雙特異性抗體融合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，所述片段與至少一個(gè)具有對(duì)于第二目的抗原的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體相融合。
【專利說明】雙特異性抗體融合物
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年9月26日、申請(qǐng)?zhí)枮?00880113719.9、發(fā)明名稱為“雙特異性抗體融合物”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]本發(fā)明涉及新的雙特異性抗體融合蛋白。此類抗體包含針對(duì)目的抗原的第一特異性，和對(duì)于第二目的抗原的第二特異性，所述第二目的抗原例如為血清載體蛋白，其用于在延長抗體的體內(nèi)血清半衰期中使用。還提供了用于產(chǎn)生此類分子的方法和包含它們的藥物組合物。
[0003]抗體的高特異性和親和力使得它們成為理想的診斷和治療劑，特別是用于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì):蛋白質(zhì)相互作用。在重組抗體【技術(shù)領(lǐng)域】中的進(jìn)展已導(dǎo)致產(chǎn)生出抗體片段例如Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段及其他抗體片段。這些更小的分子保留了完整抗體的抗原結(jié)合活性，并且還可以展示出相比于完整免疫球蛋白分子而言經(jīng)改善的組織滲透和藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。事實(shí)上，抗體片段被證明是多用途的治療劑，如通過產(chǎn)品例如ReoPro?和Lucent is?的近期成功而可見的。盡管此類片段看起來展示出超過完整免疫球蛋白的許多優(yōu)點(diǎn)，但它們還遭受了增加的從血清中的清除率，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈x予長的體內(nèi)壽命的Fe 結(jié)構(gòu)域(Medasan 等人，1997，J.1mmunol.158:2211-2217)。
[0004]先前已描述了具有雙特異性即與兩種不同的抗原相結(jié)合的抗體(關(guān)于綜述，參見 Segal 等人,1999, Curr.0pin.1mmunol.11:558-562 ；Pliickthun&Pack, 1997, Immunotechnology, 3:83-105 ；Fischer 和 Leger, 2007，Pathobiology, 74，3-14)。在 W002/02773、US2007065440、US2006257406、US2006106203 和 US2006280734 中也描述了雙特異性抗體。用于制備基于 異雙特異性抗體的分子的先前方法一般采用化學(xué)交聯(lián)或者蛋白質(zhì)改造技術(shù)?；瘜W(xué)交聯(lián)遭受了異和同二聚體形成的產(chǎn)率差以及要求進(jìn)行其后續(xù)的色譜法分離。蛋白質(zhì)改造方法已高度地進(jìn)行了詳細(xì)闡述(例如，件-白(knobs-1nto-holes)改造；Ridgway等人，1996，Protein Eng.9(7):617-621)或已使用了具有不合適的穩(wěn)定性特征的分子(例如，雙抗體，scFv)0在某些情況下，雙特異性抗體還可以遭受位阻問題，從而使得兩種抗原無法同時(shí)與每條抗體臂相結(jié)合。
[0005]單可變結(jié)構(gòu)域抗體也稱為單結(jié)構(gòu)域抗體或dAbs，其相應(yīng)于抗體的重鏈可變區(qū)(VH)或輕鏈可變區(qū)(VL)。Ward等人，1989，Nature, 341，544-546描述了鼠類單結(jié)構(gòu)域抗體。人單結(jié)構(gòu)域抗體和‘駱騎化的(camelised)’人單結(jié)構(gòu)域抗體也已得到描述(Holt等人，2003, Trends in Biotechnology, 21, 484-490)。還已從駱騎科動(dòng)物(駱騎和美洲騎)和軟骨魚(須鯊和鉸口鯊)中獲得了單結(jié)構(gòu)域抗體。這些生物已進(jìn)化出了安裝在Fe-等價(jià)恒定結(jié)構(gòu)域構(gòu)架上的高親和力單V-樣結(jié)構(gòu)域(在駱駝科動(dòng)物中稱為VhH，和在鯊魚中稱為V-NAR),以作為其免疫系統(tǒng)的完整且至關(guān)重要的組分(關(guān)于綜述，參見Holliger&Hudson ；2005, Nature Biotechnology, 23 (9): 1126-1136)。
[0006]在EP0368684中描述了單結(jié)構(gòu)域抗體-酶融合物。在W02004/058820中還描述了單結(jié)構(gòu)域-效應(yīng)子基團(tuán)融合物，其包含單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。在W02007/024715中描述了雙重可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白。在EP1517921中描述了包含兩個(gè)具有不同特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體的雙特異性配體。[0007]用于改善抗體片段例如？1?&13、？&13’、？(&13’)2和其他抗體片段的半衰期的手段是已知的。一種方法使所述片段與聚合物分子相綴合。因此，已通過綴合至聚乙二醇(PEG)而改善了 Fab’、F(ab’)2片段在動(dòng)物中的短的循環(huán)半衰期(參見例如，W098/25791、W099/64460和TO98/37200)。另一種方法通過綴合至與FcRn受體相互作用的試劑來修飾所述抗體片段(參見例如，W097/34631)。延長半衰期的另外一種方法使用結(jié)合血清白蛋白的多肽(參見例如，Smith 等人，2001，Bioconjugate Chem.12:750-756 ；EP0486525 ；US6267964 ；W004/001064 ；W002/076489 ;和W001/45746)。然而，仍然需要產(chǎn)生具有長的體內(nèi)半衰期的抗原結(jié)合性免疫球蛋白蛋白質(zhì)，以作為因?yàn)榕cFcRn受體相互作用而具有長的半衰期的那些的備選方案，其中沒有通過綴合至PEG來進(jìn)行化學(xué)修飾或者綴合至人血清白蛋白。
