一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，該方法綜合采用了病毒粒子洗脫法，二級純化法，重復(fù)洗濾法等一系列工藝，最大限度的增大了PCV2的回收效率，降低了純化成本。以本發(fā)明制備的豬圓環(huán)病毒濃縮液成品尤其適用于制備疫苗，以本發(fā)明制備的豬圓環(huán)病毒濃縮液成品制備的疫苗相對于現(xiàn)有技術(shù)的豬圓環(huán)病毒2型疫苗而言安全性高，均一性好、免疫效果好。同時，本發(fā)明工藝簡便、成本較低，具有突出的推廣前景。
【專利說明】一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病毒純化方法，尤其涉及一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2, PCV2)可能引起的一系列疾病，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemiewasting syndrome,PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephrophathysyndrome, PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex, PRDC)。
[0003]1997年，Clark等首次分離到豬圓環(huán)病毒2型。在2008年第20屆國際豬病大會上，圓環(huán)病毒病被列為當前危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的頭號疫病。我國在2000年證實豬群中存在PCV2感染，2002年由PCV2感染的引起的PWMS在全國呈暴發(fā)流行。豬圓環(huán)病毒病造成豬只生長慢，飼料報酬低，機體免疫力下降，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重威脅和巨大經(jīng)濟損失。據(jù)調(diào)查，PCV2在我國的陽性率已經(jīng)達到80%以上。[0004]疫苗是預(yù)防該病的主要方法之一。目前，我國商品化的豬圓環(huán)病毒2型疫苗主要是全病毒滅活疫苗，其安全性和有效性主要受病毒滴度，抗原純凈性，滅活工藝及佐劑等因素的影響。商品化疫苗如果直接以細胞繁殖的病毒液進行成品苗的生產(chǎn)，會受到細胞破碎產(chǎn)物，培養(yǎng)基成分，細胞代謝產(chǎn)物等雜質(zhì)的影響，致使疫苗免疫動物后易發(fā)生過敏反應(yīng)，發(fā)熱反應(yīng)等副作用。所以，提高病毒滴度和抗原純凈性是提升疫苗質(zhì)量基本途徑。
[0005]中空纖維膜過濾技術(shù)屬于切向流過濾技術(shù)(Tangential Flow Filtration, TFF)的范疇，又稱錯流過濾(Cross-Flow Filtration, CFF):料液以一定的流速在膜的上表面循環(huán)，小于膜孔徑的物質(zhì)可以透過膜到透過端，而大于膜孔徑的物質(zhì)會被膜截留，從而實現(xiàn)目標物質(zhì)的濃縮以及不同物質(zhì)的分級分離。
[0006]和傳統(tǒng)的平板膜包相比，中空纖維膜具有纖維管狀的開放式流道結(jié)構(gòu)，無篩網(wǎng)的管狀流道結(jié)構(gòu)避免了料液的無規(guī)則劇烈湍流，因此具有更低的剪切力，溫和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脫落和蛋白的聚集，有利于保護病毒的完整性，防止病毒顆粒聚集的同時有助于雜蛋白的透過和去除。
[0007]目前，對于豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的中空纖維純化及濃縮工藝尚無報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有豬圓環(huán)病毒2型疫苗副反應(yīng)率高、均一性差、免疫效果差等技術(shù)問題，提供一種使用微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)實現(xiàn)的豬圓環(huán)病毒2型純化方法。
[0009]為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0010]一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，該方法通過微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)來實現(xiàn)，過程如下:
[0011]I系統(tǒng)的組裝[0012]無菌條件下，將微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)按照組裝要求進行組裝。在微濾澄清純化系統(tǒng)中可安裝無菌0.45 μ m或0.65 μ m、完整無損的中空纖維微濾膜,在超濾濃縮純化系統(tǒng)中可安裝無菌100KD或300KD、完整無損的中空纖維超濾膜。
[0013]2系統(tǒng)完整性檢測
[0014]壓力保持法檢測系統(tǒng)的完整性。
[0015]3系統(tǒng)的處理
[0016]3.1清洗及滅菌
[0017]將0.5M NaOH溶液注滿系統(tǒng)的進料罐，浸泡處理20min，開啟循環(huán)泵300rpm，進行系統(tǒng)的清洗及滅菌處理30min。
[0018]3.2水洗及通量檢測
[0019]滅囷結(jié)束后，排盡系統(tǒng)內(nèi)的NaOH溶液。將無囷超純水注?兩系統(tǒng)的進料--!，開啟循環(huán)泵，300rpm循環(huán)30min，棄盡系統(tǒng)內(nèi)的液體，如此反復(fù)水洗，直至系統(tǒng)內(nèi)PH為7.0左右。
[0020]3.3PBS 處理
[0021]水洗結(jié)束后，棄盡最后一次超純水。將0.1M PBS溶液注滿進料罐，開啟循環(huán)泵300rpm循環(huán)沖洗20min。
[0022]上述所述技術(shù)方案中，步驟3.1和3.2中用到的NaOH溶液起到清洗、滅菌作用，也可選用50%~80%的酒精溶液，或采用蒸汽滅菌的方式進行系統(tǒng)滅菌。
[0023]一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，該方法通過微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)來實現(xiàn)，該方法包括以下步驟:
[0024]I)將無菌吐溫20按0.5%~10%(v/v)的比例加入豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)病毒液中，振蕩處理；
[0025]2)將步驟I)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統(tǒng)的進料罐中，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間后經(jīng)0.45或0.65 μ m中空纖維微濾柱微濾，收集透過液待用；
[0026]3)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第一洗濾液待用；
[0027]4)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟3)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第二洗濾液待用；
[0028]5)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟4)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第三洗濾液待用；
[0029]6)將上述透過液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液；
[0030]7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮純化系統(tǒng)的進料罐，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，經(jīng)100~300KD中空纖維超濾柱進行超濾處理，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為初級濃縮病毒液；
[0031]8)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的初級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為二級濃縮病毒液；
[0032]9)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的二級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為三級濃縮病毒液；
[0033] 10)以1:1 (v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的三級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。[0034]將上述制備的病毒濃縮液成品保存于_20°C。
