小葉蓮中兩個(gè)具有降血脂活性的新異戊烯基化黃酮類化合物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及小葉蓮中兩個(gè)具有降血脂活性的新異戊烯基化黃酮類化合物的制備方法，有效解決快速從小葉蓮中制備兩個(gè)具有降血脂活性的新異戊烯基化黃酮的問題，包括如下步驟：（1）粗提取物的制備；（2）硅膠柱色譜初步分離；（3）高速逆流色譜純化，兩個(gè)新異戊烯基化黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)經(jīng)高分辨率質(zhì)譜、核磁共振氫譜、碳譜、二維譜進(jìn)行鑒定，本發(fā)明方法穩(wěn)定可靠，效率高，可快速從小葉蓮中分離得到兩個(gè)新的異戊烯基化黃酮類化合物，并經(jīng)活性試驗(yàn)表明可加速細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。
【專利說明】小葉蓮中兩個(gè)具有降血脂活性的新異戊烯基化黃酮類化合物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種小葉蓮中兩個(gè)具有降血脂活性的新異戊烯基化黃酮類化合物桃兒七酮A (sinoflavonoid A)和桃兒七酮B (sinoflavonoid B)的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]小葉蓮是小檗科桃兒七屬植物鬼臼Sinopodophyllum emodi (Wall.) Ying.的干燥成熟果實(shí)。鬼白是一種具有悠久歷史的藥用植物，古代《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載:殺大毒，療咳嗽喉疾，風(fēng)邪煩感，失魄妄見。不入湯。以后的歷代本草亦多有記載，主要用于活血散結(jié)、祛風(fēng)除濕、蟲蛇咬傷、跌打、心胃痛、風(fēng)寒咳嗽、月經(jīng)不調(diào)、鐵棒錘中毒、風(fēng)濕筋骨痛及氣管炎等癥。鬼白分布比較廣泛，我國主要分布在四川、青海、西藏、甘肅、陜西。小葉蓮作為傳統(tǒng)藏藥始載于《月王藥診》，具有悠久的藥用歷史。化學(xué)成分研究表明主要含有木脂素和黃酮類化合物，其中異戊烯基化黃酮類化合物是小葉蓮中代表性的活性成分，具有重要而廣泛的生物活性如抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗骨質(zhì)疏松、預(yù)防老年癡呆、抗糖尿病、心腦血管保護(hù)、雌激素樣等。中國發(fā)明專利CN102382092A和CN102335165A公開了小葉蓮中異戊烯基化黃酮的分離方法，采用反復(fù)的色譜方法如硅膠柱色譜、離心薄層色譜、S印hadexLH-20凝膠柱色譜、中低壓液相色譜、半制備高效液相色譜等方法，這些方法的不足之處是:分離周期長，溶劑消耗量大，樣品回收率低，分離效果不理想。高速逆流色譜是一種新型的無固相載體的連續(xù)液液分配色譜技術(shù)，近年來廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、中醫(yī)藥、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域活性成分的分離純化。高速逆流色譜技術(shù)不需要任何固態(tài)載體，避免樣品與固相載體的作用而產(chǎn)生樣品的變性、失活和不可逆吸附等，同時(shí)還具有高效、快速、樣品制備量大、回收率高、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明首次采用硅膠柱色譜法富集目標(biāo)成分，再用高速逆流色譜法分離純化，建立了小葉蓮中兩個(gè)痕量的異戍烯基化黃酮類化合物(sinoflavonoidA和sinoflavonoid B)的快速制備方法。該方法分離效率高、時(shí)間短，溶劑消耗量小，樣品回收率高，得到的目標(biāo)成分純度高`。現(xiàn)有方法中，尚未見硅膠柱色譜法和高速逆流色譜法相結(jié)合用于小葉蓮中異戍烯基化黃酮單體分離的有關(guān)技術(shù)報(bào)道?；衔飐inoflavonoid A和sinoflavonoid B為未見文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物。
