80°C左右，攪勻，制成水相，80°C保溫，備用；取莫諾苯宗、硬脂酸、十八醇、月桂氮卓酮與液體石蠟混合，加熱至80°C，攪勻，制成油相，80°C保溫。隨即將水相慢慢加入油相中，立即快速攪拌至凝，即得水包油型莫諾苯宗乳膏。 [0012]進(jìn)一步，優(yōu)選所述胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸溶液的濃度為lmg/ml。
[0013]更進(jìn)一步，本發(fā)明所述白癜風(fēng)動物模型推薦按如下方法構(gòu)建:用質(zhì)量濃度20~60%水包油型莫諾苯宗乳膏在小鼠背部涂藥，每日一次，每次涂藥量以莫諾苯宗質(zhì)量計(jì)為每平方厘米的體表面積予以5-15mg (更優(yōu)選10mg)，然后在小鼠使用莫諾苯宗乳膏部位的皮下注射胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸溶液，每隔三天一次，每次注射量以胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸質(zhì)量計(jì)為每克小鼠體重予以10 μ g，經(jīng)過21~50天的培養(yǎng)即造模成功；所述胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸溶液是將胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸用PH值為7.4的PBS緩沖液配置成lmg/ml溶液。
[0014]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供了一種簡單方便的白癜風(fēng)動物模型構(gòu)建方法，為白癒風(fēng)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供了研究基礎(chǔ)。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為實(shí)施例1中小鼠毛發(fā)脫色變化照片，a為III組鼠用藥部位脫色斑(圓圈處)，軀干的非用藥部位脫色斑(箭頭處)，b為III組小鼠尾部脫色斑(箭頭處)，C為I組，d為I組、II組、III組和IV組脫色發(fā)生率圖，d為I組、II組、III組和IV組脫色面積評分圖。
[0016]圖2為實(shí)施例1共聚焦激光掃描顯微鏡(RCM)觀察小鼠用藥部位黑色素及黑素細(xì)胞，a為I組(箭頭指示折光強(qiáng))，b為II組(箭頭指示折光弱)、c為III組(箭頭指示折光弱)和d為IV組(箭頭指示折光弱)。
[0017]圖3為實(shí)施例1小鼠脫色部位組織的HE染色照片，a為I組，b為II組、c為III組和d為IV組。
[0018]圖4為實(shí)施例1小鼠脫色部位⑶8+T細(xì)胞的浸潤情況，a為I組，b為II組、c為III組和d為IV組。
[0019]圖5為小鼠血清中IL-6、TNF_a、IFN_ Y、IL_13變化情況，a為IFN-Y變化情況，b為IL-6變化情況，c為IL-13變化情況，d為TNF- α變化情況。
[0020]圖6為實(shí)施例2中小鼠毛發(fā)脫色變化照片，a為III組鼠用藥部位脫色斑(圓圈處)，軀干的非用藥部位脫色斑(箭頭處)，b為III組小鼠尾部脫色斑(箭頭處)，C為I組。
[0021]圖7為實(shí)施例2共聚焦激光掃描顯微鏡(RCM)觀察小鼠用藥部位黑色素及黑素細(xì)胞，a為I組，b為II組，c為III組。
[0022]圖8為實(shí)施例2小鼠脫色部位⑶8+T細(xì)胞的浸潤情況，a為I組，b為II組，c為III 組。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0024]實(shí)施例1:
[0025]一、試劑及材料:
