使用遺傳修飾的乳桿菌通過(guò)抗原的粘膜遞送治療免疫疾病的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及通過(guò)經(jīng)由微生物特別是乳酸乳球菌粘膜遞送分泌的免疫顯性抗原來(lái)治療自身免疫和變應(yīng)性疾病。
【專(zhuān)利說(shuō)明】使用遺傳修飾的乳桿菌通過(guò)抗原的粘膜遞送治療免疫疾病
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年I月25日、申請(qǐng)?zhí)枮?00880004735.4的同名申請(qǐng)的分
案申請(qǐng)。
[0002]本發(fā)明涉及通過(guò)經(jīng)由微生物特別是乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)粘膜遞送分泌的免疫顯性抗原來(lái)治療自身免疫和變應(yīng)性疾病。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]免疫系統(tǒng)具有區(qū)別自身和非自身物質(zhì)的任務(wù)。沿著呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道存在的粘膜免疫系統(tǒng)具有與豐富的細(xì)菌和無(wú)害抗原例如食物、空氣播散的抗原或共生的細(xì)菌群落共存的另外的負(fù)荷。粘膜免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵特征是它保留對(duì)這些抗原耐受的能力，同時(shí)保留有效擊退病原體的能力。無(wú)論通過(guò)注射還是損傷，全身性引入抗原導(dǎo)致炎性細(xì)胞的局部浸潤(rùn)和特異性免疫球蛋白的產(chǎn)生。相比之下，在粘膜表面例如胃腸道和泌尿生殖道處引入的抗原引發(fā)免疫應(yīng)答對(duì)于那些抗原的全身性有效抑制。通過(guò)經(jīng)由胃腸道施用抗原特異性誘導(dǎo)這些被調(diào)節(jié)的應(yīng)答稱(chēng)為口服耐受性(oral tolerance)?？乖慕?jīng)口施用可以導(dǎo)致全身性無(wú)應(yīng)答性，并且是具有不希望有的副作用(例如類(lèi)固醇)的免疫抑制醫(yī)學(xué)發(fā)明的有吸引力的替代物。本發(fā)明 特別地屬于通過(guò)持續(xù)暴露于低劑量的抗原獲得的低劑量耐受性的領(lǐng)域。經(jīng)由粘膜的耐受性誘導(dǎo)已提議作為針對(duì)自身免疫、變應(yīng)性和炎性疾病的治療策略。
[0004]技術(shù)發(fā)展水平
[0005]本發(fā)明背景的下述討論僅用于幫助讀者理解本發(fā)明，并非承認(rèn)其描述或構(gòu)成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
[0006]自身免疫、變應(yīng)性和炎性疾病對(duì)患者和社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致降低的生活質(zhì)量和巨大成本。此外，不存在具有可接受的副作用或在全社會(huì)中合適的適當(dāng)治療。關(guān)于自身免疫疾病的目前治療在很大程度上是姑息性的，一般是免疫抑制或抗炎性的。非免疫治療例如在橋本氏甲狀腺炎或DMl型中的激素替代產(chǎn)生自身攻擊性應(yīng)答的結(jié)果。類(lèi)固醇或NSAID治療限制了許多疾病的炎性癥狀。IVIG用于CIDP和GBS。更具體的免疫調(diào)節(jié)治療例如TNFa拮抗劑依那西普已顯示在治療RA中是有用的。然而，這些免疫治療可能與增加的不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，例如對(duì)感染增加的易感性?？梢员碚鳛槁孕∧c炎癥的乳糜瀉(celiacdisease)僅能夠通過(guò)限制的飲食進(jìn)行有效治療，這要求終生禁食包含小麥、黑麥或大麥的食物。雖然嚴(yán)格不含谷蛋白的飲食可以導(dǎo)致小腸治愈，但對(duì)谷蛋白的不耐受性是永久的。
[0007]也稱(chēng)為口炎性腹瀉(celiac sprue)或谷蛋白敏感性腸病的乳糜瀉是慢性炎性疾病，其由針對(duì)包含谷蛋白的特別飲食谷物的免疫應(yīng)答發(fā)展。可以基于腹瀉、脂糞、腹部氣脹和絞痛、重量減輕、代謝性骨疾病、貧血的常規(guī)表現(xiàn)以及對(duì)于麥醇溶蛋白和組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)具有特異性的血清抗體(也稱(chēng)為抗肌內(nèi)膜)的存在進(jìn)行診斷。粘膜損傷集中于小腸的近端部分，并且特征在于絨毛萎縮、隱窩細(xì)胞增生、以及上皮和固有層的淋巴細(xì)胞性浸潤(rùn)，其響應(yīng)麥醇溶蛋白釋放促炎細(xì)胞因子例如IL-2和IFN-Y。乳糜瀉可以視為人中最常見(jiàn)的食物敏感性腸病，并且可以在個(gè)人生命中的任何時(shí)候出現(xiàn)。其流行率在西方、阿拉伯和印度人口中為1:100至1:300。除谷蛋白外，該疾病還可以在手術(shù)、病毒感染、嚴(yán)重情緒應(yīng)激、妊娠或分娩后首次觸發(fā)。
[0008]因此，抗原特異性口服耐受性的誘導(dǎo)將是有吸引力的治療方法。盡管口服耐受性在1911年首次描述，但直到20世紀(jì)70年代末期研究者才開(kāi)始致力于所涉及的機(jī)制(Mayer和Shao，2004a)。對(duì)于口服耐受性的發(fā)展已提出幾個(gè)機(jī)制，從抗特異性T細(xì)胞的缺失、超過(guò)免疫偏離和無(wú)反應(yīng)性的誘導(dǎo)到經(jīng)由Treg的抑制(Mucida等人，2005)。大多數(shù)研究者認(rèn)為，存在獲得口服耐受性的2種不同途徑，在單次高劑量抗原后獲得的高劑量耐受性，其基于無(wú)反應(yīng)性和/或缺失(Friedman和Weiner, 1994),和通過(guò)反復(fù)暴露于低劑量抗原獲得的低劑量耐受性，其通過(guò)經(jīng)由CD4+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答的有效抑制介導(dǎo)，所述CD4+T細(xì)胞包括Foxp3+、IL-10和/或TGF-β產(chǎn)生調(diào)節(jié)T細(xì)胞。重要的是，通過(guò)粘膜耐受誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)T細(xì)胞已顯示介導(dǎo)旁觀(guān)者抑制(bystander suppression),即通過(guò)其對(duì)于一種蛋白質(zhì)特異的調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制附近效應(yīng)細(xì)胞對(duì)另一種蛋白質(zhì)的應(yīng)答的過(guò)程。旁觀(guān)者抑制是抗原誘導(dǎo)的抑制的另一個(gè)重要特征，因?yàn)檎T導(dǎo)器官特異性自身免疫的抗原庫(kù)大部分是未知的，并且它廢除了表位擴(kuò)展(epitope spreading)現(xiàn)象。表位擴(kuò)展是自身免疫和變應(yīng)性疾病的并發(fā)癥,通過(guò)其起始免疫應(yīng)答隨著時(shí)間擴(kuò)展，以誘導(dǎo)對(duì)于其他抗原的應(yīng)答。
[0009]用于治療和預(yù)防應(yīng)用的分子的靶向和更有效遞送是醫(yī)藥工業(yè)所優(yōu)先考慮的。有效的策略應(yīng)通過(guò)使分子集中于所需作用位點(diǎn)來(lái)減少所需劑量、增加安全性和改善功效。與注射比較，藥物和疫苗遞送的粘膜途徑提供許多后勤和生物學(xué)優(yōu)點(diǎn)。由于易于施用，經(jīng)口遞送是特別有吸引力的。然而，胃腸道降解和低水平的吸收一般使得這個(gè)途徑對(duì)于肽和蛋白質(zhì)藥物遞送無(wú)效。可選的粘膜途徑例如鼻、直腸、肺和眼途徑也正進(jìn)行研究。
[0010]因此，在本領(lǐng)域中 存在有效誘導(dǎo)抗原耐受性的問(wèn)題。
[0011]發(fā)明概述
[0012]令人驚訝地，我們發(fā)現(xiàn)在患者的粘膜位點(diǎn)處遞送且優(yōu)選持續(xù)存在的免疫顯性抗原誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受性。特別地，當(dāng)微生物例如優(yōu)選地乳酸乳球菌(LL)(其持續(xù)表達(dá)和分泌免疫顯性抗原)在粘膜位點(diǎn)處每日遞送時(shí)，誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受性。觀(guān)察到與所述抗原或所述微生物的單獨(dú)粘膜遞送相比，此種抗原經(jīng)由乳酸乳球菌微生物的粘膜遞送產(chǎn)生明顯更好的抗原特異性免疫應(yīng)答抑制。