[0003]高脂血癥是腦卒中、冠心病、心肌梗死、心臟猝死等獨(dú)立而重要的危險(xiǎn)因素，是嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病。目前臨床上廣泛使用的降血脂藥物主要包括HMG-COA還原酶抑制劑、貝特類等。由于多數(shù)合成藥基于單靶點(diǎn)的作用，對于高血脂癥的復(fù)雜的病因，很難取得理想的治療效果。中草藥在降血脂方面的應(yīng)用歷史悠久，從中草藥中尋找具有降血脂的活性物質(zhì)，研制特異性強(qiáng)、毒副作用小的新型藥物具有重要的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對上述情況，為克服現(xiàn)在技術(shù)缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種小葉蓮中兩個(gè)具有降血脂活性的新異戊烯基化黃酮類化合物的制備方法，可有效解決快速從小葉蓮中制備兩個(gè)具有降血脂活性的新異戊烯基化黃酮類化合物的問題。
[0005]本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，包括如下步驟:(1)粗提取物的制備；(2)硅膠柱色譜初步分離；(3)高速逆流色譜純化,兩個(gè)新異戍烯基化黃酮類化合物(sinoflavonoid A和sinoflavonoid B)的結(jié)構(gòu)經(jīng)高分辨率質(zhì)譜(HR-ES1-MS)、核磁共振氫譜(1H-NMR)、碳譜(13C-NMR)、二維譜(HSQC、HMBC)進(jìn)行鑒定，其中:
[0006]所述步驟(1)粗提取物的制備方法是，小葉蓮粉碎，過40目篩，每次用小葉蓮重量6-12倍量的體積濃度為95%的乙醇在55°C、40kHz、200w超聲提取3次，每次60min，合并乙醇提取液，減壓濃縮至無醇味，得濃縮物，加濃縮物重量體積10-15倍量的蒸餾水混懸，依次加入與混懸液等體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即為小葉蓮粗提取物；所述的重量體積是指固體物以g計(jì)，液體物以ml計(jì)，以下同，如濃縮物為Ig時(shí)，蒸懼水為10-15ml ；
[0007]所述步驟(2)硅膠柱色譜初步分離方法是:乙酸乙酯萃取部位的浸膏小葉蓮粗提取物經(jīng)硅膠柱色譜初步分離，采用體積比為10:1-5的石油醚-丙酮系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，流速為ISmLmirT1,每IOOmL為I個(gè)流份，收集含有目標(biāo)成分的流份，45°C減壓濃縮，得到含有目標(biāo)成分的總樣；
[0008]所述步驟(3)高速逆流色譜純化方法是:取步驟(2)得的含有目標(biāo)成分的總樣，用總樣重量體積10倍量的體積比為4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶劑系統(tǒng)，等體積取該混合溶劑系統(tǒng)中的上相溶劑和下相溶劑，對總樣進(jìn)行超聲溶解，得到樣品溶液，用高速逆 流色譜儀進(jìn)行純化，條件是:另取混合溶劑系統(tǒng)的上相為固定相、下相為流動(dòng)相，恒溫循環(huán)器的溫度為22-30°C，高速逆流色譜儀主機(jī)轉(zhuǎn)速750-1000r/min，流動(dòng)相流速1.0-2.0mLmin—1，兩相在高速逆流色譜儀的色譜柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品溶液，檢測波長254nm，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖分別收集目標(biāo)成分，減壓回收溶劑至干，得到兩個(gè)新的異戍烯基化黃酮類化合物sinoflavonoid A和sinoflavonoid B,經(jīng)高分辨率質(zhì)譜(HR-ES1-MS)、核磁共振氫譜(1H-NMR)、碳譜(13C-NMR)、二維譜(HSQC、HMBC)進(jìn)行鑒定，兩個(gè)新的異戍烯基化黃酮類化合物sinoflavonoid A和sinof lavonoid B的化學(xué)結(jié)
