一種包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球及其用途。它包括核殼球形結(jié)構(gòu)，所述核結(jié)構(gòu)的材料為聚乳酸，聚乳酸粘度為0.5-2.0dL/g；殼結(jié)構(gòu)的材料為聚乳酸與聚羥基乙酸組成的復(fù)合材料，所述復(fù)合材料中聚乳酸與聚羥基乙酸的質(zhì)量比為：75-50:25-50；所述核和殼內(nèi)分別包裹有一種生長因子，所述生長因子為BMP-7或PDGF-BB。本發(fā)明還提供所述包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球在制備誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)低細(xì)胞密度培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化藥物方面的應(yīng)用。該核殼結(jié)構(gòu)微球同時(shí)包裹兩種生長因子，并且先后釋放這兩種生長因子，使這兩種生長因子分別在最適合的時(shí)間得到釋放，效果好。
【專利說明】—種包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及功能性生物材料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]骨折愈合或修復(fù)是一個(gè)受多種生長因子(Growth factor, GF)綜合調(diào)控的過程，其中，成纖維細(xì)胞生長因子-2 (Fibroblast growth factor, FGF-2)與血小板衍生生長因子(PLLAtelet-derived growth factor, F1DGF-BB)等調(diào)節(jié)細(xì)胞增長與分裂,骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMPs)等能夠誘導(dǎo)間間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞前體。已有研究表明，在骨缺損修復(fù)過程中，兩種或多種生長因子聯(lián)用比單用一種生長因子的效果要好。然而，在骨缺損自然修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞生長因子_2(FGF-2)及血小板衍生生長因子(PDGF-BB)等主要在修復(fù)早期出現(xiàn)，在之后的骨分化及骨成熟階段則沒有表達(dá)；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)則主要在骨形成階段表達(dá)。大鼠骨缺損實(shí)驗(yàn)表明，用外源成纖維細(xì)胞生長因子-2 (FGF-2)短時(shí)間(如I周)作用能促進(jìn)血管生成，增大愈傷組織體積，刺激產(chǎn)生礦化作用，但長時(shí)間作用會延遲細(xì)胞成骨分化和成熟礦化?？赡艿脑蚴?，成纖維細(xì)胞生長因子-2 (FGF-2)對促細(xì)胞增殖有重要作用，但這種能力隨著軟骨細(xì)胞的形成而終止，需要其他的生長因子作用來繼續(xù)成骨分化。這些研究表明，設(shè)計(jì)控釋材料搭載細(xì)胞增殖因子【譬如血小板衍生生長因子(PDGF-BB)】和骨分化因子【譬如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)】模仿骨自然修復(fù)過程進(jìn)行體內(nèi)序貫釋放實(shí)驗(yàn)是成功突破骨再生策略的必要且關(guān)鍵的方法?，F(xiàn)有的絕大多數(shù)研究只考慮一種生長因子或幾種生長因子的簡單混合作用，限制了發(fā)展。目前的技術(shù)不能很好的控制兩種物質(zhì)精確釋放。因此，設(shè)計(jì)新的控制兩種因子釋放的搭載系統(tǒng)是有必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球，該核殼結(jié)構(gòu)微球可以同時(shí)包裹兩種生長因子(譬如血小板衍生生長因子(PDGF-BB)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7))，并且先后釋放這兩種生長因子，與骨折自然愈合過程中兩種生長因子出現(xiàn)的節(jié)奏契合，該核殼結(jié)構(gòu)微球可以高效誘導(dǎo)低細(xì)胞密度培養(yǎng)的骨髓間間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。