[0008]各種蛋白質(zhì)存在于血漿中，并且包括甲狀腺素結(jié)合蛋白、運(yùn)甲狀腺素蛋白、α 1-酸性糖蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原和白蛋白，或者它們中的任何的片段。血清載體蛋白在機(jī)體內(nèi)循環(huán)，具有以天測(cè)量的半衰期，例如對(duì)于甲狀腺素結(jié)合蛋白來說為5天或者對(duì)于運(yùn)甲狀腺素蛋白來說為 2 天(Bartalena&Robbins, 1993，Clinics in Lab.Med.13:583-598)，或者在碘化的α 1-酸性糖蛋白的周轉(zhuǎn)的第二個(gè)階段中為65小時(shí)(Bree等人，1986，Cl in.Pharmacokin.11:336-342)。來自 Gitlin 等人(1964，J.Clin.1nvest.10:1938-1951)的數(shù)據(jù)暗示，在孕婦中，α 1-酸性糖蛋白的半衰期為3.8天，對(duì)于轉(zhuǎn)鐵蛋白為12天，和對(duì)于纖維蛋白原為2.5天。血清白蛋白是在血管和血管外區(qū)室中都豐富的蛋白質(zhì)，其在人中的半衰期為大約 19 天(Peters, 1985，Adv Protein Chem.37:161-245)。這與為大約 21 天的 IgGl的半衰期相似(Waldeman&Strober, 1969, Progr.Allergy, 13:1-110)。
[0009]本發(fā)明提供了經(jīng)改善的雙特異性抗體融合蛋白，其可以重組地產(chǎn)生并且能夠同時(shí)結(jié)合兩種抗原。
[0010]因此，本發(fā)明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的第一特異性的免疫球蛋白部分，并且進(jìn)一步包含具有對(duì)于第二目的抗原的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)ο
[0011]本發(fā)明還提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的第一特異性的免疫球蛋白部分，并且進(jìn)一步包含至少一個(gè)具有對(duì)于第二目的抗原的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體。
[0012]本發(fā)明的雙特異性抗體融合物將能夠與兩種目的抗原選擇性地相結(jié)合。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中，由所述Fab或Fab’片段所結(jié)合的目的抗原可以是細(xì)胞關(guān)聯(lián)蛋白，例如在細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、T-細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞上的細(xì)胞表面蛋白，或者它可以是可溶性蛋白。目的抗原還可以是任何在醫(yī)學(xué)上相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如在疾病或感染期間上調(diào)的那些蛋白質(zhì)，例如受體和/或其相應(yīng)的配體。細(xì)胞表面蛋白的具體例子包括粘附分子，例如整聯(lián)蛋白例如β I整聯(lián)蛋白例如VLA-4，E-選擇蛋白，P選擇蛋白或L-選擇蛋白，CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CDlla, CDllb, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33,CD38，CD40，CD45，CDW52, CD69，CD134 (0X40)，I COS, BCMP7, CD137，CD27L，CDCP1，DPCRl,DPCRl, CluCluIin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455,LTBP2, LTK, MAL2, MRP2，柄蛋白-樣 2，NKCCl，PTK7, RAIGl，TCAMl，SC6, BCMP101, BCMP84,BCMPlI, DTD，癌胚抗原(CEA)，人乳脂球蛋白(HMFG1和2)，I類MHC和II類MHC抗原，和VEGF,以及適當(dāng)時(shí)，它們的受體。[0014]可溶性抗原包括白介素例如IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16或IL-17,病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨細(xì)胞病毒抗原,免疫球蛋白例如IgE,干擾素例如干擾素α、干擾素β或干擾素Y，腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β，集落刺激因子例如G-CSF或GM-CSF，和血小板衍生生長因子例如TOGF-α和TOGF-β，以及適當(dāng)時(shí)，它們的受體。其他抗原包括細(xì)菌細(xì)胞表面抗原，細(xì)菌毒素，病毒例如流感、EBV, HepA, B和C，生物恐怖主義試劑，放射性核素和重金屬，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體融合蛋白可以用于在功能上改變目的抗原的活性。例如，所述抗體融合蛋白可以直接地或間接地中和、拮抗或激動(dòng)所述抗原的活性。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方案中，由本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白中的所述單結(jié)構(gòu)域抗體所結(jié)合的第二目的抗原可以是細(xì)胞關(guān)聯(lián)蛋白，例如在細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、T-細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞上的細(xì)胞表面蛋白，或者它可以是可溶性蛋白。