構(gòu)式分別為:
[0009]
【權(quán)利要求】
1.一種小葉蓮中兩個(gè)具有降血脂活性的新異戊烯基化黃酮類化合物的制備方法，其特征在于，小葉蓮中兩個(gè)具有降血脂活性的新異戊烯基化黃酮類化合物桃兒七酮A和桃兒七酮B的化學(xué)結(jié)構(gòu)式分別為:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小葉蓮中兩個(gè)具有降血脂活性的新異戊烯基化黃酮類化合物的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)、制備粗提取物，方法是:小葉蓮4.09kg粉碎，過40目篩，每次用小葉蓮重量8倍量的體積濃度為95%乙醇在55 °C、40kHz、200w條件下，超聲提取3次，每次60min，合并乙醇提取液，減壓濃縮至無醇味，加蒸餾水5L混懸，依次加入與混懸液等體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即為小葉蓮粗提取物； (2)、硅膠柱色譜初步分離，方法是:取小葉蓮粗提取物50.07g，加入SOmL丙酮溶解后，再加入100-200目的硅膠60g，45°C減壓回收丙酮，得到載有樣品的硅膠，取200-300目的硅膠1.94kg,加入石油醚7.5L,轉(zhuǎn)移到140cm長X8cm內(nèi)徑的色譜柱中，用體積比10:1的石油醚-丙酮平衡色譜柱，將液面降至距硅膠面20cm處，將上述載有樣品的硅膠加入到色譜柱的液面上，依次加入體積比為10:1、10: 3、10:5梯度的石油醚-丙酮系統(tǒng)，每個(gè)梯度15L，進(jìn)行梯度洗脫，流速為ISmLmirT1,每IOOmL作為I個(gè)流份收集，將收集的流份經(jīng)過TLC分析，合并含有目標(biāo)成分的流份，減壓濃縮，得到含有目標(biāo)成分的總樣，所述的TLC分析中使用的吸附劑為GF254，展開劑為體積比1:1的石油醚-丙酮； (3)、高速逆流色譜純化，方法是，取步驟(2)得的含有目標(biāo)成分的總樣，用總樣重量體積10倍量的體積比為4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶劑系統(tǒng)，等體積取該混合溶劑系統(tǒng)中的上相溶劑和下相溶劑，對總樣進(jìn)行超聲溶解，得到樣品溶液，用高速逆流色譜儀進(jìn)行純化，條件是:另取混合溶劑系統(tǒng)的上相為固定相、下相為流動(dòng)相，開啟恒溫循環(huán)器，溫度為25°C，用流速9.ggmLmin-1將固定相注入高速逆流色譜的色譜柱，待充滿整個(gè)色譜柱后，開啟高速逆流色譜儀主機(jī)，緩慢將主機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)整為800r/min，再以.1.7mLmin^流速注入流動(dòng)相，待流動(dòng)相從柱出口流出，兩相在色譜柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品溶液，254nm下檢測，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖分別收集目標(biāo)成分，減壓回收溶劑至干，得到兩種粉末狀sinoflavonoid A和sinoflavonoid B。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小葉蓮中兩個(gè)具有降血脂活性的新異戊烯基化黃酮類化合物的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)、制備粗提取物，方法是:小葉蓮4.05kg粉碎，過40目篩，每次用小葉蓮重量10倍量的體積濃度為95%乙醇在55°C、40kHz、200w條件下，超聲提取3次，每次60min，合并乙醇提取液，減壓濃縮至無醇味，加蒸餾水5L混懸，依次加入與混懸液等體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即為小葉蓮粗提取物； (2)、硅膠柱色譜初步分離，方法是，硅膠柱色譜初步分離方法是，取小葉蓮粗提取物50.01g，加入50mL丙酮溶解后，再加入100-200目的硅膠50g，45°C減壓回收丙酮，得到載有樣品的硅膠，取200-300 