[0026]C57BL/6小鼠，雌性，體質(zhì)量(15±2)g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司[生產(chǎn)許可證號 SCXK (滬)2012-0002]。 [0027]質(zhì)量濃度40%莫諾苯宗乳膏質(zhì)量組成:莫諾苯宗400g，硬脂酸27g，十八醇27g，液體石臘54.15g，月桂氮卓酮6.075g,三乙醇胺2.1g,甘油104.325g,蒸懼水378.75g,輕苯乙酯0.3g，乙二胺四乙酸二鈉0.3g。
[0028]質(zhì)量濃度20%莫諾苯宗乳膏質(zhì)量組成為:莫諾苯宗200g，硬脂酸27g，十八醇27g，液體石臘54.15g，月桂氮卓酮6.075g,三乙醇胺2.1g,甘油104.325g,蒸懼水578.75g,輕苯乙酯0.3g，乙二胺四乙酸二鈉0.3g。
[0029]質(zhì)量濃度60%莫諾苯宗乳膏質(zhì)量組成為:莫諾苯宗600g，硬脂酸27g，十八醇27g，液體石臘54.15g，月桂氮卓酮6.075g,三乙醇胺2.1g,甘油104.325g,蒸懼水178.75g,輕苯乙酯0.3g，乙二胺四乙酸二鈉0.3g。
[0030]水包油乳膏基質(zhì)質(zhì)量組成:硬脂酸27g，十八醇27g，液體石蠟54.15g,月桂氮卓酮
6.075g，三乙醇胺2.lg，甘油104.325g，蒸餾水178.75g，羥苯乙酯0.3g，乙二胺四乙酸二鈉
0.3g0
[0031]CPG:生工生物工程(上海)股份有限公司
[0032]兔抗鼠CD8單克隆抗體:ZSGB-BIO公司；
[0033]FITC標(biāo)記羊抗兔二抗:ZSGB-B10公司；
[0034]IL-6、TNF- a、IFN- y、IL-13ELISA 試劑盒:MULTISENCES 公司；
[0035]皮膚共聚焦激光掃描顯微鏡(reflectance confocal microscopy, RCM),美國Lucid 公司，VIVASC0PE1500 型，波長 830nm，最大輸出 16.0mw ；
[0036]免疫突光共聚焦激光掃描顯微鏡(confocallaser scanning microscopy, CLSM):日本 OLYMPUS 公司，F(xiàn)luo View FV1000 型。
[0037]二、實(shí)驗(yàn)步驟
[0038](I)水包油型莫諾苯宗乳膏按如下方法配制:按配方量，將乙二胺四乙酸二鈉、甘油、羥苯乙酯、三乙醇胺加入適量水中，在水浴上加熱至80°C左右，攪勻，制成水相，80°C保溫，備用；取莫諾苯宗、硬脂酸、十八醇、月桂氮卓酮與液體石蠟混合，加熱至80°C，攪勻，制成油相，80°C保溫。隨即將水相慢慢加入油相中，立即快速攪拌至凝，即得水包油型莫諾苯
宗乳膏。
[0039]CPG溶液:將CPG用pH值為7.4的PBS緩沖液配制成lmg/ml溶液。
[0040](2)分組:C57BL/6小鼠40只，隨機(jī)分為陰性對照組(I組)、20wt%莫諾苯宗乳膏組(II組)、40?丨％莫諾苯宗乳膏組(III組)、60?丨％莫諾苯宗乳膏組(IV組)4個(gè)組，每組10只，脫去小鼠背部黑色毛2cmX2cm，涂藥。I組每天涂抹水包油乳膏基質(zhì)，II組每天涂抹20wt%莫諾苯宗乳膏，III組每天涂抹40wt%莫諾苯宗乳膏，IV組每天涂抹60wt%莫諾苯宗乳膏。I組、II組、III組和IV組每天涂抹一次乳膏，每次莫諾苯宗乳膏涂抹量為每平方厘米的體表面積予25mg，II組、III組和IV組涂藥后在小鼠使用莫諾苯宗乳膏部位的皮下注射lmg/ml的CPG溶液，隔三天一次，lmg/ml的CPG溶液每次注射量為每克小鼠體重予以IOul0各組小鼠用藥50天，完成模型的構(gòu)建。停藥后連續(xù)15天肉眼觀察小鼠毛發(fā)顏色和脫色面積變化，通過RCM觀察皮膚脫色。
[0041](3)毛發(fā)脫色評估:每日肉眼觀察毛發(fā)脫色，并進(jìn)行積分記錄。將脫色部位分為用藥部位和非用藥部位，每個(gè)部位總分為5分，每只小鼠共10分。小鼠毛發(fā)脫色評分標(biāo)準(zhǔn)為:
O分毛發(fā)無脫色:1分毛發(fā)有脫色> 0-10% ；2分毛發(fā)脫色面積> 10-25% ；3分毛發(fā)脫色面積> 25-50% ；4分毛發(fā)脫色面積> 50-75%:5分毛發(fā)脫色面積> 75_100%。 [0042](4)皮膚脫色觀察:激光共聚焦顯微鏡(RCM)使用的是一種波長為830nm的二極管激光，它的最大能力不超過35mW。物鏡的放大倍數(shù)為30倍。實(shí)時(shí)觀察建模前后小鼠正常區(qū)和脫色區(qū)皮膚處在同一層面進(jìn)行觀察皮膚內(nèi)黑素細(xì)胞，并拍照。
[0043](5)石蠟切片及HE染色:取小鼠非用藥部位脫色區(qū)域的皮膚，放入4%福爾馬林溶液固定，然后按照如下步驟進(jìn)行:①酒精梯度脫水:體積濃度75%乙醇水溶液、體積濃度85%乙醇水溶液、體積濃度95%乙醇水溶液、無水乙醇a、無水乙醇b，各45min。②透明:二甲苯a、二甲苯b，各30min。③浸蠟與包埋:將透明后的組織塊放入60°C的液體石蠟中浸泡40min，然后用包埋機(jī)包埋，包埋時(shí)將組織斷面朝下。④切片:厚度4μπι，展片，撈片，烤片(60°C,8h)。⑤脫臘:二甲苯a、二甲苯b,各5min。⑥水化:無水乙醇、體積濃度95%乙醇水溶液、體積濃度75%乙醇水溶液，各2min。⑦水洗:自來水浸泡5min，蘇木素染色2min。⑧
緩慢自來水洗2min。⑨分化:1%鹽酸酒精，30s，⑩自來水洗5min。伊紅染色5min。@脫
水體積濃度75%乙醇水溶液、體積濃度95%乙醇水溶液、無水乙醇a、無水乙醇b，各lmin。
@透明:二甲本2min。干后，樹脂封片。
[0044](6)免疫熒光共聚焦激光掃描顯微鏡檢測技術(shù)具體步驟:①用藥部位及其周圍的皮膚組織蠟塊在切片機(jī)上切為厚度為4μπι的薄片，掛片烤干后，切片常規(guī)脫蠟、水化。②蒸餾水沖洗2minX3次，PBS (pH值為7.4)浸泡5min。③石蠟切片置于微波爐中95°C微波抗原熱修復(fù)30min。蒸餾水沖洗2minX2次，PBS (pH值為7.4)沖洗2minX2次。擦去樣品周圍液體。④10%正常山羊血清封閉，室溫孵育30min，傾去血清，勿洗。⑤滴加兔抗鼠⑶8單克隆抗體(zsgb-bio公司)，4°C過夜。PBS沖洗，5minX3次。⑥滴加FITC標(biāo)記羊抗兔的二抗(zsgb-bio公司)。室溫反應(yīng)2h。PBS沖洗，5minX3次。90%甘油封片。盡量用薄的蓋玻片。用FluoView FVlOOO型免疫熒光共聚焦激光掃描顯微鏡檢測CD8+T細(xì)胞的熒光定量表達(dá)，采用單一綠色熒光通道觀察，在488nm波長以上掃描觀察。觀察并由計(jì)算機(jī)自帶掃描分析軟件測定，每張切片選取熒光表達(dá)最強(qiáng)的5個(gè)視野(200 X )中單位面積CD8+T細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。
[0045](7)血清細(xì)胞因子檢測:眼眶采血，分離血清，ELISA法分別測定IL_6、TNF-α、IFN- y , IL-13，按說明書嚴(yán)格操作。
[0046](8)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法
[0047]數(shù)據(jù)測定結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P < 0.05
為有顯著性差異。
[0048]三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0049]1.小鼠毛發(fā)脫色情況
[0050]1.1經(jīng)莫諾苯宗乳膏外用和CPG皮下注射，在用藥部位最先出現(xiàn)斑點(diǎn)狀的脫色，隨著用藥時(shí)間延長，脫色逐漸擴(kuò)大。隨之在非用藥部位(如面部，耳，尾及軀干的非用藥部位)出現(xiàn)針尖樣脫色，并融合擴(kuò)大(見圖1中a-b)。IV組小鼠在實(shí)驗(yàn)第4天用藥部位出現(xiàn)少量紅斑丘疹；實(shí)驗(yàn)第7天在用藥部位出現(xiàn)斑點(diǎn)狀脫色斑，且皮疹增加；實(shí)驗(yàn)第20天因用藥部位炎癥反應(yīng)嚴(yán)重，滲出多，被迫終止用藥。其余各組小鼠用藥50天，停藥繼續(xù)觀察15天，小鼠毛發(fā)脫色部位顏色和面積變化。