目的抗原還可以是任何在醫(yī)學(xué)上相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如在疾病或感染期間上調(diào)的那些蛋白質(zhì)，例如受體和/或其相應(yīng)的配體。細(xì)胞表面蛋白的具體例子包括粘附分子，例如整聯(lián)蛋白例如β I整聯(lián)蛋白例如VLA-4，E-選擇蛋白，P選擇蛋白或L-選擇蛋白，⑶2，⑶3，⑶4，⑶5，⑶7，⑶8，⑶11a，CDllb, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, CD 134 (0X40)，I COS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP I, DPCRl, DPCRl, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2,KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2，柄蛋白-樣 2，NKCCl，PTK7, RAIG1, TCAMl, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMPlI, DTD，癌胚抗原(CEA)，人乳脂球蛋白(HMFGI和2)，I類MHC和II類MHC抗原，和VEGF，以及適當(dāng)時(shí)，它們的受體。
[0017]可溶性抗原包括白 介素例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16或IL-17,病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨細(xì)胞病毒抗原,免疫球蛋白例如IgE,干擾素例如干擾素α、干擾素β或干擾素Y，腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β，集落刺激因子例如G-CSF或GM-CSF，和血小板衍生生長因子例如TOGF-α和TOGF-β，以及適當(dāng)時(shí)，它們的受體。其他抗原包括細(xì)菌細(xì)胞表面抗原，細(xì)菌毒素，病毒例如流感、EBV, HepA, B和C，生物恐怖主義試劑，放射性核素和重金屬，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。
[0018]可以由所述單結(jié)構(gòu)域抗體所結(jié)合的其他抗原包括血清載體蛋白、使得能夠進(jìn)行細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能募集的多肽以及核素螯合劑蛋白質(zhì)。
[0019]因此，在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的第一特異性的免疫球蛋白部分，并且進(jìn)一步包含具有對(duì)于第二種蛋白質(zhì)的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體，后者提供了募集效應(yīng)子功能(例如補(bǔ)體途徑激活和/或效應(yīng)細(xì)胞募集)的能力。此外，由于與核素螯合劑蛋白質(zhì)相結(jié)合的單結(jié)構(gòu)域抗體，本發(fā)明的融合蛋白可以用于螯合放射性核素。此類融合蛋白可在成像或放射性核素靶向方法(以進(jìn)行治療)中使用。
[0020]因此，在一個(gè)實(shí)例中，提供了分離的雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，所述片段與至少一個(gè)具有對(duì)于募集多肽的特異性的dAb相融合，所述dAb通過與所述募集多肽相結(jié)合而提供了直接地或間接地募集細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的能力。
[0021]效應(yīng)子功能的募集可以是直接的，因?yàn)樾?yīng)子功能與細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，所述細(xì)胞在其表面上攜帶有募集分子。當(dāng)dAb與募集分子的結(jié)合引起例如下述因子的釋放時(shí)，可以發(fā)生間接募集:所述因子可以直接地或間接地募集效應(yīng)子功能，或者可以經(jīng)由信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活。例子包括TNFa、IL2、IL6、IL8、IL17、IFN Y、組胺、Clq、調(diào)理素以及經(jīng)典和旁路補(bǔ)體激活級(jí)聯(lián)的其他成員，例如C2、C4、C3-轉(zhuǎn)變酶和C5至C9。
[0022]如本文所使用的，“募集多肽”包括Fe Y R例如Fe Y R1、Fc Y RII和Fe Y RIII，補(bǔ)體途徑蛋白例如但不限于Clq和C3,⑶標(biāo)志蛋白(分化群(Cluster of Differentiation)標(biāo)志物)例如但不限于 CD68、CD115、CD16、CD80、CD83、CD86、CD56、CD64、CD3、CD4、CD8、CD28、⑶45、⑶19、⑶20和⑶22。為⑶標(biāo)志蛋白的進(jìn)一步的募集多肽包括⑶1、⑶IcU⑶2、⑶5、CD8、CD9、CD10、CDll、CDlla、CDllb、CDllc、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD40、CD43、CD44、CD45、CD46、CD49、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD58、CD59、CD61、CD62、D62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD66e、CD68、CD70、CD71、CD72、CD79、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD88、CD89、CD90、CD94、CD95、CD98、CD106、CD 114、CD116、CD117、CD118、CD120、CD122、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD137、CD138、CD141、CD142、CD143、CD146、CD147、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD162、CD164、CD169、CD184、CD206、CD209、CD257、CD278、CD281、CD282、CD283和CD304，或它們中的任何的片段，所述片段保留了直接地或間接地募集細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的能力。募集多肽還包括具有效應(yīng)子功能的免疫球蛋白分子，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgE 和 IgA0