[0013]我們證實(shí)本發(fā)明可以以比用單獨(dú)的抗原或?qū)φ杖樗崛榍蚓膯我化煼ǜ叩枚嗟墓πдT導(dǎo)口服耐受性。抗原特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞的體內(nèi)激活得到顯著增強(qiáng)。特別地，麥醇溶蛋白衍生肽的粘膜遞送誘導(dǎo)局部和全身性DQ8限制性T細(xì)胞應(yīng)答的抑制，所述麥醇溶蛋白衍生肽對(duì)于由遺傳修飾的乳酸乳球菌產(chǎn)生的DQ8介導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答是免疫顯性的。處理導(dǎo)致脾細(xì)胞和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖能力的抗原特異性減少，這決定性地依賴(lài)于IL-10和TGF-β的產(chǎn)生，且與Foxp3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的顯著誘導(dǎo)相關(guān)。因?yàn)檫@種抗原遞送細(xì)菌方法具有甚至在確定的超敏性的背景中使得口服耐受性成為可能的能力，所以它可用于治療乳糜瀉和其他自身免疫和/或變應(yīng)性疾病。本發(fā)明的功效在自身免疫或變應(yīng)性疾病小鼠模型中，以及在治療的免疫滅活的背景中得到證實(shí)。
[0014]發(fā)明詳述
[0015]在本公開(kāi)內(nèi)容中，各種出版物、專(zhuān)利和公開(kāi)的專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)通過(guò)明確引用作為參考。這些出版物、專(zhuān)利和公開(kāi)的專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用在此并入本公開(kāi)容內(nèi)，以更充分地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展水平。[0016]一般技術(shù)
[0017]除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施將采用有機(jī)化學(xué)、藥理學(xué)、分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，所述常規(guī)技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)。此種技術(shù)在文獻(xiàn)中得到充分說(shuō)明，例如〃Molecular Cloning:A Laboratory Manual"第 2 版(Sambrook 等人，1989) /'Oligonucleotide Synthesis" (M.J.Gait,編輯，1984)；"Animal Cell Culture" (R.1.Freshney,編輯，1987) ,Methods in Enzymology^ 系列(Academic Press, Inc.) ;"Handbook of Experimental Immunology" (D.M.Weir &C.C.Blackwell,編輯);〃Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells〃 (J.M.Miller&M.P.Calos,編輯，1987);"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel 等人，編輯，1987 和期刊);"Polymerase Chain Reaction" (Mullis 等人，編輯，1994);和"CurrentProtocols in Immunology" (J.E.Coligan 等人，編輯，1991)。
[0018]定義
[0019]如本文所使用的，某些術(shù)語(yǔ)可以具有下述定義的含義。如說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中所使用的，除非上下文明確地另有說(shuō)明，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)提及物。例如，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”包括多個(gè)細(xì)胞，包括其混合物。類(lèi)似地，除非上下文明確地另有說(shuō)明，“化合物”用于如本文所描述的治療或藥劑制備的用途涉及使用本發(fā)明的一種或多種化合物用于此種治療和制備。[0020]如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“包含”意指組合物和方法包括所述元件，但不排除其他元件?！盎旧嫌伞M成”當(dāng)用于限定組合物和方法時(shí)，意欲排除對(duì)于組合具有任何基本重要性的其他元件。因此，基本上由如本文限定的元件組成的組合物將不排除來(lái)自分離和純
化方法的痕量污染物和藥學(xué)上可接受的載體，例如磷酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等?！坝?.....組
成”意欲排除超過(guò)痕量的其他成分和用于施用本發(fā)明組合物的其他基本方法步驟。由這些過(guò)渡術(shù)語(yǔ)各自限定的實(shí)施方案在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0021]發(fā)里
[0022]我們證實(shí)由微生物例如優(yōu)選地乳酸乳球菌分泌的免疫顯性抗原的粘膜遞送誘導(dǎo)局部和全身性T細(xì)胞應(yīng)答的抑制。處理導(dǎo)致脾細(xì)胞和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖能力的抗原特異性減少，這決定性地依賴(lài)于IL-1O和TGF- β的產(chǎn)生，且與Foxp3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的顯著誘導(dǎo)相關(guān)。這種抗原遞送細(xì)菌方法具有甚至在確定的超敏性的背景中使得口服耐受性成為可能的能力。因此它可用于治療乳糜瀉和其他自身免疫和/或變應(yīng)性疾病。本發(fā)明的功效在自身免疫和變應(yīng)性疾病小鼠模型中，以及在治療的免疫滅活的背景中得到證實(shí)。
[0023]本發(fā)明的第一個(gè)方面是用于誘導(dǎo)對(duì)抗原的免疫耐受性的方法，其包括所述抗原經(jīng)由微生物的粘膜遞送。
[0024]優(yōu)選地本發(fā)明涉及分泌抗原的微生物、優(yōu)選地非病原性微生物、更優(yōu)選地乳酸細(xì)菌或酵母、更加優(yōu)選地乳酸乳球菌用于制備用于粘膜遞送以治療患者中的免疫應(yīng)答相關(guān)疾病的藥劑、醫(yī)學(xué)食物或營(yíng)養(yǎng)食品的用途，其中所述抗原優(yōu)選持續(xù)存在于所述患者中。
[0025]優(yōu)選地，所述抗原由抗原表達(dá)微生物遞送。優(yōu)選地所述抗原由抗原分泌或抗原展示微生物或細(xì)胞內(nèi)抗原遞送。因此，本發(fā)明包含了這樣的實(shí)施方案，其中所述抗原展示在所述抗原表達(dá)微生物的表面上，或其中所述抗原被分泌，或所述抗原在消化后是游離的。
[0026]優(yōu)選地，本發(fā)明涉及抗原表達(dá)微生物用于制備用于粘膜遞送以誘導(dǎo)免疫耐受性的藥劑的用途。
[0027]優(yōu)選地,所述免疫耐受性在患者中被誘導(dǎo)。所述患者優(yōu)選是動(dòng)物。所述動(dòng)物優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，且優(yōu)選選自小鼠、大鼠、豬、牛、綿羊、馬和人。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是人。優(yōu)選地，所述免疫耐受性是粘膜耐受性。
[0028]靈
[0029]如本文所使用的，粘膜可以是任何粘膜，例如口腔粘膜、直腸粘膜、尿道粘膜、陰道粘膜、眼粘膜、頰粘膜、肺粘膜和鼻粘膜。如本申請(qǐng)自始至終所使用的，粘膜遞送包含至粘膜的遞送?？谇徽衬みf送包括頰、舌下和齒齦遞送途徑。因此，本發(fā)明涉及其中所述粘膜遞送選自直腸遞送、頰遞送、肺遞送、眼遞送、鼻遞送、陰道遞送和經(jīng)口遞送的方法。優(yōu)選地，所述粘膜遞送是經(jīng)口遞送，所述耐受性是口服耐受性。
[0030]如本申請(qǐng)自始至終所使用的，粘膜耐受性是動(dòng)物(包括人)中對(duì)抗原的特異免疫應(yīng)答性(immune responsiveness)的抑制,在所述動(dòng)物已經(jīng)由粘膜途徑暴露于所述抗原后。優(yōu)選地，所述粘膜耐受性是全身耐受性?？乖暮罄m(xù)暴露可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的每一種暴露，例如經(jīng)由腸胃外注射、通過(guò)粘膜遞送、或例如在自身抗原的情況下通過(guò)內(nèi)源生產(chǎn)暴露。口服耐受性是動(dòng)物(包括人)中對(duì)抗原的特異免疫應(yīng)答性的抑制，在所述動(dòng)物已經(jīng)由經(jīng)口途徑暴露于所述抗原后。低劑量口服耐受性是通過(guò)低劑量抗原誘導(dǎo)的口服耐受性，并且特征在于由環(huán)磷酰胺敏感性調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的有效免疫抑制，所述調(diào)節(jié)T細(xì)胞可以將耐受性轉(zhuǎn)移給首次用于實(shí)驗(yàn)的宿主。高劑量口服耐受性是由高劑量的抗原誘導(dǎo)的口服耐受性，對(duì)環(huán)磷酰胺處理不敏感，并且經(jīng) 由無(wú)反應(yīng)性和/或抗原特異性T細(xì)胞的缺失進(jìn)行至T細(xì)胞低反應(yīng)性的誘導(dǎo)。對(duì)環(huán)磷酰胺的敏感性的差異可以用于區(qū)別低劑量和高劑量耐受性(Strobel等人，1983)。優(yōu)選地,所述口服耐受性是低劑量口服耐受性,如由Mayer和Shao(2004b)描述的。