[0051]I組小鼠予以水包油乳膏基質(zhì)外用50天，未出現(xiàn)脫色斑(見圖1中C)。
[0052]1.2各組小鼠脫色的發(fā)生率和時(shí)間
[0053]II組、III組和IV組全部小鼠用藥部位出現(xiàn)脫色，隨著濃度的增加在非用藥部位的脫色發(fā)生率也隨之增加(見圖1中d)。
[0054]II組、III組和IV組小鼠的用藥部位最早出現(xiàn)脫色的時(shí)間分別為實(shí)驗(yàn)第18、10和7天出現(xiàn)脫色，且這三組小鼠的用藥部位出現(xiàn)脫色的平均時(shí)間取整數(shù)為20、12和10天。II組、III組和IV組小鼠的非用藥部位出現(xiàn)脫色的開始時(shí)間分別為實(shí)驗(yàn)第35，19和15天出現(xiàn)脫色，出現(xiàn)脫色的平均時(shí)間取整數(shù)為40、21和19天。
[0055]1.3各組小鼠脫色面積和穩(wěn)定性
[0056]II組、III組和IV組小鼠脫色面積評分用藥部位非用藥部位也隨著濃度增加而增加 (見圖1中e)。
[0057]且停藥15天發(fā)現(xiàn)II組小鼠大部分脫色不穩(wěn)定，該組小鼠均出現(xiàn)復(fù)色。III組小鼠大部分脫色穩(wěn)定，未出現(xiàn)復(fù)色，其中有5只小鼠軀干的非用藥部位脫色面積有擴(kuò)大跡象。IV組小鼠在實(shí)驗(yàn)第20天皮疹嚴(yán)重，被迫停藥，至實(shí)驗(yàn)第65天脫色區(qū)域未出現(xiàn)復(fù)色現(xiàn)象，皮疹完全消退。
[0058]從上可知，IV組因其濃度過高，引起用藥部位出現(xiàn)紅斑丘疹，因此我們認(rèn)為40%莫諾苯宗乳膏聯(lián)合lmg/mlCPG是最佳的造模濃度。
[0059]2.RCM觀察皮膚脫色
[0060]觀察皮膚的黑色素及黑素細(xì)胞顯示:I組小鼠皮膚可見色素正常，色素分布均勻，折光強(qiáng)(見圖2中a) ;I1、III和IV組小鼠非用藥區(qū)的脫色部位皮膚RCM表現(xiàn)可見色素缺失，折光弱，三組見無明顯差異(見圖2中b-d)。
[0061]3.組織病理[0062]3.1HE染色顯示:I組小鼠在真皮淺層有少量淋巴細(xì)胞浸潤(見圖3中a) ;11、III和IV組小鼠在真皮淺層有較多淋巴細(xì)胞浸潤(見圖3中b-d)。
[0063]3.2免疫熒光顯示:I組小鼠在真皮淺層有少量⑶8+T細(xì)胞浸潤(見圖4中a);I1、III和IV組小鼠在真皮淺層有較多⑶8+T細(xì)胞浸潤(見圖4中b-d)。
[0064]以上結(jié)果表明，莫諾苯宗聯(lián)合CPG處理誘導(dǎo)皮膚局部出現(xiàn)⑶8+T細(xì)胞浸潤，且⑶8+T細(xì)胞浸潤的程度與莫諾苯宗的處理濃度呈正相關(guān)。造模的三個(gè)組小鼠在皮膚局部出現(xiàn)淋巴細(xì)胞尤其是CD8+T細(xì)胞浸潤，提示出現(xiàn)脫色是因細(xì)胞免疫反應(yīng)的結(jié)果，這與人類白癜風(fēng)特點(diǎn)一致。
[0065]4.細(xì)胞因子
[0066]實(shí)驗(yàn)結(jié)束取血，對照組血清中TNF- α的含量(13.657±2.739)，II組為(56.89±7.61)，III 組為(130.75±8.56)，IV 組為(189.83±9.71)，三個(gè)模型組較對照組有明顯差異，P < 0.05。對照組血清中IFN- Y的含量(63.257±4.660)，II組為(158.32±10.63)，III 組為(234.85±14.61)，IV 組為(285.18±12.I7)，三個(gè)模型組較對照組有明顯差異，P < 0.05。對照組血清中IL-6的含量(73.54±6.93)，II組為(132.17±8.29)，III 組為(341.82± 10.53)，IV 組為(401.27±9.87)，三個(gè)模型組較對照組有明顯差異，P < 0.05。對照組血清中IL-13的含量(2.27±0.53)，II組為(19.52±3.16)，III 組為(38.03±4.18)，IV 組為(45.31 ±3.37)，三個(gè)模型組較對照組有明顯差異，P < 0.05。(見圖5)