本發(fā)明的另一目的是提供所述包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球在制備誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)低細(xì)胞密度培養(yǎng)的骨髓間間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化藥物方面的應(yīng)用。本申請的核-殼雙層微球載體可以控制多種生長因子控制釋放，有利于研究生長因子間的協(xié)調(diào)作用關(guān)系，為組織工程開辟了一個(gè)新方向。采用這種方法嚴(yán)格控制細(xì)胞增殖和成骨分化，不僅有利于研究這兩種生理活動(dòng)的協(xié)調(diào)作用，更為臨床治療大面積骨缺損提供了新的藥物。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
[0005]一種包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球，包括核殼球形結(jié)構(gòu)，所述核為聚乳酸，聚乳酸粘度為0.5-2.0dL/g ;殼為聚乳酸與聚羥基乙酸組成的復(fù)合材料，所述復(fù)合材料中聚乳酸與聚羥基乙酸的質(zhì)量比為:75-50:25-50 ;所述核和殼內(nèi)分別包裹有一種生長因子，所述生長因子為BMP-7或I3DGF-BB。
[0006]優(yōu)選方案:所述核包裹的生長因子是BMP-7，所述殼包裹的生長因子是TOGF-BB。
[0007]優(yōu)選方案:所述核殼結(jié)構(gòu)微球的外徑為18-22微米,所述核與殼的質(zhì)量比為:1:3-4,生長因子在核中的質(zhì)量百分比為0.002%-0.005%,生長因子在殼中的質(zhì)量百分比為
0.0008%-0.00125%。
[0008]更優(yōu)選方案:所述核殼結(jié)構(gòu)微球的核與殼的質(zhì)量比為:1:4，生長因子在核與殼中的質(zhì)量百分比分別為生長因子在核中的質(zhì)量百分比為0.003%，生長因子在殼中的質(zhì)量百分比為 0.001%。。
[0009]優(yōu)選方案:所述聚乳酸粘度為1.0dL/g。
[0010]優(yōu)選方案:所述聚乳酸與聚羥基乙酸的質(zhì)量比為:50:50。
[0011]所述包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球優(yōu)選通過以下方法制備得到:
[0012](I)將roGF-BB溶于去離子水制成濃度為I μ g/ml-100 μ g/ml的水相I，將復(fù)合材料溶于二氯甲烷制成質(zhì)量體積百分比為8%-12%的有機(jī)相I，水相I和有機(jī)相I按體積比為1:8-12混合后超聲乳化，得乳化液I ;按同樣方法將BMP-7溶于去離子水制成濃度為I μ g/ml-100 μ g/ml的水相II，將聚乳酸溶于乙酸乙酯制備得到質(zhì)量體積百分比為2%_5%的有機(jī)相II，水相II和有機(jī)相II按體積比為1:8-12混合后超聲乳化，得乳化液II ；
[0013](2)采用同軸靜電噴霧技術(shù)，將乳化液I和乳化液II分別噴入靜電噴霧裝置的同軸針的外針和內(nèi)針中，控制內(nèi)針中物質(zhì)的流量為1.ο-1.2ml/h,控制外針中物質(zhì)的流量為
1.5-2.0ml/h,在同軸針下方10cm_12cm處,用裝滿無水乙醇的培養(yǎng)皿接收制備的微球,然后水洗，再離心，冷凍干燥。
[0014]內(nèi)針和外針內(nèi)溶液的流量是很關(guān)鍵的，內(nèi)針中物質(zhì)的流量為1.0-1.2ml/h，外針中物質(zhì)的流量為1.5-2.0ml/h是比較優(yōu)化的，如果外針的流量太小，不能形成核殼結(jié)構(gòu)。
[0015]優(yōu)選方案:所述水相I中I3DGF-BB的濃度為5 μ g/ml-20 μ g/ml，所述有機(jī)相I中復(fù)合材料的質(zhì)量體積百分比為10% ;所述水相II中BMP-7的濃度為5μ g/ml-20l.! g/ml，所述有機(jī)相II中復(fù)合材料的質(zhì)量體積百分比為5%。
[0016]本申請還提供了所述包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球在制備誘導(dǎo)細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0017]本申請還提供了所述包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球在制備誘導(dǎo)低細(xì)胞密度培養(yǎng)的骨髓間間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化藥物中的應(yīng)用。