目的硅膠1.95kg，加入石油醚7.5L，轉(zhuǎn)移到140cm長X 8cm內(nèi)徑的色譜柱中，用體積比10:1的石油醚-丙酮平衡色譜柱，將液面降至距硅膠面20cm處，將上述載有樣品的硅膠加入到色譜柱的液面上，依次加入體積比為10:1、10:3、10:5梯度的石油醚-丙酮系統(tǒng)，每個(gè)梯度15L，進(jìn)行梯度洗脫，流速為ISmLmirT1,每IOOmL作為I個(gè)流份收集，將收集的流份經(jīng)過TLC分析，合并含有目標(biāo)成分的流份，減壓濃縮，得到含有目標(biāo)成分的總樣，所述的TLC分析中使用的吸附劑為GF254，展開劑為體積比1:1的石油醚-丙酮； (3)、高速逆流色譜純化，方法是，取步驟(2)得的含有目標(biāo)成分的總樣，用總樣重量體積10倍量的體積比為4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶劑系統(tǒng)，等體積取該混合溶劑系統(tǒng)中的上相溶劑和下相溶劑，對總樣進(jìn)行超聲溶解，得到樣品溶液，用高速逆流色譜儀進(jìn)行純化，條件是:另取混合溶劑系統(tǒng)的上相為固定相、下相為流動(dòng)相，開啟恒溫循環(huán)器，溫度為25°C，用流速9.ggmLmirT1，將固定相注入高速逆流色譜的色譜柱，待充滿整個(gè)色譜柱后，開啟高速逆流色譜儀主機(jī)，緩慢將主機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)整為800r/min，再以.1.7mLmin^流速注入流動(dòng)相，待流動(dòng)相從柱出口流出，兩相在色譜柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品溶液，254nm下檢測，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖分別收集目標(biāo)成分，減壓回收溶劑至干，得到兩種粉末狀sinof lavonoid A和sinoflavonoid B。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小葉蓮中兩個(gè)具有降血脂活性的新異戊烯基化黃酮類化合物的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn): (I)、制備粗提取物，方法是:小葉蓮4.15kg粉碎，過40目篩，每次用小葉蓮重量12倍量體積濃度為95%的乙醇在55°C、40kHz、200w條件下，超聲提取3次，每次60min，合并乙醇提取液，減壓濃縮至無醇味，加蒸餾水5L混懸，依次加入與混懸液等體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即為小葉蓮粗提取物； (2)、硅膠柱色譜初步分離，方法是，取小葉蓮粗提取物50.08g，加入IOOmL丙酮溶解后，再加入100-200目的80g硅膠，45°C減壓回收丙酮，得到載有樣品的硅膠，取200-300目的硅膠1.92kg，加入石油醚7.5L，轉(zhuǎn)移到140cm長X8cm內(nèi)徑的色譜柱中，用體積比10:1的石油醚-丙酮平衡色譜柱，將液面降至距硅膠面20cm處，將上述載有樣品的硅膠加入到色譜柱的液面上，依次加入體積比為10:1、10:3、10:5梯度的石油醚-丙酮系統(tǒng)，每個(gè)梯度15L，進(jìn)行梯度洗脫，流速為ISmLmirT1，每IOOmL作為I個(gè)流份收集，將收集的流份經(jīng)過TLC分析，合并含有目標(biāo)成分的流份，減壓濃縮，得到含有目標(biāo)成分的總樣，所述的TLC分析中使用的吸附劑為GF254，展開劑為體積比1:1的石油醚-丙酮； (3)、高速逆流色譜純化，方法是，取步驟(2)得的含有目標(biāo)成分的總樣，用總樣重量體積10倍量的體積比為4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶劑系統(tǒng)，等體積取該混合溶劑系統(tǒng)中的上相溶劑和下相溶劑，對總樣進(jìn)行超聲溶解，得到樣品溶液，用高速逆流色譜儀進(jìn)行純化，條件是:另取混合溶劑系統(tǒng)的上相為固定相、下相為流動(dòng)相，開啟恒溫循環(huán)器，溫度為30°C，用流速9.ggmLmirT1，將固定相注入高速逆流色譜的色譜柱，待