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，dAb對(duì)于其具有特異性的第二種蛋白質(zhì)是補(bǔ)體途徑蛋白，其中Clq是特別優(yōu)選的。
[0024]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，dAb對(duì)于其具有特異性的第二種蛋白質(zhì)是CD標(biāo)志蛋白，其中 CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16 和 CD35 是特別優(yōu)選的。
[0025]因此，還提供了分離的雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體片段，所述片段與至少一個(gè)dAb相融合，所述dAb具有對(duì)于選自下列的CD分子的特異性:CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16 和 CD35。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單結(jié)構(gòu)域抗體為具有第一特異性的免疫球蛋白部分提供了延長的半衰期。
[0027]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，所述片段與至少一個(gè)具有對(duì)于血清載體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體相融合，所述單結(jié)構(gòu)域抗體通過與所述血清載體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子或CD35/CR1相結(jié)合而為具有對(duì)于所述目的抗原的特異性的所述抗體片段提供了延長的半衰期。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分離的雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，所述片段與至少一個(gè)具有對(duì)于血清載體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體相融合，所述單結(jié)構(gòu)域抗體通過與所述血清載體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子或CD35/CR1相結(jié)合而為具有對(duì)于所述目的抗原的特異性的所述抗體片段提供了延長的半衰期。
[0029]如本文所使用的，“血清載體蛋白”包括甲狀腺素結(jié)合蛋白、運(yùn)甲狀腺素蛋白、α 1-酸性糖蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原和白蛋白，或它們中的任何的片段。
[0030]如本文所使用的，“循環(huán)免疫球蛋白分子”包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM和IgD、或它們中的任何的片段。
[0031]⑶35/CR1是存在于紅細(xì)胞上的蛋白質(zhì)，其具有36天的半衰期(正常范圍為28至47 天；Lanaro 等人,1971, Cancer, 28 (3): 658-661 )。
[0032]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，dAb對(duì)于其具有特異性的第二種蛋白質(zhì)是血清載體蛋白，其中人血清載體蛋白是特別優(yōu)選的。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述血清載體蛋白是人血清白蛋白。
[0033]因此，提供了雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，所述片段與至少一個(gè)具有對(duì)于人血清白蛋白的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體相融合。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，所述片段與至少一個(gè)具有對(duì)于人血清白蛋白的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體相融合。
[0035]在一個(gè)實(shí)施方案中，具有對(duì)于目的抗原的特異性的所述抗體片段是Fab片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有對(duì)于目的抗原的特異性的所述抗體片段是Fab’片段。
[0036]因此，在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體融合蛋白是翻譯融合蛋白，即基因融合物，其各自的序列由表達(dá)載體編碼。備選地，所述抗體融合蛋白組分通過使用化學(xué)手段，即通過化學(xué)綴合或化學(xué)交聯(lián)進(jìn)行融合。此類化學(xué)手段是本領(lǐng)域已知的。