[0031]本發(fā)明因此涉及如本文所描述的方法或用途，其中相對(duì)于所述誘導(dǎo)之前，所述免疫耐受性的誘導(dǎo)是至少1.5、優(yōu)選2、更優(yōu)選3倍或更多?？蛇x地，相對(duì)于所述誘導(dǎo)之前，耐受所述抗原至少1.5、2、3倍或更多。免疫耐受性的誘導(dǎo)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行測(cè)量。優(yōu)選地，所述免疫耐受性的誘導(dǎo)可以通過(guò)所述動(dòng)物中細(xì)胞因子水平的調(diào)節(jié)來(lái)測(cè)量。像這樣，調(diào)節(jié)可以是細(xì)胞因子水平的增加，例如相對(duì)于所述誘導(dǎo)之前，所述細(xì)胞因子水平的增加是至少1.5、2、3倍或更多，例如IL-1O或TGF-β?？蛇x地，所述調(diào)節(jié)是特定細(xì)胞因子水平的減少，例如相對(duì)于所述誘導(dǎo)之前，所述細(xì)胞因子水平的減少是至少1.5、2、3倍或更多，例如IL-12、IL-17和IFN-Y。被調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子可以選自任何相關(guān)細(xì)胞因子，優(yōu)選地所述細(xì)胞因子選自 IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-23、TNF- a、IFN- Y、IFN-a、MCP-1、TGF-β ,RANK-L 和 Flt3L。
[0032]構(gòu)律體、遞送和糖合
[0033]在本發(fā)明中，微生物在預(yù)期位點(diǎn)即粘膜處遞送抗原。微生物表達(dá)所述抗原，這之后抗原暴露于細(xì)胞表面或被分泌。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，微生物例如乳酸乳球菌包含表達(dá)載體，所述載體能夠細(xì)胞內(nèi)地或分泌地表達(dá)異源抗原例如用于誘導(dǎo)免疫耐受性的抗原和/或使得異源抗原在于預(yù)期粘膜處(例如在胃腸道中)存在的條件下暴露在細(xì)胞表面上。微生物例如乳酸乳球菌可以包含能夠細(xì)胞內(nèi)地或分泌地表達(dá)異源抗原和/或使得異源抗原暴露在細(xì)胞表面上至足以誘導(dǎo)免疫耐受性的程度的表達(dá)載體。設(shè)想盡可能高程度表達(dá)而不損害待處理的細(xì)胞或宿主的活力。更高的表達(dá)，更少的頻率和更低的劑量可能是耐受性目的所需的。無(wú)疑地給藥方案將不僅依賴(lài)于抗原量，還依賴(lài)于抗原類(lèi)型和組合物中其他免疫原性刺激或抑制因子的存在或不存在。
[0034]通常，表達(dá)系統(tǒng)將包含基因構(gòu)建體，其包含編碼所需抗原的至少一種核苷酸序列，優(yōu)選所述序列與能夠指導(dǎo)序列在宿主微生物中的表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接。適當(dāng)?shù)卮磉_(dá)的抗原可以由核酸序列編碼，所述核酸序列適合于宿主的優(yōu)選密碼子使用。構(gòu)建體可以進(jìn)一步包含在所選擇的宿主中可操作的(所有)其他合適的元件，包括增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄起始序列、信號(hào)序列、報(bào)道基因、轉(zhuǎn)錄終止序列等，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。構(gòu)建體優(yōu)選為適合于轉(zhuǎn)化宿主的形式和/或?yàn)榭梢栽谒拗髦蟹€(wěn)定維持的形式，例如載體、質(zhì)?；蛭⑿腿旧w。可以選擇或構(gòu)建包含用于引入微生物例如細(xì)菌內(nèi)的核酸的合適載體，適當(dāng)時(shí)，其包含合適的調(diào)節(jié)序列，包括啟動(dòng)子序列、終止子片段、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因和其他序列。適當(dāng)時(shí)，載體可以是質(zhì)粒、病毒例如噬菌體或噬菌粒。關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見(jiàn)例如，Molecular Cloning:a Laboratory Manual:第 2 版，Sambrook 等人，1989, Cold SpringHarbor Laboratory Press。用于核酸操作，例如核酸構(gòu)建體的制備、誘變、測(cè)序、DNA引入細(xì)胞內(nèi)和基因表達(dá)、以及用于蛋白質(zhì)的分析的許多已知技術(shù)和方案在Short Protocolsin Molecular Biology,第 2 版，Ausubel 等人編輯，John ffiley&Sons, 1992 中詳細(xì)描述。Sambrook等人和Ausubel等人的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，生物活性多肽和抗原的編碼序列包含在操縱子中，即用于多順?lè)醋颖磉_(dá)的核酸構(gòu)建體中。在操縱子中，從啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致包含超過(guò)一種編碼序列的mRNA，所述編碼序列各自具有適當(dāng)?shù)囟ㄎ坏暮颂求w結(jié)合位點(diǎn)上游。因此，超過(guò)一種多肽可以由單個(gè)mRNA翻譯。操縱子的使用使得能夠協(xié)調(diào)表達(dá)生物活性多肽和抗原。更優(yōu)選地，使用食物級(jí)別構(gòu)建體。
[0035]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的微生物，即其中編碼抗原的基因已整合到宿主的基因組內(nèi)的微生物。用于建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。例如，目的基因可以經(jīng)由同源重組克隆到宿主的基因組內(nèi)。優(yōu)選地，宿主的必需基因由同源重組事件破壞，例如基因缺失、導(dǎo)致由必需基因編碼的蛋白質(zhì)的滅活形式的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、或?qū)е掠杀匦杌蚓幋a的蛋白質(zhì)的截短形式的移碼突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，必需基因是thyA基因。優(yōu)選技術(shù)在W002/090551中描述，所述專(zhuān)利明確以其整體并入本文。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒可以是任何質(zhì)粒，只要它不能補(bǔ)足破壞的必需基因，例如thyA基因。質(zhì)?？梢允亲晕覐?fù)制型質(zhì)粒，優(yōu)選攜帶一種或多種目的基因和一種或多種抗性標(biāo)記，或者質(zhì)粒是整合質(zhì)粒。在后一種情況下，通過(guò)在必需基因的基因座例如thyA位點(diǎn)處引起整合，整合質(zhì)粒其自身可以用于破壞必需基因，由此必需基因例如thyA基因的功能被破壞。優(yōu)選地，必需基因例如thyA基因由盒經(jīng)由雙重同源重組替代，所述盒包含側(cè)翼于靶向序列的一種或多種目的基因，所述靶向序列使插入物靶向必需基因，例如thyA靶位點(diǎn)。應(yīng)當(dāng)理解這些靶向序列足夠長(zhǎng)且足夠同源，以使得目的基因能夠整合到靶位點(diǎn)內(nèi)。
[0036] 編碼本發(fā)明抗原的基因構(gòu)建體因此可以染色體外地存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，優(yōu)選其使用自身的復(fù)制起點(diǎn)自主復(fù)制，或者可以整合到微生物基因組DNA內(nèi)，例如細(xì)菌或酵母染色體，例如乳球菌屬(Lactococcus)染色體。在后一種情況下,可以整合所述核酸的單個(gè)或多個(gè)拷貝；整合可以在染色體的隨機(jī)位點(diǎn)處發(fā)生，或如上所述在其預(yù)定位點(diǎn)處發(fā)生，優(yōu)選在預(yù)定位點(diǎn)處發(fā)生，例如在一個(gè)優(yōu)選的非限制性例子中，在乳球菌例如乳酸乳球菌的thyA基因座中發(fā)生。
[0037]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明抗原的基因構(gòu)建體可以進(jìn)一步包含經(jīng)設(shè)計(jì)以將所述基因構(gòu)建體有效插入宿主細(xì)胞的基因組例如染色體內(nèi)的序列。
[0038]在一個(gè)例子中，基因構(gòu)建體插入宿主細(xì)胞的基因組例如染色體內(nèi)的特定位點(diǎn)處可以通過(guò)同源重組得到促進(jìn)。例如，本發(fā)明的基因構(gòu)建體可以包含對(duì)于宿主細(xì)胞的基因組例如染色體內(nèi)的所述整合位點(diǎn)同源的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域。在所述基因組例如染色體位點(diǎn)處的序列可以是天然的，即如天然存在的，或可以是通過(guò)先前的基因工程引入的外源序列。