充滿整個(gè)色譜柱后，開啟高速逆流色譜儀主機(jī)，緩慢將主機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)整為lOOOr/min，再以.2.0mLmirT1流速注入流動(dòng)相，待流動(dòng)相從柱出口流出，兩相在色譜柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品溶液，254nm下檢測，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖分別收集目標(biāo)成分，減壓回收溶劑至干，得到兩種粉末狀sinof lavonoid A和sinoflavonoid B。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小葉蓮中兩個(gè)具有降血脂活性的新異戊烯基化黃酮類化合物的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)、制備粗提取物，方法是:小葉蓮4.1Okg粉碎，過40目篩，每次用小葉蓮重量6倍量的體積濃度為95%乙醇有55°C、40kHz、200w條件下，超聲提取3次，每次60min、合并乙醇提取液，減壓濃縮至無醇味，加蒸餾水5L混懸，依次加入與混懸液等體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即為小葉蓮粗提取物； (2)、硅膠柱色譜初步分離，方法是，取小葉蓮粗提取物50.02g，加入70mL丙酮溶解后，再加入100-200目的硅膠100g，45°C減壓回收丙酮，得到載有樣品的硅膠，取200-300目的硅膠1.90kg,加入石油醚7.5L,轉(zhuǎn)移到140cm長X8cm內(nèi)徑的色譜柱中，用體積比10:1的石油醚-丙酮平衡色譜柱，將液面降至距硅膠面20cm處，將上述載有樣品的硅膠加入到色譜柱的液面上，依次加入體積比為10:1、10: 3、10:5梯度的石油醚-丙酮系統(tǒng)，每個(gè)梯度15L，進(jìn)行梯度洗脫，流速為ISmLmirT1,每IOOmL作為I個(gè)流份收集，將收集的流份經(jīng)過TLC分析，合并含有目標(biāo)成分的流份，減壓濃縮，得到含有目標(biāo)成分的總樣，所述的TLC分析中使用的吸附劑為GF254，展開劑為體積比1:1的石油醚-丙酮； (3)、高速逆流色譜純化，方法是，取步驟(2)得的含有目標(biāo)成分的總樣，用總樣重量體積10倍量的體積比為4:6:4:4的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混合制成混合溶劑系統(tǒng)，等體積取該混合溶劑系統(tǒng)中的上相溶劑和下相溶劑，對總樣進(jìn)行超聲溶解，得到樣品溶液，用高速逆流色譜儀進(jìn)行純化，條件是:另取混合溶劑系統(tǒng)的上相為固定相、下相為流動(dòng)相，開啟恒溫循環(huán)器 ，溫度22°C，用流速9.ggmLmirT1，將固定相注入高速逆流色譜的色譜柱，待充滿整個(gè)色譜柱后，開啟高速逆流色譜儀主機(jī)，緩慢將主機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)整為750r/min，再以·1.2mLmin^流速注入流動(dòng)相，待流動(dòng)相從柱出口流出，兩相在色譜柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥注入樣品溶液，254nm下檢測，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖分別收集目標(biāo)成分，減壓回收溶劑至干，得到兩種粉末狀sinof lavonoid A和sinoflavonoid B。
6.一種小葉蓮中兩個(gè)具有降血脂活性的新異戊烯基化黃酮類化合物在制備降血脂藥物中的應(yīng)用 。
【文檔編號】A61P3/06GK103819445SQ201410117238
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月26日
【發(fā)明者】孫彥君, 孫印石, 王俊敏, 陳輝, 張艷麗, 郝志友, 關(guān)延彬, 弓建紅, 李曉坤, 紀(jì)寶玉 申請人:河南中醫(yī)學(xué)院