一種用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法,其包括以下步驟:步驟1,制備改性煅燒骨材料;步驟2,取2～3重量份分子量在2x105～3x105的羧甲基殼聚糖，將所述羧甲基殼聚糖溶于酸性溶液形成羧甲基殼聚糖溶液；將所述溶液與1重量份改性煅燒骨材料混合形成混合物；步驟3,步驟2中的混合物經(jīng)Co60照射滅菌，然后向其中加入人重組脂聯(lián)素,均勻混合后塑型，冷凍干燥后即得用脂聯(lián)素包被的植骨材料。本發(fā)明方法制備的用脂聯(lián)素包被的植骨材料骨強度大，易于降解，生物活性大，同時具有骨誘導(dǎo)特性。
【專利說明】一種用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料制備【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種載生物因子且緩釋的具有高活性的用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，所制備的材料可應(yīng)用于機體骨缺損的修復(fù)。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)中骨缺損修復(fù)重建的方法很多，但骨缺損后修復(fù)重建尤其是大塊骨缺損后的修復(fù)重建一直是骨科面臨的難題。尋求理想的骨修復(fù)替代材料一直是骨科及相關(guān)學(xué)科亟待解決的關(guān)鍵問題。
[0003]多年的研究成果表明，在磷灰石陶瓷家族成員中，納米羥基磷灰石(HA)的晶體結(jié)構(gòu)與骨組織中的礦物質(zhì)微粒結(jié)構(gòu)基本相同，磷酸鈣(TCP)在骨組織中也占有一定比例，其降解速率遠大于HA，在體內(nèi)易于降解。降解速率除與化學(xué)組分有關(guān)外，還與其與體液間的接觸面積相關(guān)。多孔磷灰石陶瓷的最佳設(shè)計原則在于既能兼顧骨支架材料的降解速率及并可以保持有利于新生骨組織的長入孔隙結(jié)構(gòu)。盡管鈣磷陶瓷的成型制作技術(shù)有了大的發(fā)展，如計算機控制的三維陶瓷打印技術(shù)，但該方法受測量表征技術(shù)及加工技術(shù)的限制，通過該方法制作天然骨組織仍是一個長期的努力目標。
[0004]煅燒骨是現(xiàn)有骨修復(fù)材料之一，既保留了無機鈣磷礦物質(zhì)，又基本保留了骨組織的多孔結(jié)構(gòu)，在臨床應(yīng)用中得到了較好的評價。但強度較差，由于經(jīng)高溫燒成，完全失去了膠原蛋白，納米晶體發(fā)生了改變，不易降解。
[0005]脂聯(lián)素(Adipo nectin，APN)是動物及人類脂肪細胞分泌的一種激素，由247個氨基酸組成，存在2種受體(AdipoRl和AdipoR2)，成骨細胞和破骨細胞均表達脂聯(lián)素受體。體外實驗證明，脂聯(lián)素激活A(yù)dipoRl/JNK、AdipoRl/p38信號通路誘導(dǎo)人成骨細胞的增殖及分化，促進其成骨功能。同時，脂聯(lián)素處理小鼠單核細胞后，可抑制NF-kappa B通路的激活，進而抑制小鼠單核細胞向破骨細胞分化成熟。體內(nèi)動物研究亦表明，過表達脂聯(lián)素的腺病毒轉(zhuǎn)染C57BL/6J小鼠后，成骨細胞功能被激活，破骨細胞骨吸收作用被抑制，最終表現(xiàn)為骨量增加。上述研究表明，脂聯(lián)素在骨代謝過程中起重要的調(diào)控作用。但它們半衰期短，局部應(yīng)用時很快被稀釋和代謝。
[0006]近年來的研究已經(jīng)闡明這些細胞因子主要作用的生化和分子基礎(chǔ)，同時也提供了有關(guān)它們之間相互作用的機理。隨著對細胞因子在骨代謝中作用機制的認識，預(yù)示著這些細胞因子在骨折愈合及骨缺損修復(fù)以及某些骨吸收性疾病的診斷和治療中有著樂觀的應(yīng)用前景。
[0007]殼聚糖(chitosan，CS)是由甲殼素經(jīng)脫乙?；磻?yīng)而得到，是目前已知的天然多糖中唯一的堿性多糖，它具有良好的生物相容性、生物降解性、無毒及抗菌性等特點，受到醫(yī)學(xué)界廣泛的關(guān)注。羧甲基殼聚糖(CMCS)是新型的殼聚糖衍生物，由甲殼質(zhì)在堿性條件下與氯乙酸反應(yīng)而得到。與甲殼質(zhì)相比，其物理、化學(xué)性質(zhì)均得到優(yōu)化，具有完全水溶性、成膜性及極強的與鈣離子的螯合作用，大大拓展了其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0008]在骨缺損的修復(fù)治療中，磷灰石陶瓷具有與骨組織無機成分相同的組分，生物相容性好，但性脆強度不高，臨床應(yīng)用受到大的限制。