[0039]例如，所述一個(gè)或多個(gè)同源性區(qū)域可以是至少50bp，優(yōu)選至少lOObp，例如至少200bp,更優(yōu)選至少300bp,例如至少400bp,更加優(yōu)選至少500bp,例如至少600bp或至少700bp,更加優(yōu)選至少800bp,例如至少900bp,或至少1000bp或更多。
[0040]在一個(gè)優(yōu)選例子中，可以包括2個(gè)同源性區(qū)域，一個(gè)側(cè)翼于本發(fā)明的基因構(gòu)建體中存在的相關(guān)表達(dá)單位的一側(cè)。此種配置可以使相關(guān)序列有利地插入宿主細(xì)胞內(nèi)，所述相關(guān)序列例如至少編碼且實(shí)現(xiàn)目的抗原表達(dá)的序列。執(zhí)行同源重組(特別是在細(xì)菌宿主中)和選擇重組體的方法是本領(lǐng)域一般已知的。
[0041]微生物的轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔。
[0042]高程度的表達(dá)可以通過(guò)使用在微生物例如乳酸乳球菌中存在的表達(dá)載體上的同源表達(dá)和/或分泌信號(hào)來(lái)達(dá)到。合適的表達(dá)調(diào)節(jié)信號(hào)如實(shí)施例中的構(gòu)建體中存在的那些是有用的。其他表達(dá)信號(hào)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。表達(dá)載體可以對(duì)于表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化，依 賴(lài)于它摻入其中的微生物，例如乳酸乳球菌。例如，在乳球菌屬、乳乳桿菌(Lactobacillus lactis)、干釀乳桿菌(Lactobacillus casei)和植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)中給出足夠表達(dá)水平的特定表達(dá)載體是已知的。此外，已開(kāi)發(fā)用于在非病原性、非定殖性(non-colonising)、非侵襲性食物級(jí)別細(xì)菌乳酸乳球菌中表達(dá)異源抗原的系統(tǒng)是已知的(參見(jiàn)通過(guò)引用并入本文的英國(guó)專(zhuān)利GB2278358B)。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的構(gòu)建體包含PCT/NL95/00135 (W0-A-96/32487)中描述的多拷貝表達(dá)載體，其中已摻入編碼抗原的核苷酸序列。此種構(gòu)建體特別適合于在乳酸細(xì)菌特別是乳桿菌屬(Lactobacillus)中以高表達(dá)水平表達(dá)所需抗原，并且也可以有利地用于將所表達(dá)產(chǎn)物導(dǎo)向細(xì)菌細(xì)胞的表面。構(gòu)建體(例如PCT/NL95/00135的構(gòu)建體)的特征可以在于編碼抗原的核酸序列在5’非翻譯核酸序列后，所述5’非翻譯核酸序列包含至少核糖體識(shí)別和RNA穩(wěn)定所需的最低限度序列。這可以隨后為翻譯起始密碼子，其可以(緊)隨后為乳酸細(xì)菌基因的翻譯核酸序列的5’末端部分的至少5個(gè)密碼子的片段，或者該片段的結(jié)構(gòu)或功能等價(jià)物。該片段還可以由啟動(dòng)子控制。PCT/NL95/00135的內(nèi)容包括其中公開(kāi)的不同實(shí)施方案，以及該說(shuō)明書(shū)中提及的所有其他文件，通過(guò)引用并入本文。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了允許異源基因在宿主中高水平調(diào)節(jié)的表達(dá)以及表達(dá)與分泌偶聯(lián)的方法。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)W093/17117，T7噬菌體RNA聚合酶及其相關(guān)啟動(dòng)子用于開(kāi)發(fā)有力的表達(dá)系統(tǒng)，所述專(zhuān)利通過(guò)引用并入本文。優(yōu)選地表達(dá)質(zhì)粒衍生自PT1NX。
[0043]依照本發(fā)明采用的啟動(dòng)子優(yōu)選地在細(xì)菌中組成型表達(dá)。本發(fā)明人觀(guān)察到與誘導(dǎo)型表達(dá)比較，抗原的組成型表達(dá)導(dǎo)致增加的免疫耐受性。此外，組成型啟動(dòng)子的使用避免了提供誘導(dǎo)物或其他調(diào)節(jié)信號(hào)以用于表達(dá)發(fā)生的需要。優(yōu)選地，啟動(dòng)子以在其下細(xì)菌宿主細(xì)胞保持存活(即保留某些代謝活性，即使生長(zhǎng)未得到維持)的水平指導(dǎo)表達(dá)。有利地，此種表達(dá)可以處于低水平。例如，當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)積累時(shí)，表達(dá)水平可以導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物以小于約10%的細(xì)胞蛋白質(zhì)積累，優(yōu)選約或小于約5%，例如約1-3%。啟動(dòng)子對(duì)于所采用的細(xì)菌可以是同源的，即天然在那種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)子。例如，乳球菌屬啟動(dòng)子可以在乳球菌屬中使用。用于乳酸乳球菌(或其他乳球菌屬物種)中的優(yōu)選啟動(dòng)子是衍生自乳酸乳球菌的染色體的 “PI” (ffaterf ield, N R, Lepage, R W F, Wilson, P W,等人(1995).The isolationof lactococcal promoters and their use in investigating bacterial luciferasesynthesis in Lactococcus lactis.Genel65 (I),9-15)。另一種優(yōu)選啟動(dòng)子是 usp45 啟動(dòng)子。
[0044]—種或多種核酸構(gòu)建體可以包含分泌信號(hào)序列。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼抗原的核酸可以提供所述抗原的分泌(通過(guò)使編碼信號(hào)序列的核酸序列與編碼抗原的核酸序列適當(dāng)?shù)嘏悸?lián))。細(xì)菌容納核酸以分泌抗原的能力可以在體外在培養(yǎng)條件下進(jìn)行測(cè)試，所述培養(yǎng)條件維持生物的活力。優(yōu)選的分泌信號(hào)序列包括在革蘭氏陽(yáng)性微生物例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)和乳桿菌屬(Lactobacillus)中具有活性的那些。此種序列可以包括解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquetaciens)的α -淀粉酶分泌前導(dǎo)區(qū)，或由某些葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株分泌的葡激酶的分泌前導(dǎo)區(qū)，其已知在革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性宿主中起作用(參見(jiàn)〃Gene Expression Using Bacillus",Rapoport (1990) Current Opinion in Biotechnologyl:21-27),或來(lái)自眾多其他芽抱桿菌屬酶或S-層蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列(參見(jiàn)Harwood和Cutting, "Molecular BiologicalMethods for Bacillus〃的第 341-344 頁(yè),John Wiley & C0.1990)。優(yōu)選地，所述分泌信號(hào)衍生自 usp45 (Van Asseldonk 等人 1993Mol.Gen.Genet.240:428_434)。優(yōu)選地，所述抗原組成型分泌。
[0045]在可選實(shí)施方案中，生物活性多肽和抗原的編碼序列是同一核酸載體或分開(kāi)的載體的部分，并且獨(dú)立地處于分開(kāi)的啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)控制下。啟動(dòng)子可以是相同或不同的。包含生物活性多肽的編碼序列和抗原的編碼序列的核酸構(gòu)建體或載體由本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供，其中每種編碼序列處于啟動(dòng)子的控制下用于在非侵襲性宿主例如乳球菌中表達(dá)，無(wú)論其是否作為操縱子。
[0046]技原