[0067]以上結(jié)果表明，莫諾苯宗聯(lián)合CPG處理誘導(dǎo)皮膚后血清中TNF-a、IFN_Y、IL_6和IL-13均有不同程度的升高，且與莫諾苯宗的處理濃度呈正相關(guān)。提示出現(xiàn)脫色是通過細(xì)胞免疫和細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果，這與人類白癜風(fēng)特點(diǎn)一致。
[0068]實(shí)施例2:
[0069]一、試劑及材料:
[0070]C57BL/6小鼠，雌性，體質(zhì)量(15±2)g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司[生產(chǎn)許可證號 SCXK (滬)2012-0002]。
[0071]莫諾苯宗乳膏配方及制備同實(shí)施例1。
[0072]CPG:生工生物工程(上海)股份有限公司；
[0073]兔抗鼠CD8單克隆抗體:ZSGB-BIO公司；
[0074]FITC標(biāo)記羊抗兔二抗:ZSGB-B10公司；
[0075]IL-6、TNF- α、IFN- y、IL-13ELISA 試劑盒:MULTISENCES 公司；
[0076]0.05%鹵米松:香港澳美制藥廠；
[0077]皮膚共聚焦激光掃描顯微鏡(reflectance confocal microscopy, RCM),美國Lucid 公司，VIVASC0PE1500 型，波長 830nm，最大輸出 16.0mw ；
[0078]免疫突光共聚焦激光掃描顯微鏡(confocallaser scanning microscopy,CLSM):日本 OLYMPUS 公司，F(xiàn)luo View FV1000 型。
[0079]二、實(shí)驗(yàn)步驟
[0080](1)水包油型莫諾苯宗乳膏按如下方法配制同實(shí)施例1CPG溶液的配制同實(shí)施例1，水包油乳膏基質(zhì)同實(shí)施例1。
[0081](2)分組:C57BL/6小鼠30只，隨機(jī)分為陰性對照組(I組)、模型組(II組)、鹵米松組(III組)3個(gè)組，每組10只，脫去小鼠背部黑色毛2cmX2cm，涂藥。I組每天涂抹水包油乳膏基質(zhì)，II組每天涂抹40被％莫諾苯宗乳膏，III組每天分別涂抹40wt%莫諾苯宗乳膏和0.05%鹵米松。I組和II組每天涂抹一次，水包油乳膏基質(zhì)、莫諾苯宗乳膏每次涂抹量為每平方厘米的體表面積予以25mg，III組每天涂抹一次，40wt%莫諾苯宗乳膏和0.05%鹵米松每次涂抹量均為每平方厘米的體表面積予以25mg，II組和III組在小鼠使用莫諾苯宗乳膏部位的皮下注射lmg/ml CPG溶液，隔三天一次，每次注射量為10 μ 1/g體重。各組小鼠用藥50天，完成模型的構(gòu)建。停藥后連續(xù)15天肉眼觀察小鼠毛發(fā)顏色和脫色面積變化，通過RCM觀察皮膚脫色。 [0082](3)毛發(fā)脫色評估:每日肉眼觀察毛發(fā)脫色，并進(jìn)行積分記錄。將脫色部位分為用藥部位和非用藥部位，每個(gè)部位總分為5分，每只小鼠共10分。小鼠毛發(fā)脫色評分標(biāo)準(zhǔn)為:O分毛發(fā)無脫色:1分毛發(fā)有脫色> 0-10% ；2分毛發(fā)脫色面積> 10-25% ；3分毛發(fā)脫色面積> 25-50% ；4分毛發(fā)脫色面積> 50-75%:5分毛發(fā)脫色面積> 75_100%。
[0083](4)皮膚脫色觀察:激光共聚焦顯微鏡(RCM)使用的是一種波長為830nm的二極管激光，它的最大能力不超過35mW。物鏡的放大倍數(shù)為30倍。實(shí)時(shí)觀察建模前后小鼠正常區(qū)和脫色區(qū)皮膚處在同一層面進(jìn)行觀察皮膚內(nèi)黑素細(xì)胞，并拍照。
[0084](5)免疫熒光共聚焦激光掃描顯微鏡檢測技術(shù)具體步驟同實(shí)施例1。
[0085](6)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法同實(shí)施例1。