[0035]上述豬圓環(huán)病毒2型純化方法，采用的是二步純化法，第一步通過較大孔徑的澄清純化濾膜過濾病毒液，除去毒液中的細胞碎片；第二步通過較小孔徑的澄清純化濾膜洗濾第一步的濾過液，達到除去病毒液中的吐溫20、小分子蛋白，細胞代謝產(chǎn)物的小分子物質(zhì)等雜質(zhì)及實現(xiàn)濃縮病毒等目的。
[0036]上述豬圓環(huán)病毒2型純化方法中，步驟I)所述的振蕩處理時間優(yōu)選為IOmin ;步驟I)所述的比例優(yōu)選為5% ;步驟2)所述的微濾的濾膜孔徑優(yōu)選為0.65 μ m ;步驟7)所述的超濾濾膜孔徑優(yōu)選為300KD ;步驟2、3、4、5、7、8、9、10中所述的開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間的操作條件均優(yōu)選為400rpm循環(huán)30min ;利用該方法制備的病毒濃縮液成品用于制備疫苗；上述所述病毒澄清純化及濃縮方法，步驟2)中透過液的體積可以根據(jù)需要進行調(diào)整，優(yōu)選為透過液體積達到原液的90% ;步驟7)中的濃縮倍數(shù)可以根據(jù)實際需要進行調(diào)整，優(yōu)選為濃縮10倍以上。
[0037]上述技術(shù)方案中，步驟I)所述的豬圓環(huán)病毒2型病毒液是指制備得到的病毒原液，未經(jīng)稀釋處理；步驟I)加入吐溫20起到乳化作用，能夠有效避免病毒粒子聚集成團，從而提升后續(xù)過濾效率。
[0038]所述微濾澄 清純化系統(tǒng)是指GE公司制造的QuixStand中空纖維澄清純化系統(tǒng)，型號為QAM-04SA/50 ;所述微濾膜可以選自GE公司制造的、型號為CFP-6-D-6A或CFP-4-E-6A的Pilot微濾柱膜；所述超濾膜可以選自GE公司制造的、型號為UFP-300-C-6A或UFP-100-C-6A的Pilot超濾柱膜。
[0039]上述制備的病毒濃縮液成品檢測方法如下:
[0040]對純化濃縮工藝過程中的病毒樣品進行病毒滴度及蛋白濃度檢測，以分析濃縮工藝的有效性。其中病毒滴度的檢測方法為:
[0041]以IFA法對各樣品的病毒滴度進行檢測，純化有效的判定標準為:二級純化及濃縮步驟的洗濾液檢測不出存活病毒，表明工藝有效；病毒的回收率在80%以上。
[0042]蛋白含量的測定方法為:
[0043]以蛋白濃度測定試劑盒對濃縮病毒液的蛋白殘存量進行測定，可溶性蛋白的殘存量應(yīng)低于原液可溶性蛋白的10%,表明工藝有效。
[0044]以上對本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
進行了詳細說明。本發(fā)明的純化方法綜合采用了病毒粒子洗脫法，二級純化法，重復(fù)洗濾法等一系列工藝，最大限度的增大了 PCV2的回收效率，降低了純化成本。以本發(fā)明制備的豬圓環(huán)病毒濃縮液成品尤其適用于制備疫苗，以本發(fā)明制備的豬圓環(huán)病毒濃縮液成品制備的疫苗相對于現(xiàn)有技術(shù)的豬圓環(huán)病毒2型疫苗而言安全性高，均一性好、免疫效果好。同時，本發(fā)明工藝簡便、成本較低，具有突出的規(guī)?；瘧?yīng)用前
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【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1是本發(fā)明微濾澄清純化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0046]圖2是本發(fā)明實施例1制備的PCV2濃縮液成品熒光圖(10-4)；
[0047]圖3是本發(fā)明實施例1中PCV2原液熒光圖(10-4);
[0048]圖4是本發(fā)明實施例1中洗濾液的熒光圖(10-1)；[0049]圖5是本發(fā)明實施例1中細胞對照組的熒光圖；
[0050]圖6是本發(fā)明實施例1各樣品的病毒滴度圖；
[0051 ]圖7是本發(fā)明實施例1各樣品的可溶性蛋白濃度圖；
[0052]圖8是本發(fā)明實施例1免疫反應(yīng)后抗體消長曲線圖(ELISA值)；
[0053]圖1 中:
[0054]1、進料罐2、中空纖維濾柱 3、蠕動泵
[0055]4、病毒原液進料管線5、透過液流出管線6、截留液流動管線
【具體實施方式】
[0056]實施例中所用儀器型號如下:
[0057]QuixStand中空纖維澄清純化系統(tǒng)，型號:QAM_04SA/50 ；
[0058]Pilot 微濾柱:CFP-6-D-6A(0.65 μ m)，CFP-4-E-6A(0.45 μ m)；
[0059]Pilot 超濾柱:UFP-300-C-6A(300KD)，UFP-100-C-6A(100KD)；
[0060]上述儀器均購自GE公司。
[0061]實施例中所用試劑如下:
[0062]100L豬圓環(huán)病毒2型病毒液，107 2TCID5Q/ml，由本公司生產(chǎn)；
[0063]PCV2-Cap蛋白單克隆抗體，購自浙江大學；
[0064]FITC標記羊抗鼠IgG,購自Sigma公司；
[0065]丙內(nèi)酯，購自上海譜振生物科技有限公司；
[0066]ISA28VG，購自法國賽比克公司；
[0067]PCV2ELISA抗體檢測試劑盒，購自瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司；
[0068]BCA蛋白定量試劑盒，購自康為世紀公司；
[0069]0.5Μ NaOHlOOL ；
[0070]無菌0.1M PBS100L ；
[0071]無菌高純水100L ;
[0072]吐溫20，分析純。
[0073]實施例1
[0074] I操作流程
[0075]1.1前處理
[0076]1.1.1系統(tǒng)的組裝
[0077]無菌條件下，將澄清純化系統(tǒng)和濃縮系統(tǒng)按照組裝要求進行組裝。在澄清系統(tǒng)中可安裝無菌0.65 μ m、完整無損的中空纖維微濾膜，在濃縮系統(tǒng)中安裝孔徑為300KD的無菌中空纖維超濾膜。
[0078]1.1.2系統(tǒng)完整性檢測
[0079]壓力保持法檢測系統(tǒng)的完整性。
[0080]1.1.3系統(tǒng)的處理
[0081]清洗及滅菌:
[0082]將0.5M NaOH溶液注滿系統(tǒng)的進料罐，浸泡處理20min，開啟循環(huán)泵300rpm，進行系統(tǒng)的清洗及滅菌處理30min。[0083]水洗及通量檢測:
[0084]滅囷結(jié)束后，排盡系統(tǒng)內(nèi)的NaOH溶液。將無囷超純水注?兩系統(tǒng)的進料--!，開啟循環(huán)泵，300rpm循環(huán)30min，棄盡系統(tǒng)內(nèi)的液體，如此反復(fù)水洗，直至系統(tǒng)內(nèi)PH為7.0左右。
[0085]PBS 處理:
[0086]水洗結(jié)束后，棄盡最后一次超純水。將0.1M PBS溶液注滿進料罐，開啟循環(huán)泵300rpm循環(huán)沖洗20min。
[0087]1.2病毒的澄清純化
[0088]1.2.1病毒液的處理
[0089]將5L無菌吐溫20加入100L豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)病毒液中，振蕩處理lOmin。
[0090]1.2.2病毒液的澄清
[0091]澄清系統(tǒng)處理完畢后，棄盡系統(tǒng)內(nèi)的PBS溶液，將振蕩處理后的病毒液，注入澄清純化系統(tǒng)的進料罐中，開啟循環(huán)泵，400rpm循環(huán)30min,經(jīng)0.65 μ m中空纖維微濾柱進行純化處理，收集透過液90L，進料罐內(nèi)存留截留液10L。
[0092]1.2.3截留液的洗濾
[0093]第一次洗濾:
[0094]將IOL無菌的0.1M PBS加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵400rpm循環(huán)30min，收集透過液10L，記為洗濾液I。
[0095]第二次洗濾:
[0096]將IOL無菌的0.1M PBS加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵400rpm循環(huán)30min,收集透過液10L，記為洗濾液2。
[0097]第三次洗濾:
[0098]將IOL無菌的0.1M PBS加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵400rpm循環(huán)30min,收集透過液10L，記為洗濾液3。
[0099]1.2.4病毒液的收集
[0100]將上述澄清純化過程所收集的透過液及三次洗濾液混合均勻，得到混合液120L。
[0101]1.2.5初級濃縮
[0102]濃縮系統(tǒng)處理完畢后，將混合液注入濃縮系統(tǒng)的進料罐，開啟循環(huán)泵，400rpm循環(huán)30min,經(jīng)300KD中空纖維超濾柱進行純化處理,棄去透過液,進料罐中剩余截留液10L,記為初級濃縮病毒液。
[0103]1.2.6濃縮液的洗濾
[0104]第一次洗濾:
[0105]將10L0.1M PBS注入進料罐中的初級濃縮液中，重懸，開啟循環(huán)泵，400rpm循環(huán)30min，棄去透過液10L，進料罐中剩余截留液10L，記為二級濃縮病毒液。
[0106]第二次洗濾:
[0107]將10L0.1M PBS注入進料罐中的二級濃縮液，重懸，開啟循環(huán)泵，400rpm循環(huán)30min，棄去洗濾液10L，進料罐中剩余截留液10L，記為三級濃縮病毒液。