[0047]編碼抗原的序列可以得自任何天然來(lái)源和/或可以使用眾所周知的DNA合成技術(shù)進(jìn)行合成制備。編碼抗原的序列隨后可以(例如)摻入合適的表達(dá)載體內(nèi)，以提供本發(fā)明的基因構(gòu)建體，其隨后用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染預(yù)期宿主。因此獲得的重組體隨后可以進(jìn)行培養(yǎng)，這之后收獲的細(xì)胞可以用于配制組合物，任選地在進(jìn)一步的純化和/或加工步驟后，例如冷凍干燥以形成粉末。
[0048]抗原可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何抗原。如本申請(qǐng)自始至終所使用的，抗原優(yōu)選是當(dāng)引入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)激發(fā)免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)，其中所述免疫應(yīng)答可以是T細(xì)胞介導(dǎo)的和/或B細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。抗原可以包含T細(xì)胞表位和/或B細(xì)胞表位?？乖拈L(zhǎng)度無(wú)具體限制，條件是所述抗原可以在本發(fā)明的微生物中表達(dá)?？乖梢允堑鞍踪|(zhì)或其部分，例如多肽或肽。根據(jù)本發(fā)明的抗原包括線(xiàn)性和/或構(gòu)象表位。T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答包括Thl、Th2和/或Thl7應(yīng)答?？乖梢允侨魏慰乖?，例如但不限于變應(yīng)原(包括食物變應(yīng)原)、同種異體抗原、自體抗原、自身抗原、和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的治療分子或抗原。優(yōu)選地，所述抗原涉及與疾病相關(guān)的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。更加優(yōu)選地，所述抗原涉及變應(yīng)性哮喘、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無(wú)力、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、食物過(guò)敏、乳糜瀉或移植物抗宿主病的誘導(dǎo)。
[0049]本發(fā)明人觀(guān)察到本發(fā)明的分泌的免疫顯性抗原抑制全身性炎性T細(xì)胞應(yīng)答，并且這些抗原對(duì)于誘導(dǎo)顯著致耐受性效應(yīng)是必需和足夠的。
[0050]調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)在口服耐受性的誘導(dǎo)和維持中起關(guān)鍵作用。Treg的誘導(dǎo)是幾種自身免疫疾病、變應(yīng)性疾病和炎性疾病的免疫治療的主要目標(biāo)。抗原特異性抑制細(xì)胞的治療誘導(dǎo)的目前策略面臨重大障礙，并且通常要求分離、處理和轉(zhuǎn)移足夠數(shù)目的調(diào)節(jié)細(xì)胞的嚴(yán)格技術(shù)。微生物例如乳酸乳球菌——本發(fā)明的抗原遞送系統(tǒng)避免了這些問(wèn)題，且有效誘導(dǎo)抗原特異性Treg。在本發(fā)明中，證實(shí)Treg的誘導(dǎo)可以通過(guò)使粘膜免疫系統(tǒng)暴露于低劑量抗原來(lái)達(dá)到。暴露于低劑量抗原優(yōu)選是持續(xù)暴露。因此，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)和/或擴(kuò)展Treg細(xì)胞，優(yōu)選地⑶4+CD25+、^4+^25—和⑶8+Treg細(xì)胞的抗原。
[0051]在本發(fā)明中進(jìn)一步證實(shí)，通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的抗原誘導(dǎo)和/或擴(kuò)展的Treg細(xì)胞通過(guò)TGF-β和/或IL-10依賴(lài)機(jī)制起作用。先前已提供TGF-β在口服耐受性中以及在外周誘導(dǎo)Treg的發(fā)展中起關(guān)鍵作用的證據(jù)。因此，本發(fā)明提供了刺激內(nèi)源TGF-β和/或IL-10表達(dá)的免疫顯性抗原。
[0052]此外，顯示抗原特異性TGF-β產(chǎn)生Th3細(xì)胞驅(qū)動(dòng)抗原特異性Foxp3+調(diào)節(jié)細(xì)胞在外周中的分化。此外，外周⑶4+⑶25—T細(xì)胞的TGF- β依賴(lài)性轉(zhuǎn)變成⑶25+、⑶45RB-/lOT抑制細(xì)胞已得到報(bào)道。顯示由CTB綴合的Ag誘導(dǎo)的口服耐受性通過(guò)產(chǎn)生Foxp3+⑶25+以及Foxp3+和Foxp3_CD25_CD4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞與TGF- β的增加相關(guān)。這些數(shù)據(jù)暗示Foxp3+‘適應(yīng)性’Treg在口服耐受性的誘導(dǎo)和維持中的關(guān)鍵作用。還顯示顯著的粘膜Foxp3誘導(dǎo)。此外，‘粘膜’誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)T細(xì)胞趨向于抗原特異性，因?yàn)閱为?dú)的乳酸乳球菌無(wú)法在GALT內(nèi)誘導(dǎo)這種Foxp3上調(diào)。因此，本發(fā)明優(yōu)選涉及Foxp3+Treg細(xì)胞。
[0053]本發(fā)明進(jìn)一步證實(shí)通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的抗原誘導(dǎo)和/或擴(kuò)展的Treg細(xì)胞減少炎癥，特別是在脾和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞中。此外，IFN-Y和IL-12產(chǎn)生減少。因此，本發(fā)明提供了減少內(nèi)源IFN-Y和/或IL-12產(chǎn)生、和/或刺激內(nèi)源TGF-β和/或IL-10表達(dá)的免疫顯性抗原。此外，本發(fā)明涉及減少脾和/或腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞增殖的抗原。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明還涉及抑制炎性抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的抗原。
[0054]應(yīng)當(dāng)理解某些HLA-DQ同種型通常與某些自身免疫疾病更相關(guān)。例如，定義乳糜瀉的慢性小腸炎癥的特征在于對(duì)攝入的谷蛋白肽的耐受性的喪失，并且與HLA-DQ2或HLA-DQ8限制性T細(xì)胞應(yīng)答強(qiáng)相關(guān)。HLA-DQ2或HLA-DQ8的表達(dá)是乳糜瀉表達(dá)所必需的，并且在西方人口中賦予高達(dá)40 %的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。在乳糜瀉發(fā)病機(jī)理中的最重要方面之一是T輔助I免疫應(yīng)答的激活，這在表達(dá)HLA-DQ2/DQ8分子的抗原呈遞細(xì)胞將谷蛋白肽呈遞給⑶4+T細(xì)胞時(shí)發(fā)生。
[0055]DQ8因?yàn)槠洳粌H與乳糜瀉還與青少年糖尿病的強(qiáng)關(guān)聯(lián)而突出。它還與牽涉RA的HLA-DR等位基因連接，且可能增加風(fēng)險(xiǎn)。HLA-DQ并非均勻地散布，并且某些群體處于增加的風(fēng)險(xiǎn)中；然而，這種風(fēng)險(xiǎn)通常依賴(lài)環(huán)境(谷蛋白消費(fèi))，并且某些疾病增加的流行率可以是個(gè)體從低風(fēng)險(xiǎn)環(huán)境轉(zhuǎn)移到更高風(fēng)險(xiǎn)環(huán)境的結(jié)果。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的HLA DQ8是DQAl:DQB1單元型的血清型表示(serotypicrepresentation)。DQ8 代表單元型 DQA1*0301:DQB1*0302、DQA1*0302:DQB1*0302 或DQA1*0303:DQB1*0302單元型。這些單元型與已知的最常見(jiàn)自身免疫疾病中的某些相關(guān)。DQA1*0301:DQB1*0302是這3種單元型中最頻繁的，并且表示約80%的總體DQ8。本發(fā)明因此涉及經(jīng)由 DQA1*0301:DQB1*0302、DQA1*0302:DQB1*0302 和 / 或 DQA1*0303:DQB1*0302單元型識(shí)別的抗原，稱(chēng)為“DQ8表位”。
[0057]HLA-DQ2在超過(guò)90%的具有乳糜瀉的人中表達(dá)。HLA DR3-DQ2是HLA-DRBl =DQAl:DQBl單元型的血清型表示。DR3-DQ2主要表示DRB1*0301:DQA1*0501:DQB1*0201單元型。它在西半球中相對(duì)豐富。DQ2由與其他α等位基因組合的DQB1*02等位基因編碼。2個(gè)最常見(jiàn)的DQ2 0鏈?zhǔn)欠浅Ｏ嗨频?。本發(fā)明因此涉及經(jīng)由DQB1*0201、DQB1*0202和/或DQB1*0203單元型識(shí)別的抗原，稱(chēng)為“DQ2表位 ”。