[0086]三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0087]1.模型組小鼠脫色情況用藥部位在實(shí)驗(yàn)第10天開始出現(xiàn)脫色毛發(fā)點(diǎn)狀簇集，第13天全部小鼠的用藥部位出現(xiàn)脫色，且脫色范圍逐漸擴(kuò)大，至第17天形成片狀(見圖6中a，紅色圓圈)，用藥50天，皮損擴(kuò)大并部分融合；軀干的非用藥部位在實(shí)驗(yàn)第19天開始出現(xiàn)毛發(fā)脫色(見圖6中a，箭頭)。至實(shí)驗(yàn)第50天，有7只小鼠在軀干部位有脫色，并7只尾巴部位出現(xiàn)粟粒大的脫色(見圖6中b)，5只耳朵上呈現(xiàn)針尖樣脫色；停藥后連續(xù)觀察15天，小鼠毛發(fā)脫色部位的顏色和面積變化。結(jié)果顯示小鼠脫色穩(wěn)定。
[0088]2.陰性對照組小鼠脫色情況陰性對照組小鼠予以莫諾苯宗乳膏的基質(zhì)外用50天后，未出現(xiàn)脫色(見圖6中C)。
[0089]3.鹵米松對脫色的發(fā)生率、時(shí)間和面積評分的影響
[0090]II組、III組全部小鼠用藥部位出現(xiàn)脫色，其非用藥部位脫色的發(fā)生率分別為70%、30%。
[0091]III組小鼠的用藥部位最早出現(xiàn)脫色的時(shí)間分別為實(shí)驗(yàn)第21天出現(xiàn)脫色，而II組在實(shí)驗(yàn)第10天開始出現(xiàn)脫色。且這組小鼠的用藥部位出現(xiàn)脫色的平均時(shí)間取整數(shù)為23天，較模型組明顯推遲。III組小鼠的非用藥部位出現(xiàn)脫色的開始時(shí)間分別為實(shí)驗(yàn)第35天出現(xiàn)脫色，而II組在實(shí)驗(yàn)第19天開始出現(xiàn)脫色。且這組小鼠的非用藥部位出現(xiàn)脫色的平均時(shí)間取整數(shù)為38天，較模型組明顯推遲。
[0092]III組小鼠的用藥部位脫色面積評分為2.03±0.63，模型組3.45±0.17，模型組、III組小鼠非用藥部位的脫色面積評分分別為1.9±0.12和1.05±0.32，小鼠脫色面積評分可知鹵米松治療后脫色面積明顯減小。
[0093]從脫色的發(fā)生率、時(shí)間和面積評分可見，鹵米松治療后可降低小鼠白癜風(fēng)的發(fā)生發(fā)展，延遲脫色的時(shí)間，脫色面積明顯縮小。[0094]4.RCM觀察皮膚脫色
[0095]觀察皮膚的黑色素及黑素細(xì)胞顯示:I組小鼠RCM顯示色素正常，色素分布均勻，折光強(qiáng)(見圖7中a) ；II組小鼠RCM顯示色素缺失，折光弱(見圖7中b)。III組小鼠RCM顯示樹突狀，折光明亮的黑素細(xì)胞(見圖7中c);
[0096]以上結(jié)果可知，經(jīng)過鹵米松治療后出現(xiàn)較多的樹突狀，折光明亮的黑素細(xì)胞，這一特點(diǎn)與臨床治療白癜風(fēng)有效患者的皮損表現(xiàn)一致。
[0097]5.皮膚組織的病理學(xué)改變
[0098]免疫熒光顯示:I組在真皮淺層有⑶8+T細(xì)胞有極少量浸潤(見圖8中a)，II組⑶8+T細(xì)胞浸潤明顯(見圖8中b)，III 組⑶8+T細(xì)胞浸潤較模型組略有減少(見圖8中C)。
[0099]從⑶8+T細(xì)胞在真表皮浸潤的情況可知，經(jīng)鹵米松治療后⑶8+T細(xì)胞浸潤明顯減少，這一特點(diǎn)符合臨床白癜風(fēng)治療特點(diǎn)。
【權(quán)利要求】