[0037]在一個(gè)實(shí)例中，所述抗體片段是Fab’片段，其具有天然的或經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)。當(dāng)用于在制備本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白中使用的抗體片段是Fab’片段時(shí)，所述片段一般在重鏈的C-末端處延長一個(gè)或多個(gè)氨基酸。因此，本發(fā)明的抗體融合物可以包含直接地或經(jīng)由接頭與dAb相翻譯融合(或化學(xué)融合)的Fab’片段。此外，合適的抗體Fab’片段的例子包括在W02005003170和W02005003171中描述的那些。
[0038]在另一個(gè)實(shí)例中，所述抗體片段是Fab片段。因此，本發(fā)明的抗體融合物可以包含與接頭序列相翻譯融合(或化學(xué)融合)的Fab片段，而所述接頭序列與dAb相翻譯融合(或化學(xué)融合)。優(yōu)選地，所述Fab片段是在鏈間半胱氨酸處終止的Fab片段，如W02005/003169中所描述的。
[0039]在本發(fā)明中有用的抗體Fab或Fab’片段可以來自任何物種，但優(yōu)選地源自單克隆抗體、人抗體，或者是人源化的片段。用于在本發(fā)明中使用的抗體片段可以源自免疫球蛋白分子的任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亞類，并且可以獲自任何物種，包括例如小鼠、大鼠、鯊魚、兔、豬、倉鼠、駱駝、美洲駝、山羊或人。
[0040]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體Fab或Fab’片段是單克隆的、完全人的、人源化的或嵌合的抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體Fab或Fab’片段是完全人的或人源化的。
[0041]單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來制備,例如雜交瘤技術(shù)(Kohler&Milstein, Nature, 1975，256，495-497)、三源雜交瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人,Immunology Today, 1983, 4, 72)和 EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole 等人,“MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，，,第 77-96 頁,Alan R.Liss, Inc., 1985)。
[0042] 用于在本發(fā)明中使用的抗體還可以使用單淋巴細(xì)胞抗體方法來產(chǎn)生，所述單淋巴細(xì)胞抗體方法通過克隆且表達(dá)從被選擇用于產(chǎn)生特異性抗體的單個(gè)淋巴細(xì)胞中產(chǎn)生的免疫球蛋白可變區(qū)cDNAs,其中通過例如由Babcook, J.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1996, 93(15), 7843-7848 ；W092/02551 ；W02004/051268 ;和 W02004/106377 所描述的方
法來進(jìn)行。
[0043]人源化抗體是來自非人物種的抗體分子，其具有一個(gè)或多個(gè)來自非人物種的互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶Rs)和來自人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)(參見例如US5，585，089)。
[0044]用于在本發(fā)明中使用的抗體還可以使用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示方法來產(chǎn)生，并且包括由下列文獻(xiàn)所公開的那些:Brinkman等人，J.1mmunol.Methods, 1995, 182, 41-50 ；Ames 等人，J.1mmunol.Methods,1995, 184, 177-186 ；Kettleborough 等人，Eur.J.1mmunol.,1994，24，952-958 ;Persic 等人,Gene, 1997187, 9-18 ；和 Burton 等人,Advances in Immunology, 1994, 57, 191-280 ；W090/02809 ；W091/10737 ；W092/01047 ；W092/18619 ；W093/11236 ；W095/15982 ；和W095/20401 ；和 US5, 698，426 ；5, 223，409 ；5, 403，484 ；5, 580，717 ；5, 427，908 ；5, 750，753 ；5，821，047 ；5, 571，698 ；5, 427，908 ；5, 516，637 ；5, 780，225 ；5, 658，727 ；5, 733，743 ；和5，969，108。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠或其他生物(包括其他哺乳動(dòng)物)可以用于產(chǎn)生人源化抗體。
[0045]完全人的抗體是這樣的那些抗體，在所述抗體中重鏈和輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)(當(dāng)存在時(shí))都是人起源的，或者基本上等同于人起源的序列，不必來自相同的抗體。完全人的抗體的例子可以包括例 如通過上文所描述的噬菌體展示方法而產(chǎn)生的抗體，和由其中鼠類免疫球蛋白可變區(qū)和恒定區(qū)基因已被其人對(duì)應(yīng)物替代的小鼠所產(chǎn)生的抗體，例如如在 EP0546073B1、US5, 545，806、US5, 569，825、US5, 625，126、US5, 633，425、US5, 661，016、US5, 770, 429、EP0438474B1 和 EP0463151B1 中所概括性地描述的。
[0046]用于在本發(fā)明中使用的抗體Fab或Fab ’片段起始材料可以獲自任何完整的抗體，尤其是完整的單克隆抗體，其中使用任何合適的酶促切割和/或消化技術(shù)，例如通過用胃蛋白酶進(jìn)行處理。備選地或者另外地，抗體起始材料可以通過使用重組DNA技術(shù)來制備，其中牽涉編碼抗體可變區(qū)和/或恒定區(qū)的DNA的操作和再表達(dá)。標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可以用于修飾、添加或刪除氨基酸或結(jié)構(gòu)域，如所希望的。對(duì)于可變區(qū)或恒定區(qū)的任何改變?nèi)匀话ㄔ诒疚乃褂玫男g(shù)語“可變區(qū)”和“恒定區(qū)”的范圍內(nèi)。