[0058]本發(fā)明優(yōu)選涉及衍生自糖蛋白的抗原。優(yōu)選地所述抗原衍生自麥醇溶蛋白，優(yōu)選α-麥醇溶蛋白和/或大麥醇溶蛋白?？梢栽俜殖搔?、Υ-和ω-麥醇溶蛋白的麥醇溶蛋白和大麥醇溶蛋白是本領(lǐng)域眾所周知的，并且它們的序列可經(jīng)由公眾域文庫(kù)例如NCBI容易地檢索。優(yōu)選地，所述α -麥醇溶蛋白衍生自小麥屬(Triticum)，例如小麥(T.aestivum)或圓錐小麥(T.turgidum)。
[0059]本發(fā)明證實(shí)⑶4+T細(xì)胞在DQ2或DQ8背景中識(shí)別天然谷蛋白肽。
[0060]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及DQ8表位:
[0061 ] QYPSGQGSFQPSQQNPQA,對(duì)應(yīng)于可經(jīng)由 UniProtKB/TrEMBL 條目 Q9M4L6 檢索的序列的殘基 203-220 (SEQ ID NO:4)。
[0062]所述天然的DQ8表位優(yōu)選由核苷酸序列5’-caa tac cca tea ggt caa ggt teattc caa cca tea caa caa aac cca caa gct-3' (SEQ ID NO:3)編石馬。
[0063]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及DQ2表位:
[0064]LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF,對(duì)應(yīng)于可經(jīng)由 UniProtKB/TrEMBL 條目Q9M4L6檢索的序列的殘基57-89 (SEQ ID NO:8)
[0065]所述DQ2表位優(yōu)選由下述核苷酸序列編碼:
[0066]5' -tta caa tta caa cca ttc cca caa cca caa tta cca tae cca tta cca taecca caa cca caa tta cca tae cca caa cca caa cca ttc(SEQ ID NO:7)
[0067]抗原通常通過(guò)例如內(nèi)源組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在腸中脫去酰胺基。脫去酰胺基的抗原比未脫去酰胺基的抗原更具有免疫活性且容易識(shí)別。內(nèi)源組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的存在在抗原由其他方式脫去酰胺基的情況下不重要。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由核苷酸序列編碼的脫去酰胺基的抗原，其中表位中的谷氨酰胺殘基的密碼子優(yōu)選由谷氨酸殘基的密碼子替換。
[0068]特別地，本發(fā)明涉及脫去酰胺基的DQ8表位:
[0069]QYPSGEGSFQPSQENPQA(SEQ ID NO:2)
[0070]所述脫去酰胺基的DQ8表位優(yōu)選由核苷酸序列5’-caa tae cca tea ggt gaa ggttea ttc caa cca tea caa gaa aac cca caa get-3'.(SEQ ID NO:1)編碼。
[0071]特別地，本發(fā)明涉及脫去酰胺基的DQ2表位
[0072]LQL QPF PQP ELP YPQ PQL PYP QPE LPY PQP QPF(SEQ ID NO:6)
[0073]所述脫去酰胺基的DQ2表位優(yōu)選由下述核苷酸序列編碼:[0074]5， -tta caa tta caa cca ttc cca caa cca gaa fta cca tae cca tta cca taecca caa cca 9aa tta cca tae cca caa cca caa cca ttc(SEQ ID NO:5)
[0075]進(jìn)一步證實(shí)另外的序列例如標(biāo)簽的存在不影響對(duì)表位序列的免疫應(yīng)答。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述表位可以包含進(jìn)一步的氨基酸，例如50個(gè)氨基酸、43、
30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 I 個(gè)氨基酸。因此，本發(fā)明涉及包含至多50個(gè)另外的氨基酸的DQ8表位。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含DQ8表位和e-標(biāo)簽(GAPVPYPDPLEPR (SEQ ID NO:31))的氨基酸序列GAPVPYPDPLEPRQYPSGEGSFQPSQENPQA (SEQ ID NO:16)
[0076]免瘡應(yīng)答[0077]如本文所使用的，免疫應(yīng)答相關(guān)疾病是由機(jī)體針對(duì)抗原的不希望有的免疫應(yīng)答引起的疾病，由此所述抗原可以是異源抗原或自身抗原。免疫應(yīng)答相關(guān)疾病包括但不限于變態(tài)反應(yīng)(包括食物過(guò)敏)、乳糜瀉、變應(yīng)性哮喘、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無(wú)力、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病和多發(fā)性硬化癥。免疫應(yīng)答相關(guān)疾病還包括不希望有的免疫反應(yīng)，例如移植物抗宿主病或藥物的免疫激活，例如針對(duì)非內(nèi)源因子VIII的抗體產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述疾病選自變應(yīng)性哮喘、食物過(guò)敏、乳糜瀉、I型糖尿病和治療的免疫失活。因此應(yīng)當(dāng)理解免疫應(yīng)答相關(guān)疾病包括但不限于變態(tài)反應(yīng)(包括食物過(guò)敏)、乳糜瀉、變應(yīng)性哮喘、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無(wú)力、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病和多發(fā)性硬化癥。免疫應(yīng)答相關(guān)疾病還包括不希望有的免疫反應(yīng)，例如移植物抗宿主病或藥物的免疫激活，例如針對(duì)非內(nèi)源因子VIII的抗體產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述疾病選自變應(yīng)性哮喘、食物過(guò)敏、乳糜瀉、移植物抗宿主病、I型糖尿病和治療的免疫失活。
[0078]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“免疫顯性”涉及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的基本抗原。
[0079]考慮到上文，因此應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明涉及如本文所描述的方法或用途，其中所述方法或用途是治療和/或預(yù)防的。
[0080]本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及用于誘導(dǎo)對(duì)抗原的免疫耐受性的方法，其包括所述抗原通過(guò)微生物的粘膜遞送與免疫調(diào)節(jié)化合物產(chǎn)生微生物的粘膜遞送組合。免疫調(diào)節(jié)化合物和抗原可以通過(guò)相同微生物遞送，或它可以是不同微生物。
[0081]藥劑和施用
[0082]化合物意指生物化合物或復(fù)合物的任何化學(xué)制品，包括簡(jiǎn)單或復(fù)雜的有機(jī)和無(wú)機(jī)分子、肽、擬肽(peptido-mimetics)、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物、抗體、碳水化合物、核酸或其衍生物。免疫調(diào)節(jié)化合物是修飾免疫系統(tǒng)的功能的化合物。如本文所使用的，免疫調(diào)節(jié)化合物是耐受性誘導(dǎo)化合物；作為非限制性例子，耐受性誘導(dǎo)可以通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞例如Treg、Trl或Th3、或通過(guò)使Thl/Th2平衡朝向Thl或Th2轉(zhuǎn)變、或通過(guò)抑制Thl7，以直接方式獲得，或通過(guò)激活未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞以耐受樹(shù)突狀細(xì)胞和/或抑制誘導(dǎo)Th2免疫應(yīng)答的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞上的“共刺激”因子表達(dá)，以間接方式獲得。免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制化合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括但不限于細(xì)菌代謝產(chǎn)物例如精胍菌素，真菌和鏈霉菌屬代謝產(chǎn)物例如他克莫司、雷帕霉素或環(huán)孢素，免疫抑制細(xì)胞因子例如IL-4、IL-10、IFNa、TGFi3 (作為調(diào)節(jié)T細(xì)胞的選擇性佐劑)Flt3L、TSLP, CTB和Rank-L (作為選擇性致耐受性DC誘導(dǎo)物抗體和/或拮抗劑例如抗-CD40L、抗-CD25、抗-CD20、抗-1gE、抗-CD3、抗_IL_6(或IL6R)和蛋白質(zhì)、肽或融合蛋白，例如CTL-4Ig或CTLA-4激動(dòng)劑融合蛋白。