1.一種白癜風(fēng)動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于:所述白癜風(fēng)動物模型按如下方法構(gòu)建:用質(zhì)量濃度20~60%莫諾苯宗溶液或乳化制劑，在小鼠背部涂藥，涂藥量以莫諾苯宗計(jì)為每平方厘米的體表面積予以5~20mg，然后在小鼠使用莫諾苯宗溶液或乳化制劑部位的皮下注射胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸溶液，隔三天一次，每次注射量以胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸質(zhì)量計(jì)為10~15 μ g/g體重,經(jīng)過21~50天的培養(yǎng)即造模成功；所述胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸溶液是將胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸用PH值為7.4的PBS緩沖液配置成胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的白癜風(fēng)動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于:所述莫諾苯宗乳化制劑為水包油型莫諾苯宗乳膏。
3.如權(quán)利要求2所述的白癜風(fēng)動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述水包油型莫諾苯宗乳膏質(zhì)量組成為:莫諾苯宗200~600g、硬脂酸27g、十八醇27g、液體石蠟54.15g、月桂氮卓酮6.075g、三乙醇胺2.lg、甘油104.325g、輕苯乙酯0.3g、乙二胺四乙酸二鈉0.3g,蒸餾水補(bǔ)足至1000g。
4.如權(quán)利要求2所述白癜風(fēng)動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于:所述水包油型莫諾苯宗乳膏的質(zhì)量濃度為35~40%。
5.如權(quán)利要求3所述白癜風(fēng)動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于:所述水包油型莫諾苯宗乳膏按如下方法配制:按配方量，將乙二胺四乙酸二鈉、甘油、羥苯乙酯、三乙醇胺加入蒸餾水中，在水浴上加熱，攪勻，制成水相，80°C保溫；取莫諾苯宗、硬脂酸、十八醇、月桂氮卓酮與液體石蠟混合，加熱，攪勻，制成油相，80°C保溫；隨即將水相慢慢加入油相中，立即同方向攪拌至凝，即得莫諾苯宗水包油型乳膏。
6.如權(quán)利要求1所述白癜風(fēng)動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于:所述胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸溶液的濃度為lmg/ml。
7.如權(quán)利要求1所述的白癜風(fēng)動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于:所述白癜風(fēng)動物模型按如下方法構(gòu)建:用質(zhì)量濃度20~60%水包油型莫諾苯宗乳膏在小鼠背部涂藥，每日一次，每次涂藥量以莫諾苯宗質(zhì)量計(jì)為每平方厘米的體表面積予以5~15mg，然后在小鼠使用莫諾苯宗乳膏部位的皮下注射胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸溶液，每隔三天一次，每次注射量以胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸質(zhì)量計(jì)為每克小鼠體重予以10 μ g，經(jīng)過21~50天的培養(yǎng)即造模成功；所述胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸溶液是將胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸用PH值為7.4的PBS緩沖液配置成lmg/ml溶液。
【文檔編號】A61P17/00GK103919798SQ201410116500
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月26日
【發(fā)明者】許愛娥, 祝逸平 申請人:許愛娥, 祝逸平