[0108]第三次洗濾:
[0109]將10L0.1M PBS注入進料罐中的三級濃縮液，重懸，開啟循環(huán)泵，400rpm循環(huán)30min，棄去洗濾液10L，進料罐中剩余截留液10L，即為病毒濃縮液成品。[0110]1.2.7病毒液的收集
[0111]將經(jīng)過上述處理后的得到的病毒濃縮液成品進行收集，保存于_20°C。
[0112]2有效性檢測
[0113]對純化濃縮工藝過程中的病毒樣品進行病毒滴度及蛋白濃度進行檢測，以分析濃縮工藝的有效性。
[0114]2.1病毒滴度的檢測:
[0115]以IFA法對各樣品的病毒滴度進行檢測，具體步驟如下:
[0116]2.1.1細胞的鋪板及培養(yǎng)
[0117]以0.25%的EDTA-胰酶將生長良好的檢測用豬腎細胞(PK15)進行消化，以細胞生長液重懸為2X 105/ml并接種于96孔細胞培養(yǎng)板，IOOul/孔，置于37°C，5%C02細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。[0118]2.1.2病毒的梯度稀釋
[0119]將各收集的毒液樣品取樣，以0.1M PBS進行10倍倍比稀釋10個梯度(KT1~10_10)。
[0120]2.1.3病毒的接種及培養(yǎng)
[0121 ] 將稀釋后各梯度病毒液接種于步驟(1)所述的檢測用細胞，IOOul/孔，每個梯度8個重復(fù)，同時設(shè)置不接病毒液的細胞對照，37°C，5%C02細胞培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)72h。
[0122]2.1.4IFA 檢測
[0123]維持培養(yǎng)結(jié)束后，棄盡板內(nèi)維持液，以固定液(甲醇丙酮混合，1:1)對細胞進行固定，IOOul/ 孔，-200C，5 ~IOmin0
[0124]棄盡固定液，將細胞板進行風干。
[0125]以1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液進行封閉處理，IOOul/孔，37 °C，孵育30~60mino
[0126]以0.1M PBS洗3遍，200 μ I/孔。將500~700倍稀釋的PCV2_cap蛋白單克隆抗體(一抗)添加于細胞培養(yǎng)板，100 μ I/孔，37°C，孵育30~60min。
[0127]棄盡一抗溶液，以0.1M PBS洗5遍，200 μ I/孔。添加800-1000倍稀釋的熒光色素(FITC)標記的羊抗鼠IgG抗體(二抗)，100μ I/孔，37°C，孵育30~60min。
[0128]棄盡二抗溶液，以0.1M PBS洗5遍，200 μ I/孔，熒光顯微鏡下觀察。
[0129]2.1.5統(tǒng)計并計算病毒滴度
[0130]統(tǒng)計出現(xiàn)特異熒光孔的數(shù)目，以Reed-Muench法對豬瘟病毒的滴度(TCID50)進行計算，結(jié)果證實，濃縮后的病毒液產(chǎn)生的熒光數(shù)明顯高于濃縮前的病毒液，濃縮階段的洗濾液無特異熒光，純化過程各階段的樣品的病毒滴度顯示，濃縮病毒滴度達到108_°TCID5(l/ml，濃縮階段的洗濾液無效價，病毒回收率接近100%。
[0131]2.2可溶性蛋白的檢測
[0132]取各樣品以BCA蛋白濃度試劑盒進行測定，結(jié)果顯示，可溶性蛋白殘存率為9.3%。
[0133]3疫苗制備
[0134]以上述工藝制備的病毒濃縮液作為原料，進一步制備疫苗，其工藝步驟如下:
[0135]3.1 滅活
[0136]將純化濃縮后的PCV2毒液以0.1M PBS進行稀釋，使其病毒滴度達到107_ tlTCID5tl/ml，將純化前的PCV2病毒液(107_°TCID5(l/ml)與純化后的PCV2病毒液(107_°TCID5(l/ml)分別置于滅活容器中，按1:2000加入β -丙內(nèi)酯，攪拌滅活48h，而后置37°C水浴2小時，終止滅活。
[0137]3.2 乳化
[0138]將徹底滅活的兩份毒液，分別置于乳化容器中，按水相與油相3:1，緩慢向病毒液中加入ISA28VG，800r/min攪拌30min，制備為水包油型疫苗，將純化前的PCV2病毒液和純化后的PCV2病毒液制備的疫苗分別記為:PCV2滅活疫苗I和PCV2滅活疫苗2。
[0139]4疫苗安全檢驗
[0140]以上述工藝制備的PCV2滅活疫苗1，PCV2滅活疫苗2，無菌0.1M PBS溶液作為實驗試劑；取20日齡PCV2ELISA抗體陰性、PCV2抗原陰性健康易感仔豬15頭作為實驗動物。具體操作步驟如下:
[0141]4.1動物分組
[0142]將15頭仔豬隨 機分為3組，每組5頭。
[0143]4.2疫苗免疫
[0144]腹腔注射兩種疫苗及PBS于試驗用仔豬，如下操作:
[0145]第一組，每頭仔豬頸部肌肉注射4ml PCV2滅活疫苗1，共5頭；
[0146]第一組，每頭仔豬頸部肌肉注射4ml PCV2滅活疫苗2，共5頭；