[0018]本申請還提供了所述包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球在制備治療骨折損傷藥物中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明公開了一種利用雙層核殼微球模擬自然骨再生過程微環(huán)境的方法，所述方法采用同軸靜電噴霧技術(shù)和同軸靜電噴霧設(shè)備(現(xiàn)有設(shè)備)，制備搭載骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)和血小板衍生生長因子(PDGF-BB)的聚乳酸(PLLA) /復(fù)合材料(PLGA)核殼微球，即將骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)和血小板衍生生長因子(PDGF-BB)分別包埋在微球的核和殼中。
[0020] 所述的同軸靜電噴霧設(shè)備，采用了同軸針由316L不銹鋼制成。外部毛細(xì)管(outercapillary)外徑為0.72mm,內(nèi)徑為0.50mm,成核毛細(xì)管(core capillary)外徑為0.40m和內(nèi)徑為0.20_。有兩個(gè)注射器泵以特定速率傳輸聚合物溶液到同軸針的內(nèi)外毛細(xì)管，使形成的微球具有殼核結(jié)構(gòu)。電壓發(fā)生器通過彈簧線夾給噴嘴供應(yīng)高電壓。為了穩(wěn)定噴嘴周圍電場，施加高電壓到噴嘴周圍的塞環(huán)(直徑5cm)。通過增加噴嘴電壓(Vnrazle)和塞環(huán)電壓(Vring)形成穩(wěn)定電位差,形成穩(wěn)定噴霧。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于:
[0022]本發(fā)明將兩種不同的生長因子通過同軸靜電噴霧包封在雙層殼-核結(jié)構(gòu)微球中，通過一步實(shí)現(xiàn)將兩種生長因子包封在微球的不同部位，實(shí)現(xiàn)對兩種生長因子的控制釋放?？刂漆尫艃煞N生長因子，能夠更好的模擬體內(nèi)的骨再生的自然微環(huán)境，對促進(jìn)骨再生起到最大的效果。現(xiàn)有許多骨再生療法只能釋放一種生長因子或簡單混合釋放兩種生長因子。因此，本發(fā)明通過一步實(shí)現(xiàn)包埋兩種生長因子在微球不同部位，使不同生長因子在不同時(shí)間以不同的釋放曲線釋放出來，與現(xiàn)有的單一因子釋放體系和簡單的兩種因子混合釋放體系比起來，先后釋放兩種生長因子的體系促骨再生的效果更好。【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是各種生長因子對間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)增殖的影響
[0024]圖2是各種生長因子對間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)生長周期分布的影響
[0025]圖3是各種生長因子對間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)成骨分化堿性磷酸酶活性的影響
[0026]圖4是各種生長因子對間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)成骨分化鈣沉積的影響
[0027]圖5是核殼微球體系中殼層材料中PLLA/PGA構(gòu)成比例對BMP-7釋放曲線的影響
[0028]圖6是核殼微球體系中核層材料中PLLA粘度對TOGF-BB釋放曲線的影響
[0029]圖7是核殼微球體系中殼層材料中PLLA/PGA構(gòu)成比例對TOGF-BB釋放曲線的影響
[0030]圖8是核殼微球體系中核層材料中PLLA粘度對BMP-7釋放曲線的影響[0031 ]圖9是不同微球體系的I3DGF-BB釋放曲線
[0032]圖10是不同微球體系的BMP-7釋放曲線
[0033]圖11是用不同微球處理后間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的ALP強(qiáng)度
[0034]圖12用不同微球處理后間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的鈣濃度
[0035]圖13是微球的制備過程示意圖，其中I是高壓電源，2是內(nèi)乳化液泵，3是外乳化液泵，4是外針，5是內(nèi)針，6是培養(yǎng)皿。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步解釋和說明
[0037]實(shí)施例1:
[0038]一種包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球，包括核殼球形結(jié)構(gòu)，所述核為聚乳酸，聚乳酸粘度為0.5-2.0dL/g ;殼為聚乳酸與聚羥基乙酸組成的復(fù)合材料，所述復(fù)合材料中聚乳酸與聚羥基乙酸的質(zhì)量比為:75-50:25-50 ;所述核和殼內(nèi)分別包裹有一種生長因子，所述生長因子為BMP-7或TOGF-BB。
[0039]一種包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球的具體制備過程，如圖13所示:
[0040](I)將PDGF-BB溶于去離子水制成濃度10 μ g/ml的水相；將復(fù)合材料溶于二氯甲烷制成質(zhì)量體積百分比(克/毫升)為10%的有機(jī)相，水相和有機(jī)相按體積百分比為1:10混合后超聲乳化，得乳化液I ;按同樣方法將BMP-7溶于去離子水制成濃度10 μ g/ml的水相；將聚乳酸溶于乙酸乙酯制備得到質(zhì)量體積比百分比(克/毫升)為3%的有機(jī)相，水相和有機(jī)相按體積比為1:10混合后超聲乳化，得乳化液II ;所述復(fù)合材料中聚乳酸-聚羥基乙酸的質(zhì)量比為:50:50 ；
[0041](2)采用同軸靜電噴霧技術(shù)，將乳化液I和乳化液II分別噴入靜電噴霧裝置的同軸針的外針和內(nèi)針中，控制內(nèi)針中物質(zhì)的流量為1.2ml/h,控制外針中物質(zhì)的流量為
1.5ml/h,在同軸針下方IOcm處,用裝滿無水乙醇的培養(yǎng)皿接收制備的微球,然后水洗，再離心，冷凍干燥。
[0042]靜電噴霧裝置的同軸針由316L不銹鋼制成，制殼針管的外徑為0.72mm，內(nèi)徑為0.50mm,制核針管的外徑為0.40mm和內(nèi)徑為0.20mm,裝置通過兩個(gè)注射器泵分別將PDGF-BB/核物料、BMP-7/殼物料通過不同的管道噴入同軸針，在同軸針下方IOcm處，用裝滿無水乙醇的培養(yǎng)皿接收制備的微球，以防微球凝聚。收集到的微球慢速離心后用去離子水清洗，再次離心后凍干。
[0043]所述核殼結(jié)構(gòu)微球的外徑為20微米，所述核與殼的質(zhì)量比為:1:4，生長因子在核中的質(zhì)量百分比為0.0033%，生長因子在殼中的質(zhì)量百分比為0.001%。
[0044]對比例:固定其它因素不變，制備方法同實(shí)施例1，僅改變包裹位置或者包裹的生長因子的位置作對比實(shí)驗(yàn):
[0045]將兩者生長因子同時(shí)包裹在普通單層微球結(jié)構(gòu)中，單層微球通過內(nèi)徑為0.50mm的單軸針頭制備，以下簡稱U;
[0046]將生長因子(PDGF-BB)同時(shí)包裹在具有殼核結(jié)構(gòu)的雙層微球中，以下簡稱PB (只包裹了一種生長因子);
[0047]將生長因子(BMP-7)同時(shí)包裹在具有殼核結(jié)構(gòu)的雙層微球中，以下簡稱B (只包裹了一種生長因子);
[0048]將生長因子(BMP-7)和生長因子(PDGF-BB)同時(shí)包裹在具有殼核結(jié)構(gòu)的雙層微球中，以下簡稱P (兩生長因子同時(shí)包裹在兩層結(jié)構(gòu)中)；
[0049]將生長因子TOGF-BB包裹在殼核結(jié)構(gòu)的核層材料內(nèi)，同時(shí)將BMP-7包裹在殼核結(jié)構(gòu)的殼層材料內(nèi)，以下簡稱SI ；
[0050]將生長因子BMP-7包裹在殼核結(jié)構(gòu)的核層材料內(nèi)，同時(shí)將I3DGF-BB包裹在殼核結(jié)構(gòu)的殼層材料內(nèi)，以下簡稱S2。
[0051]實(shí)施例2應(yīng)用研究
[0052]2.1細(xì)胞因子促間間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)增殖分析
[0053]通過細(xì)胞計(jì)數(shù)測定外源性生長因子的促細(xì)胞生長能力，血小板衍生生長因子(PDGF-BB)對間間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)細(xì)胞增殖的影響具有階段性，如圖1所示，當(dāng)濃度低于20ng/mL時(shí)，細(xì)胞數(shù)目與血小板衍生生長因子(PDGF-BB)濃度成線性關(guān)系，但再加大濃度時(shí)，促細(xì)胞增殖能力明顯減弱，20ng/mL血小板衍生生長因子(PDGF-BB)促增殖幅度約為50%。相反的，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)呈現(xiàn)出階段性的抑增殖作用，低濃度(0.1-1.0ng/ml)時(shí)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)對細(xì)胞增殖的促進(jìn)和抑制作用均不明顯，濃度高(10-200ng/ml)時(shí)能抑制細(xì)胞增殖，且抑制效果與劑量有關(guān)。