[0047]所述抗體片段起始材料可以獲自任何物種，包括例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠、駱駝、美洲駝、山羊或人。所述抗體片段的部分可以獲自超過一個(gè)物種，例如所述抗體片段可以是嵌合的。在一個(gè)實(shí)例中，恒定區(qū)來自一個(gè)物種，而可變區(qū)來自另一個(gè)物種。所述抗體片段起始材料也可以是經(jīng)修飾的。在另一個(gè)實(shí)例中，所述抗體片段的可變區(qū)通過使用重組DNA改造技術(shù)來形成。此類經(jīng)改造的變化形式包括例如通過對(duì)于天然抗體的氨基酸序列進(jìn)行插入、缺失或改變而從天然抗體可變區(qū)形成的那些。這種類型的具體例子包括這樣的那些經(jīng)改造的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，其包含來自一種抗體的至少一個(gè)⑶R和任選地一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架氨基酸，以及來自第二種抗體的該可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的其余部分。用于形成和制備這些抗體片段的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，Boss等人，US4, 816，397 ；Cabilly等人，US6, 331，415 ；Shrader 等人，W092/02551 ；ffard 等人，1989，Nature, 341，544 ；Orlandi 等人,1989, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86, 3833 ；Riechmann 等人,1988, Nature, 322, 323 ；Bird 等人，1988，Science, 242，423 ；Queen 等人，US5, 585，089 ；Adair, W091/09967 ；Mountain 和 Adair, 1992,Biotechnol.Genet.Eng.Rev, 10, 1-142 ；Verma 等人,1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181)。[0048]在本發(fā)明中，與Fab或Fab’片段相融合的每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體可以直接地或經(jīng)由接頭進(jìn)行連接。
[0049]用于使dAb與Fab或Fab’相連接的合適的接頭區(qū)的例子包括但不限于，柔性接頭序列和剛性接頭序列。柔性接頭序列包括在下列文獻(xiàn)中所描述的那些:Huston 等人，1988，PNAS85:5879-5883 ;Wright&Deonarain，Mol.1mmunol.，2007，44(11):2860-2869 ;Alfthan 等人,Prot.Eng., 1995, 8 (7): 725-731 ；Luo 等人，J.Biochem.，1995，118 (4):825-831 ；Tang 等人，1996，J.Biol.Chem.271 (26): 15682-15686 ;和 Turner 等人，1997，JIMM205，42-54 (關(guān)于代表性的例子參見表1)。
[0050]表1.柔性接頭序列
[0051]
【權(quán)利要求】
1.雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對(duì)于目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab’片段，所述片段與至少一個(gè)具有對(duì)于第二目的抗原的特異性的單結(jié)構(gòu)域抗體相融合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其在所述Fab或Fab’片段的重鏈或輕鏈的N-或C-末端處包含單結(jié)構(gòu)域抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所述單結(jié)構(gòu)域抗體是VH或VHH。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所述單結(jié)構(gòu)域抗體是VL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其包含兩個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體，其中一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體與所述Fab或Fab’片段的輕鏈的C-末端相融合,而另一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體與所述Fab或Fab’片段的重鏈的C-末端相融合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的融合蛋白，其中每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是具有相同的結(jié)合特異性的VH結(jié)構(gòu)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的融合蛋白，其中每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是具有相同的結(jié)合特異性的VL結(jié)構(gòu)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的融合蛋白，其中一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是VH結(jié)構(gòu)域，而另一個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是VL結(jié)構(gòu)域，并且所述VH和VL結(jié)構(gòu)域是協(xié)作地結(jié)合所選擇的抗原的互補(bǔ)VH/VL對(duì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的融合蛋白，其中所述VH結(jié)構(gòu)域與所述Fab或Fab’片段的重鏈的C-末端相融合，并且所述VL結(jié)構(gòu)域與所述Fab或Fab’片段的輕鏈的C-末端相融合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的融合蛋白，其中每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是完全人的或人源化的。