[0147]第一組，每頭仔豬頸部肌肉注射4ml PBS，共5頭。
[0148]疫苗免疫后連續(xù)觀察14天。
[0149]4.3實驗結(jié)果
[0150]免疫后，各組仔豬均無不良反應(yīng)，純化疫苗組仔豬日增重優(yōu)于普通疫苗組，各組仔豬體溫無明顯波動，結(jié)果如表1所示。
[0151]表1各組仔豬體重增長及體溫紀錄
[0152]
【權(quán)利要求】
1. 一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，其特征在于使用微濾澄清純化系統(tǒng)和超濾濃縮純化系統(tǒng)，并包括以下步驟: O將無菌吐溫20按0.5%~10%(v/v)的比例加入豬圓環(huán)病毒2型病毒液中，振蕩處理； 2)將步驟I)振蕩處理后的病毒液注入微濾澄清純化系統(tǒng)的進料罐中，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間后經(jīng)0.45或0.65 μ m中空纖維微濾柱微濾,收集透過液待用； 3)以l:l(v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第一洗濾液待用； 4)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟3)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第二洗濾液待用； 5)以1:1 (v/v)的比例將無菌的0.1M PBS緩沖液加入到步驟4)處理完畢的進料罐中的截留液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，收集透過液，得到第三洗濾液待用； 6)將上述透過液、第一洗濾液、第二洗濾液、第三洗濾液混合均勻，得到混合液； 7)將步驟6)得到的混合液注入超濾濃縮純化系統(tǒng)的進料罐，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，經(jīng)100KD或300KD中空纖維超濾柱進行超濾處理，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為初級濃縮病毒液； 8)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的初級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間，棄去透過液，收集進料罐中剩余截留液，即為二級濃縮病毒液； 9)以l:l(v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的二級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為三級濃縮病毒液； 10)以1:1 (v/v)的比例將0.1M PBS注入進料罐中的三級濃縮病毒液中，重懸，開啟循環(huán)泵，循環(huán)一定時間，棄去洗濾液，收集進料罐中剩余截留液，即為病毒濃縮液成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，其特征在于步驟I)所述的振蕩處理時間為IOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，其特征在于步驟I)所述的比例為5% ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，其特征在于步驟2)所述的微濾的濾膜孔徑為0.45或0.65 μ m,較優(yōu)的為0.65 μ m。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，其特征在于步驟7)所述的超濾濾膜孔徑為300KD。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，其特征在于步驟2、3、4、5、7、8、9、10中所述的開啟循環(huán)泵循環(huán)一定時間的操作條件均為400rpm循環(huán)30min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6所述的一種豬圓環(huán)病毒2型純化方法，其特征在于利用該方法制備的病毒濃縮液成品用于制備疫苗。
【文檔編號】A61P31/20GK103937756SQ201410145472
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】李倬, 吳全忠, 米娜, 丁旭娜, 呂茂杰, 楊保收, 梁武, 李守軍 申請人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司