[0054]多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)20ng/mL (固定值)血小板衍生生長因子(PDGF-BB)中添加骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)時(shí)，發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)抑制細(xì)胞增殖的能力強(qiáng)于血小板衍生生長因子(PDGF-BB)促細(xì)胞增殖能力，且骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)對血小板衍生生長因子(PDGF-BB)的抑制效果與骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)劑量有關(guān)。孵育2天后，與只用20ng/mL血小板衍生生長因子(PDGF-BB)處理相比，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)濃度為20ng/ml和200ng/ml時(shí)的抑增殖率分別為17%和24%。
[0055]骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)抑制細(xì)胞增殖可能是因?yàn)樗且环N誘骨形成蛋白，因此會阻斷間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)表明，與對照組相比，用20ng/mL血小板衍生生長因子(PDGF-BB)處理后，G0、G1期的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，S、G2和M期的數(shù)目明顯增多。相反，用100ng/ml骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)或同時(shí)含100ng/ml骨形態(tài)發(fā)生蛋白_7 (BMP-7)和20ng/ml血小板衍生生長因子(PDGF-BB)處理后，G0、G1期的細(xì)胞數(shù)目明顯增多，S、G2和M期的數(shù)目明顯減少。圖2表明，單獨(dú)使用骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)或與血小板衍生生長因子(PDGF-BB)同時(shí)使用沒有明顯區(qū)別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)或與血小板衍生生長因子(PDGF-BB)聯(lián)合使用骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)是將細(xì)胞生長周期阻斷在Gl期。[0056]2.2誘骨髓間間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)成骨分化因子分析
[0057]通過定量生化比色法測定不同樣品處理細(xì)胞后的堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase, ALP)-時(shí)間曲線檢測生長因子(Growth factors, GFs)對堿性磷酸酶(ALP)活性的影響。如圖3所示，用血小板衍生生長因子(PDGF-BB)處理細(xì)胞4周后，堿性磷酸酶(ALP)活性沒有增強(qiáng)，而用骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)處理2周后，堿性磷酸酶(ALP)活性顯著增強(qiáng)，并在檢測結(jié)束后保持這種增強(qiáng)作用。與單獨(dú)使用骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)相t匕，添加P血小板衍生生長因子(PDGF-BB)后，堿性磷酸酶(ALP)活性減少約4倍。
[0058]用0.6N鹽酸(HCl)提取經(jīng)不同樣品處理細(xì)胞后得到的含鈣礦物中的鈣，并測定鈣含量以進(jìn)行定量檢測。如圖4所示，經(jīng)對照組和血小板衍生生長因子(PDGF-BB)處理的實(shí)驗(yàn)組中，鈣濃度都較低，用骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)或地塞米松(dexamethasone, DEX)處理，或血小板衍生生長因子(PDGF-BB)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)同時(shí)處理后，鈣濃度則較高，且隨時(shí)間增加而增加。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)處理后的鈣濃度與DEX處理后的鈣濃度相當(dāng)，但血小板衍生生長因子(PDGF-BB)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)同時(shí)處理后的鈣濃度則低于其半值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，若同時(shí)釋放，則血小板衍生生長因子(PDGF-BB)會阻斷骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)的礦化作用。