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的融合蛋白，其中所述Fab或Fab’是完全人的或人源化的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的融合蛋白，其中與所述抗體Fab或Fab’片段相融合的每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體是經(jīng)由獨(dú)立地選自下列的接頭進(jìn)行融合的:氨基酸序列GS、PPP、SEQ ID NO: USEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ IDNO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ IDNO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ IDNO: 33,SEQ ID NO: 34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO: 36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO: 38,SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO: 50 和 SEQ ID NO: 51。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的融合蛋白，其中所述接頭序列選自SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:45。
14.根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所述單結(jié)構(gòu)域抗體經(jīng)由具有SEQID NO:2或SEQID NO:45中給出的序列的接頭與所述Fab或Fab’片段的重鏈的C-末端相連接。
15.根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所述單結(jié)構(gòu)域抗體經(jīng)由具有SEQID NO:1或SEQID NO:45中給出的序列的接頭與所述Fab或Fab’片段的輕鏈的C-末端相連接。
16.根據(jù)權(quán)利要求9的融合蛋白，其中所述VH結(jié)構(gòu)域經(jīng)由具有SEQID NO: 2或SEQ IDNO: 45中給出的序列的接頭與所述Fab或Fab’片段的重鏈的C-末端相連接，并且所述VL結(jié)構(gòu)域經(jīng)由具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 45中給出的序列的接頭與所述Fab或Fab’片段的輕鏈的C-末端相連接。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的融合蛋白，其中每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體具有對(duì)于血清載體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特異性，所述單結(jié)構(gòu)域抗體通過與所述血清載體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子或CD35/CR1結(jié)合而為具有對(duì)于所述目的抗原的特異性的所述抗體Fab或Fab’片段提供了延長的半衰期。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的融合蛋白，其中每個(gè)單結(jié)構(gòu)域抗體的特異性是對(duì)于血清載體蛋白的。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的融合蛋白，其中所述血清載體蛋白是選自下列的人血清載體蛋白:甲狀腺素結(jié)合蛋白、運(yùn)甲狀腺素蛋白、α 1-酸性糖蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原和血清白蛋白。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的融合蛋白，其中所述血清載體蛋白是人血清白蛋白。
21.表達(dá)載體，其包含關(guān)于權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)之中所定義的雙特異性抗體融合蛋白的密碼。
22.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求21中所定義的載體。
23.權(quán)利要求1至20中 任一項(xiàng)之中所定義的雙特異性抗體融合蛋白在制備用于治療疾病或病癥的藥物中的用途。
24.用于治療疾病或病癥的方法，其包括施用治療有效量的權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)之中所定義的雙特異性抗體融合蛋白。
【文檔編號(hào)】A61P29/00GK104004088SQ201410124303
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2008年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2007年9月26日
【發(fā)明者】D·P·胡姆皮雷斯, E·達(dá)弗 申請(qǐng)人:Ucb醫(yī)藥有限公司