[0083]因此，免疫調(diào)節(jié)化合物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何免疫調(diào)節(jié)化合物。優(yōu)選地，所述免疫調(diào)節(jié)化合物是免疫抑制化合物，更加優(yōu)選地所述化合物是免疫抑制細(xì)胞因子或抗體。優(yōu)選地，所述免疫抑制細(xì)胞因子是耐受性增強(qiáng)細(xì)胞因子或抗體。免疫抑制細(xì)胞因子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括但不限于IL-4、IL-10、IFN-a和TGF-β (作為調(diào)節(jié)T細(xì)胞的選擇性佐劑)，和Flt3L、TSLP, CTB和Rank-L (作為選擇性致耐受性DC誘導(dǎo)物)。優(yōu)選地，所述免疫抑制細(xì)胞因子選自IL-4、IL-10、IFNa和Flt3L。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明還涉及其功能相應(yīng)物(homologue)。功能相應(yīng)物意指至少對(duì)于預(yù)期目的具有基本上相同或相似的功能，但在結(jié)構(gòu)上可以不同的分子。最優(yōu)選地，所述免疫抑制耐受性增強(qiáng)細(xì)胞因子是IL-10，或其功能相應(yīng)物。優(yōu)選地，所述免疫抑制抗體選自抗-1L-2、抗-1L12、抗-11^6、抗-1?^1
[0084]如本文所使用的，遞送意指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何遞送方法，并且包括但不限于待遞送化合物的包被或非包被藥物制劑，包含或攜帶待遞送化合物或微生物的膠囊、脂質(zhì)體、油體、聚合物顆粒，所述微生物分泌、展示或積聚待遞送化合物，任選地在可增強(qiáng)粘膜遞送和/或粘膜攝取的化合物的存在下。
[0085]本文描述的化合物或組合物可以以純的形式，與其他活性成分組合，或與藥學(xué)上可接受的無(wú)毒賦形劑或載體組合施用。口服組合物將一般包括惰性稀釋劑載體或可食用載體?？梢园ㄋ帉W(xué)上相容的結(jié)合劑、和/或佐劑材料作為組合物的部分。片劑、丸劑、膠囊、糖錠、灌腸劑等可以包含任何下述成分，或具有相似性質(zhì)的化合物:粘合劑例如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；賦形劑例如淀粉或乳糖，分散劑例如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂；助流劑例如二氧化硅膠體；甜味劑例如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑例如薄荷油、水楊酸甲酯或橙調(diào)味劑。當(dāng)劑量單位形式是膠囊時(shí)，除上述類(lèi)型的材料外，它還可以包含液體載體例如脂肪油。此外，劑量單位形式可以包含改變劑量單位的物理形式的各種其他材料，例如糖包衣、蟲(chóng)膠或腸內(nèi)試劑。此外，除活性化合物外，糖漿可以包含蔗糖作為甜味劑和某些防腐劑、染料、著色劑和調(diào)味劑。應(yīng)當(dāng)理解藥學(xué)上可接受的載體的形式和特征由它將與之組合的活性成分的量、施用途徑和其他眾所周知的變量指示。一種或多種載體從與制劑的其他成分相容且對(duì)其接受者無(wú)害的意義上說(shuō)必須是“可接受的”。
[0086]用于施用的可選制劑包括無(wú)菌水性和非水性溶液、懸浮液和乳狀液。非水性溶劑的例子是二甲基亞砜、醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油和可注射有機(jī)酯例如油酸乙酯。水性載體包括醇和水的混合物、緩沖介質(zhì)和鹽水。靜脈內(nèi)媒介物包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑，例如基于林格氏右旋糖的那些等。還可以存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。各種液體制劑可用于這些遞送方法，包括鹽水、醇、DMSO和基于水的溶液。
[0087]優(yōu)選地所述抗原和/或所述免疫抑制細(xì)胞因子在小鼠實(shí)驗(yàn)背景中以低量?jī)?yōu)選
0.1ug或更低/劑量施用的細(xì)菌表達(dá)，此種量將在人疾病背景中轉(zhuǎn)變。
[0088] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”等包括發(fā)展的精神疾病或病狀的改善或消除(一旦它已建立)，或此種疾病或病狀的特征性癥狀的減輕。如本文所使用的，依賴(lài)患者的狀況，這些術(shù)語(yǔ)還包括預(yù)防疾病或病狀或者與疾病或病狀相關(guān)的癥狀的發(fā)作,包括在被所述疾病或病狀折磨前減少疾病或病狀或與之相關(guān)的癥狀的嚴(yán)重度。此種在折磨前的預(yù)防或減少指給患者施用本發(fā)明的化合物或組合物，所述患者在施用時(shí)未被該疾病或病狀折磨?！邦A(yù)防”還包括預(yù)防疾病或病狀或與之相關(guān)的癥狀的再發(fā)生或復(fù)發(fā)，例如在改善時(shí)期后。顯而易見(jiàn)的是精神病狀可能負(fù)責(zé)身體疾病。在這方面，術(shù)語(yǔ)“治療”還包括身體疾病或病狀的預(yù)防或者發(fā)展的身體疾病或病狀的改善或消除(一旦它已建立)，或此種病狀的特征性癥狀的減輕。
[0089]如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“藥劑”還包括術(shù)語(yǔ)“藥物”、“治療劑”、“飲劑”或其他術(shù)語(yǔ)，其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中用于指示具有治療或預(yù)防效應(yīng)的制劑。
[0090]應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的化合物即抗原以治療有效量遞送或表達(dá)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”意指本發(fā)明的化合物或組合物的量，當(dāng)根據(jù)所需治療方案施用時(shí)，其將引起所需治療或預(yù)防效應(yīng)或應(yīng)答。觀(guān)察到當(dāng)免疫顯性抗原持續(xù)存在時(shí)，炎性抗原特異性細(xì)胞應(yīng)答甚至進(jìn)一步減少。與像這樣施用抗原、像這樣施用微生物或抗原的不持續(xù)存在比較，這種減少明顯更大。根據(jù)本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“持續(xù)存在”指根據(jù)本發(fā)明的抗原在預(yù)期粘膜位點(diǎn)例如炎癥位點(diǎn)處的持續(xù)或不間斷存在?？乖拇嬖诳梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)進(jìn)行測(cè)量，例如PCR、ELISA或免疫沉淀技術(shù)，例如實(shí)施例部分和上文中詳細(xì)描述的。此外，乳酸乳球菌的存在可以是抗原的存在的測(cè)量。此外，由抗原引起的效應(yīng)可以是抗原的存在的測(cè)量，例如內(nèi)源TGF-β或IL-10水平的存在或增加，或IFN-Y或IL-12水平的減少，或Treg細(xì)胞的存在，例如本文描述的，或脾細(xì)胞和引流淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖能力的減少。因此應(yīng)當(dāng)理解抗原的水平可以改變，而抗原仍視為持續(xù)存在。
[0091]優(yōu)選地化 合物或組合物以單位劑型例如片劑、膠囊、灌腸劑或定量氣霧劑(metered aerosol dose)提供,從而使得單個(gè)劑量施用于受試者例如患者。
[0092]活性成分可以每天施用1-6次，足以顯示所需活性。這些日劑量可以作為單個(gè)劑量每天給予I次，或可以作為2個(gè)或更多更小的劑量在每天的相同或不同時(shí)間給予，其總共給出指定日劑量。優(yōu)選地，活性成分每天施用I次或2次。例如，一個(gè)劑量可在早晨服用和一個(gè)在白天稍后服用。
[0093]在本發(fā)明的所有方面，日維持劑量可以在患者中給予臨床所需時(shí)期，例如I天直至數(shù)年(例如，對(duì)于哺乳動(dòng)物的整個(gè)其余生命)；例如約(2或3或5天、I或2周、或I個(gè)月)以上和/或例如直至約(5年、I年、6個(gè)月、I個(gè)月、I周、或3或5天)。日維持劑量一般施用約3-約5天或約I周-約I年。液體制劑的其他組成成分可以包括防腐劑、無(wú)機(jī)鹽、酸、堿、緩沖劑、營(yíng)養(yǎng)物、維生素、或其他藥物。