[0059]2.1和2.2的研究結(jié)果顯示，這兩種生長因子作用機(jī)理和起作用的階段不同。同時(shí)使用時(shí)，若不能很好的控制釋放時(shí)間，會有相互影響，甚至抑制作用，不能使得兩者都達(dá)到較好的效果。
[0060]2.3控制釋放血小板衍生生長因子(PDGF-BB)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白_7 (BMP-7)的研
究
[0061]如圖5-6所示，包埋在殼中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)首先釋放，持續(xù)大量釋放6天后能緩慢釋放10天。相比較的，包埋在殼中的血小板衍生生長因子(PDGF-BB)則按S型曲線釋放，最初10天釋放量較少，接下來2周，釋放量逐漸增加并達(dá)到最大值。若對換兩種生長因子的搭載位置，將保持其釋放模式，即包埋在殼中的蛋白先釋放，包埋在核中的蛋白則后釋放。
[0062]如圖5、7所示，當(dāng)固定核層材料為PLLA (粘度1.0dL/g)時(shí)，改變殼層材料復(fù)合材料(PLGA)中PLLA =PGA的配比制備的核殼微球釋放生長因子(BMP7，圖5 ；PDGF-BB,圖7)的速率不同，當(dāng)PLGA中PLLA的比例提高時(shí)，釋放生長因子的速率降低。如圖6、8所示，當(dāng)固定殼層材料為PLGA (PLLA:PGA質(zhì)量比=50:50)時(shí)，改變核層材料PLLA的粘度制備的核殼微球釋放生長因子(PDGF-BB，圖5 ；BMP-7,圖7)的速率不同，當(dāng)PLLA的粘度增大時(shí)，釋放生長因子的速率降低。當(dāng)固定核層材料為PLLA(粘度1.0dL/g)時(shí)，殼層復(fù)合材料中PLLA = PGA質(zhì)量比=50:50時(shí)，能實(shí)現(xiàn)兩者生長因子的先后釋放，效果較好。
[0063]測定本申請與對比例中各種微球結(jié)構(gòu)對生長因子包封率(EE)的影響，結(jié)果見表1，并測得不同的釋放曲線，見圖9-10。
[0064]表1中，對比U和P可知，核殼結(jié)構(gòu)顯著提高了生長因子在核中的包封率，對比U和S1/S2可知?dú)ぶ猩L因子的包封率無變化。普通單層微球(U組)的釋放結(jié)果顯示初期呈現(xiàn)爆發(fā)式釋放，最初6天內(nèi)，血小板衍生生長因子(PDGF-BB)的釋放量高于60%，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)的釋放量達(dá)50%。接下來幾天血小板衍生生長因子(PDGF-BB)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)呈線性釋放，直至第30天時(shí)，兩種生長因子的釋放量達(dá)85%。從這方面看，U組中兩種生長因子呈平行釋放模式。與簡單單層微球相比，核殼雙層微球結(jié)構(gòu)復(fù)雜，能夠?qū)崿F(xiàn)多種控釋模式。
[0065]例如，核殼中均包埋血小板衍生生長因子(PDGF-BB)的PB組能實(shí)現(xiàn)血小板衍生生長因子(PDGF-BB)的線性釋放(忽略最初階段的微小突發(fā)釋放)。同樣的，忽略最初階段的突發(fā)釋放，核殼中均包埋骨BMP-7的B組也能實(shí)現(xiàn)BMP-7的線性釋放。P組核殼微球同時(shí)包埋血小板衍生生長因子(PDGF-BB)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)，與包埋等量生長因子的單層微球U組相比，兩種生長因子的釋放速率均慢，特別是在前2周(見圖9-10)。P組釋放血小板衍生生長因子(PDGF-BB)的速率比PB組快，可能原因是，P組中核殼微球集中了 PB組中的同一區(qū)域(核或殼)2倍的蛋白質(zhì)含量(見圖9-10)。