隨著研究的不斷深入，特別是理想的骨組織工程支架材料的提出，盡力模仿骨組織的天然結(jié)構(gòu)成為了當今骨修復(fù)材料設(shè)計與制作的重要原則。支架材料的研究是骨組織工程研究的關(guān)鍵問題，骨組織工程支架材料不僅要有良好的生物相容性、一定的機械強度及三維多孔的立體結(jié)構(gòu)，有利于新生骨組織的長入，還要有合適的降解速率維持新生組織的生長。殼聚糖具有無毒性，良好的生物相容性，可被體內(nèi)多種生物酶降解，降解產(chǎn)物無毒且能被生物體吸收，殼聚糖是已經(jīng)被證明了的適宜的緩釋控載體。羧甲基殼聚糖與殼聚糖相比具有更強的水溶性、成膜性和與鈣離子的鰲合作用，拓寬了其作為緩控釋載體的應(yīng)用范圍，當其與生物陶瓷復(fù)合制作支架材料時，顯示了優(yōu)越的修飾能力。
[0009]此外，通過體外試驗證明羧甲基殼聚糖能明顯縮短組織創(chuàng)面出血時間，具有良好的凝血性，分析原因為CMCS是一種兩性聚電解質(zhì)，在溶液中，氨基能質(zhì)子化生成陽離子，羧基能電離生成陰離子，兩種離子共同作用加速凝血過程縮短了凝血時間。感染也是誘導(dǎo)術(shù)后粘連的因素之一，細菌有不同的致粘連能力，如大腸桿菌能引發(fā)纖維蛋白分子及白細胞滲出，產(chǎn)生較廣泛的粘連。臨床上常使用抗生素來控制術(shù)區(qū)感染，
[0010]僅靠單一材料，很難滿足以上各項性能的要求，因此人們通常模仿天然骨的成分和結(jié)構(gòu)特征進行仿生制備無機復(fù)合或有機雜化支架，殼聚糖的膜結(jié)構(gòu)在模仿天然骨的應(yīng)用中常常受到重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法。以解決現(xiàn)有骨粉強度較差，難于降解，生物活性較差等不足的缺陷。
[0012]一種用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，包括以下步驟:
[0013]步驟1，制備改性煅燒骨材料；
[0014]步驟2，取2~3重量份分子量在2xl05~3xl05的羧甲基殼聚糖，將所述羧甲基殼聚糖溶于酸性溶液形成羧甲基殼聚糖溶液；將所述溶液與I重量份改性煅燒骨材料混合形成混合物；殼聚糖不溶于水或略溶于水；而且，要達到緩釋效果，得選用高分子量的殼聚糖，而高分子量殼聚糖僅在酸性環(huán)境下才能溶解。
[0015]步驟3，步驟2中的混合物經(jīng)Co60照射滅菌，然后向其中加入人重組脂聯(lián)素，均勻混合后塑型，冷凍干燥后即得用脂聯(lián)素包被的植骨材料。
[0016]如上所述的用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，優(yōu)選的，步驟1，選用新生小牛關(guān)節(jié)頭或脛骨的骨骺端作為骨原料，經(jīng)去離子水充分蕩洗后利用改性劑對骨原料行改性，使骨基質(zhì)的Ca/P原子比降至1.66~1.5 ;然后在800°C~1100°C溫度條件下煅燒改性后的骨原料以徹底去除骨材料的免疫抗原性，獲得改性煅燒骨材料。采用該優(yōu)選步驟的的有益效果是:有效提高β磷酸三鈣的含量，獲得的改性煅燒骨材料中羥基磷灰石(HA): β磷酸三鈣(PTCP) =1:3。
[0017]如上所述的用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，優(yōu)選的，所述改性劑選自磷酸
氫二銨、磷酸二氫銨和磷酸中的一種或幾種。
[0018]如上所述的用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，優(yōu)選的，所述羧甲基殼聚糖分子量為2.5χ105。[0019]如上所述的用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，優(yōu)選的，步驟(2)取2.5重量份分子量在2.5x10s的羧甲基殼聚糖，將所述羧甲基殼聚糖溶于酸性溶液形成羧甲基殼聚糖溶液；將所述羧甲基殼聚糖溶液與I重量份改性煅燒骨材料混合形成混合物。
[0020]如上所述的用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，優(yōu)選的，步驟(3)所述混合物經(jīng)Co60照射滅菌，然后向其中加入0.0005~0.0015重量份的人重組脂聯(lián)素，均勻混合后在四氟乙烯平皿中使用液氮中快速塑型，冷凍干燥后即得用脂聯(lián)素包被的植骨材料。
[0021]如上所述的用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，優(yōu)選的，所述酸性溶液是體積分數(shù)為2 %的乙酸溶液，可以有效提高高分子量的殼聚糖的溶解，達到緩釋作用。
[0022]本發(fā)明的有益效果為:
[0023]1、本發(fā)明對煅燒骨材料進行改性獲得改性煅燒骨材料；該材料無免疫抗原性，用含人重組脂聯(lián)素的羧甲基殼聚糖溶膠對改性煅燒骨材料進行包被，其機械強度達0.15Mpa、體內(nèi)28天至30即可降解。
[0024]2、本發(fā)明方法制備的用脂聯(lián)素包被的植骨材料骨強度增加，易于降解，生物活性大，同時具有骨誘導(dǎo)特性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明本實施例1制備的用脂聯(lián)素包被的植骨材料掃描電鏡圖像；
[0026]圖2為凋亡檢測試劑盒進行檢測的結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0027]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0028]實施例1
[0029]用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，包括以下步驟:
[0030]步驟1，制備改性煅燒骨材料；選用新生小牛關(guān)節(jié)頭作為骨原料，經(jīng)去離子水充分蕩洗并以物理或生物化學(xué)的方法基本去除膠原蛋白；然后利用磷酸氫二銨按照化學(xué)反應(yīng)平衡方程配比對骨的基質(zhì)(骨鹽)進行改性，使骨基質(zhì)的Ca/P原子比降至1.55;然后在1000°C溫度條件下煅燒改性后的骨原料徹底去除骨材料的免疫抗原性，獲得改性煅燒骨材料；獲得的改性煅燒骨材料中羥基磷灰石(HA): β磷酸三鈣(PTCP) =1:3。
[0031]步驟2，取2500mg分子量在2.5x10s的羧甲基殼聚糖，將所述羧甲基殼聚糖溶于60ml體積分數(shù)為2%的乙酸溶液形成羧甲基殼聚糖溶液；將所述溶液與1000mg改性煅燒骨材料混合形成混合物；
[0032]步驟3，步驟2中的混合物經(jīng)Co60照射滅菌(超過10小時)，然后向其中加入Img人重組脂聯(lián)素(recombinant human globular adiponectin, rh-gAPN)，均勻混合后在四氟乙烯平皿中使用液氮中快速塑型，使用有機溶劑凍干機(FD8-6a，上海人和科學(xué)儀器有限公司)，于_30°C冷凍過夜干燥后即得用脂聯(lián)素包被的植骨材料。
[0033]如圖1所示，本實施例制備的用脂聯(lián)素包被的植骨材料掃描電鏡圖像；可以觀察到凝膠成三維多孔結(jié)構(gòu)，殼聚糖大分子交聯(lián)形成中空的支架，孔隙均勻，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
[0034] 本實施例中制備的植骨材料，骨強度大，抗壓強度達為0.15Mpa ;易于降解，降解速度為28天。
[0035]實施例2
[0036]用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，包括以下步驟:
[0037]步驟1，制備改性煅燒骨材料；選用脛骨的骨骺端作為骨原料，經(jīng)去離子水充分蕩洗并以物理或生物化學(xué)的方法基本去除膠原蛋白；然后利用磷酸二氫銨，按照化學(xué)反應(yīng)平衡方程配比對骨的基質(zhì)(骨鹽)進行改性，使骨基質(zhì)的Ca/P原子比降至1.5 ;然后在800°C溫度條件下煅燒改性后的骨原料徹底去除骨材料的免疫抗原性，獲得改性煅燒骨材料。
[0038]步驟2，取2000mg分子量在2xl05的羧甲基殼聚糖，將所述羧甲基殼聚糖溶于70ml體積分數(shù)為2%的乙酸溶液形成羧甲基殼聚糖溶液；將所述溶液與1000mg改性煅燒骨材料混合形成混合物；
[0039]步驟3，步驟2中的混合物經(jīng)Co60照射滅菌(超過10小時)，然后向其中加入0.5mg 人重組脂聯(lián)素(recombinant human globular adiponectin, rh-gAPN),均勻混合后在四氟乙烯平皿中使用液氮中快速塑型，使用有機溶劑凍干機(FD8-6a，上海人和科學(xué)儀器有限公司)，于_30°C冷凍過夜干燥后即得用脂聯(lián)素包被的植骨材料。
[0040]在本實施例制備的用脂聯(lián)素包被的植骨材料掃描電鏡圖像中可以觀察到凝膠成三維多孔結(jié)構(gòu)，殼聚糖大分子交聯(lián)形成中空的支架，孔隙均勻，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
[0041]本實施例中制備的植骨材料，骨強度為0.15Mpa ;易于降解，降解時間為30天。
[0042]實施例3
[0043]用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，包括以下步驟:
[0044]步驟1，制備改性煅燒骨材料；選用新生小牛關(guān)節(jié)頭作為骨原料，經(jīng)去離子水充分蕩洗并以物理或生物化學(xué)的方法基本去除膠原蛋白；然后利用磷酸，按照化學(xué)反應(yīng)平衡方程配比對骨的基質(zhì)(骨鹽)進行改性，使骨基質(zhì)的Ca/P原子比降至1.66 ;然后在1100°C溫度條件下煅燒改性后的骨原料徹底去除骨材料的免疫抗原性，獲得改性煅燒骨材料。
[0045]步驟2，取3000mg分子量在3xl05的羧甲基殼聚糖，將所述羧甲基殼聚糖溶于80ml體積分數(shù)為2%的乙酸溶液形成羧甲基殼聚糖溶液；將所述溶液與1000mg改性煅燒骨材料混合形成混合物；
[0046]步驟3，步驟2中的混合物經(jīng)Co60照射滅菌(超過10小時)，然后向其中加入
1.5mg 人重組脂聯(lián)素(recombinant human globular adiponectin, rh-gAPN),均勻混合后在四氟乙烯平皿中使用液氮中快速塑型，使用有機溶劑凍干機(FD8-6a，上海人和科學(xué)儀器有限公司)，于_30°C冷凍過夜干燥后即得用脂聯(lián)素包被的植骨材料。
[0047]在本實施例制備的用脂聯(lián)素包被的植骨材料掃描電鏡圖像中可以觀察到凝膠成三維多孔結(jié)構(gòu)，殼聚糖大分子交聯(lián)形成中空的支架，孔隙均勻，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
[0048]本實施例中制備的植骨材料，抗壓強度為0.15Mpa ;降解時間為30天。
[0049]效果例:用脂聯(lián)素包被的植骨材料對成骨細胞凋亡能力的影響
[0050]在96孔板中每孔加入5 X IO5個MC3T3細胞，隔日加入實施例1制備的用脂聯(lián)素包被的植骨材料的浸提液，于10% FBS的DMEM中復(fù)合培養(yǎng)24和48小時后終止培養(yǎng)，利用凋亡檢測試劑盒進行檢測(結(jié)果如圖2所示)。本實驗證明通過本法制備的用脂聯(lián)素包被的植骨材料對成骨細胞的前體細胞無毒性反應(yīng)。
[0051]實施例2和3制備的用脂聯(lián)素包被的植骨材料進行同樣實驗，對成骨細胞的前體細胞均無毒性反應(yīng)。
[0052]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所 作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 步驟(1)，制備改性煅燒骨材料； 步驟(2)，取2~3重量份分子量在2xl05~3xl05的羧甲基殼聚糖，將所述羧甲基殼聚糖溶于酸性溶液形成羧甲基殼聚糖溶液；將所述羧甲基殼聚糖溶液與I重量份改性煅燒骨材料混合形成混合物； 步驟(3)，步驟2中的混合物經(jīng)Co60照射滅菌，然后向其中加入人重組脂聯(lián)素，均勻混合后塑型，冷凍干燥后即得用脂聯(lián)素包被的植骨材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，其特征在于，步驟(1)，選用新生小牛關(guān)節(jié)頭或脛骨的骨骺端作為骨原料，經(jīng)去離子水充分蕩洗后利用改性劑對骨原料行改性，使骨基質(zhì)的Ca/P原子比降至1.66~1.5 ;然后在800°C~1100°C溫度條件下煅燒改性后的骨原料徹底去除骨材料的免疫抗原性，獲得改性煅燒骨材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，其特征在于，所述改性劑選自磷酸氫二銨、磷酸二氫銨和磷酸中的一種或任意幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，其特征在于，所述羧甲基殼聚糖分子量為2.5xl05。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，其特征在于，步驟(2)取2.5重量份分子量在2.5x10s的羧甲基殼聚糖，將所述羧甲基殼聚糖溶于酸性溶液形成羧甲基殼聚糖溶液；將所述羧甲基殼聚糖溶液與I重量份改性煅燒骨材料混合形成混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述混合物經(jīng)Co60照射滅菌，然后向其中加入0.0005~0.0015重量份的人重組脂聯(lián)素，均勻混合后在四氟乙烯平皿中使用液氮中快速塑型，冷凍干燥后即得用脂聯(lián)素包被的植骨材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的用脂聯(lián)素包被的植骨材料的制備方法，其特征在于，所述酸性溶液是體積分數(shù)為2%的乙酸溶液。
【文檔編號】A61L27/58GK103948964SQ201410136641
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】唐志輝, 毋育偉, 李箐 申請人:北京大學(xué)口腔醫(yī)院