[0066]若兩種生長因子分別包埋在核殼微球中，則能實(shí)現(xiàn)兩種生長因子的控制釋放。如圖9、10所示，分別包埋血小板衍生生長因子(PDGF-BB)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白_7 (BMP-7)于核和殼中的SI組，在第I周，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)的釋放量達(dá)85%，而血小板衍生生長因子(PDGF-BB)的釋放量僅為15%，之后血小板衍生生長因子(PDGF-BB)釋放速率加快，3周后釋放量達(dá)85%。同理，S2組在I周后，血小板衍生生長因子(PDGF-BB)釋放量達(dá)95%，而骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)釋放量僅為10%，之后骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)釋放速率加快，3周后釋放量達(dá)88%。
[0067] 表1實(shí)驗(yàn)中各組樣品定義及蛋白包封率
[0068]
【權(quán)利要求】
1.一種包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球，包括核殼球形結(jié)構(gòu)，其特征是，所述核為聚乳酸，聚乳酸粘度為0.5-2.0dL/g ;殼為聚乳酸與聚羥基乙酸組成的復(fù)合材料，所述復(fù)合材料中聚乳酸與聚羥基乙酸的質(zhì)量比為:75-50:25-50 ;所述核和殼內(nèi)分別包裹有一種生長因子，所述生長因子為BMP-7或TOGF-BB。
2.一種包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球，其特征是，所述核包裹的生長因子是BMP-7，所述殼包裹的生長因子是I3DGF-BB。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球，其特征是，所述核殼結(jié)構(gòu)微球的外徑為18-22微米，所述核與殼的質(zhì)量比為:1:3-4，生長因子在核中的質(zhì)量百分比為0.002%-0.005%,生長因子在殼中的質(zhì)量百分比為0.0008%-0.00125%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球，其特征是，所述聚乳酸粘度為 1.0dL/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球，其特征是，所述聚乳酸與聚羥基乙酸的質(zhì)量比為:50:50。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球，其特征是，通過以下方法制 備得到: (1)將TOGF-BB溶于去離子水制成濃度為Iμ g/ml-100 μ g/ml的水相I，將復(fù)合材料溶于二氯甲烷制成質(zhì)量體積百分比為8%-12%的有機(jī)相I，水相I和有機(jī)相I按體積比為1:8-12混合后超聲乳化，得乳化液I ;按同樣方法將BMP-7溶于去離子水制成濃度為I μ g/ml-100μ g/ml的水相II，將聚乳酸溶于乙酸乙酯制備得到質(zhì)量體積百分比為2%_5%的有機(jī)相II，水相II和有機(jī)相II按體積比為1:8-12混合后超聲乳化，得乳化液II ； (2)采用同軸靜電噴霧技術(shù)，將乳化液I和乳化液II分別噴入靜電噴霧裝置的同軸針的外針和內(nèi)針中，控制內(nèi)針中物質(zhì)的流量為1.ο-1.2ml/h,控制外針中物質(zhì)的流量為1.5-2.0ml/h,在同軸針下方10cm_12cm處,用裝滿無水乙醇的培養(yǎng)皿接收制備的微球,然后水洗，再離心，冷凍干燥。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球，其特征是，所述水相I中PDGF-BB的濃度為5μ g/ml-20l.! g/ml，所述有機(jī)相I中復(fù)合材料的質(zhì)量體積百分比為10% ；所述水相II中BMP-7的濃度為5μ g/ml-20l.! g/ml，所述有機(jī)相II中復(fù)合材料的質(zhì)量體積百分比為3%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球在制備誘導(dǎo)細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球在制備誘導(dǎo)低細(xì)胞密度培養(yǎng)的骨髓間間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述包裹雙生長因子的核殼結(jié)構(gòu)微球在制備治療骨折損傷藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K38/18GK103919733SQ201410145438
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】聶和民 申請人:聶和民