[0094]遞送抗原的微生物可以以至少I(mǎi)O4菌落形成單位(cfu) -1O12Cfu/天，優(yōu)選106cfu-1012cfu/天，最優(yōu)選109cfu-1012cfu/天的劑量遞送。依照如Steidler等人(Science2000)中所述的方法，例如IO9Cfu的抗原和可能地免疫調(diào)節(jié)化合物分泌為至少I(mǎi)ng-1OOng0通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的ELISA,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以計(jì)算與cfu的任何其他劑量相關(guān)的抗原的分泌范圍。
[0095]抗原可以以誘導(dǎo)低劑量應(yīng)答的劑量遞送。優(yōu)選地，所述抗原以至少10fg_500y g/天、優(yōu)選lpg-250 μ g/天、更優(yōu)選100pg-200 μ g/天、或優(yōu)選lng-150 μ g、或更優(yōu)選10ng-125 μ g/天、更加優(yōu)選IOOng-1OO μ g/天、更加優(yōu)選I μ g_90 μ g/天、和最優(yōu)選10 μ g-75 μ g/ 天,例如 25 μ g、30 μ g、40 μ g、50 μ g、60 μ g 或 70 μ g/ 天的劑量遞送。
[0096]優(yōu)選地化合物或組合物以單位劑型例如片劑、溶液、膠囊或定量氣霧劑提供，從而使得單個(gè)劑量施用于受試者例如患者。[0097]依賴(lài)于施用方式，例如經(jīng)口施用、或上文描述的那些中的任何一種，技術(shù)人員了解如何限定或計(jì)算待施用于患者的實(shí)際劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)于依賴(lài)患者、微生物、載體等等調(diào)整劑量將是在行的。
[0098]本發(fā)明的化合物也可以采用藥理學(xué)上可接受的鹽、水合物、溶劑化物或代謝產(chǎn)物的形式。藥理學(xué)上可接受的鹽包括無(wú)機(jī)和有機(jī)酸的堿性鹽，所述酸包括但不限于鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲磺酸、乙磺酸、對(duì)甲苯磺酸、萘磺酸、蘋(píng)果酸、乙酸、草酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、水楊酸、苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸等。當(dāng)本發(fā)明的化合物包括酸性官能團(tuán)例如羧基時(shí)，用于羧基的合適的藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且包括堿、堿土、銨、季銨陽(yáng)離子等。
[0099]微牛物
[0100]根據(jù)本發(fā)明的微生物可以是適合于粘膜遞送的任何微生物，包括細(xì)菌、酵母或真菌。優(yōu)選地，所述微生物是非病原性微生物、更加優(yōu)選地，所述微生物是益生微生物。益生生物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。益生生物包括但不限于，細(xì)菌例如乳桿菌屬物種、乳球菌屬物種和酵母例如釀酒酵母布拉酵母菌亞種(Saccharomyces cerevisiae subspeciesboulardii )。優(yōu)選地，所述細(xì)菌是乳酸細(xì)菌；更加優(yōu)選地,所述乳酸細(xì)菌選自乳桿菌屬、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、乳球菌屬、鏈球菌屬(Streptococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)、肉桿菌屬(Carnobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)、四聯(lián)球菌屬(Teragenococcus)、漫游球菌屬(Vagococcus)和魏斯氏菌屬(Weisella)。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物是乳酸乳球菌。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述乳酸細(xì)菌是乳桿菌屬物種。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述微生物是釀酒酵母，更加優(yōu)選地，所述酵母是釀酒酵母布拉酵母菌亞種。
[0101]最優(yōu)選地，所述益生微生物是乳酸細(xì)菌，因?yàn)楫惙N蛋白質(zhì)(B卩非乳酸細(xì)菌蛋白質(zhì))通過(guò)乳酸細(xì)菌遞送到粘膜內(nèi)，包括經(jīng)口和陰道遞送，已得到描述(Steidler和Rottiers,2006 ;Liu等人，2006)，這使得這些乳酸細(xì)菌非常適合于遞送所述抗原和可能地所述免疫抑制化合物。乳酸乳球菌是非病原性、非侵襲性、非定殖性革蘭氏陽(yáng)性菌。產(chǎn)生各種遺傳修飾的乳酸乳球菌菌株，用于免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的局部合成和遞送給腸粘膜。此外，建立生物學(xué)包容系統(tǒng)(containment system),其使得遺傳改造的乳酸乳球菌的臨床應(yīng)用成為可行的策略。
[0102]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述微生物是乳酸乳球菌thyA突變體。特別優(yōu)選的實(shí)施方案使用乳酸乳球菌thyA突變體，其中編碼抗原的基因已用于破壞thyA基因。
[0103]菅養(yǎng)食品和醫(yī)學(xué)食物
[0104]應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的化合物和組合物可以用作營(yíng)養(yǎng)食品、功能或醫(yī)學(xué)食物，或用作所述營(yíng)養(yǎng)食品、功能或醫(yī)學(xué)食物中的添加劑。另一個(gè)實(shí)施方案提供了優(yōu)選適合于人消費(fèi)的食物或飲料，其由營(yíng)養(yǎng)食品和調(diào)味劑組成，其中營(yíng)養(yǎng)食品由來(lái)自農(nóng)產(chǎn)品的提取物組成。
[0105]無(wú)論是液體提取物還是干組合物形式，營(yíng)養(yǎng)食品都是可食用的，并且可以直接由人食用，但優(yōu)選以添加劑或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的形式提供給人，例如以在保健食物店中出售的片劑種類(lèi)形式，或作為可食用固體，優(yōu)選地加工食品，例如谷類(lèi)食物、面包、豆腐、餅干、冰激淋、蛋糕、馬鈴薯片、椒鹽卷餅、干酪等中的成分提供，以及在可飲用液體，例如飲料，例如乳、蘇打、體育飲料和果汁中提供。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使食物或飲料與營(yíng)養(yǎng)食品以有效增強(qiáng)食物或飲料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的量混合，提供了用于增強(qiáng)食物或飲料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法。
[0106]另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于增強(qiáng)食物或飲料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法，其包括使食物或飲料與營(yíng)養(yǎng)食品混合，以產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)上增強(qiáng)的食物或飲料，其中營(yíng)養(yǎng)食品以有效增強(qiáng)食物或飲料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的量混合，其中營(yíng)養(yǎng)食品由來(lái)自包含本發(fā)明抗原的農(nóng)作物的提取物組成，并且其中營(yíng)養(yǎng)上增強(qiáng)的食物或飲料可以進(jìn)一步包含調(diào)味劑。優(yōu)選的調(diào)味劑包括甜味劑，例如糖、玉米糖衆(zhòng)、果糖、右旋糖、maltodextrose、環(huán)己燒氨基磺酸鹽、糖精、苯丙氨酸、木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇，和草本甜味劑例如甜葉菊(stevia)。
[0107]本文描述的營(yíng)養(yǎng)食品預(yù)期用于人消費(fèi)，并且因此用于獲得它們的過(guò)程優(yōu)選依照藥品生產(chǎn)和質(zhì)量管理規(guī)范(Good Manufacturing Practices) (GMP)和管理此種過(guò)程的任何可應(yīng)用的政府條例進(jìn)行。特別優(yōu)選的過(guò)程僅利用天然衍生的溶劑。本文描述的營(yíng)養(yǎng)食品優(yōu)選包含相對(duì)高水平的健康增強(qiáng)物質(zhì)。營(yíng)養(yǎng)食品可以彼此混合，以增加其健康增強(qiáng)效應(yīng)。
[0108]與營(yíng)養(yǎng)食品形成對(duì)比，所謂的“醫(yī)學(xué)食物”不意欲由普通民眾使用，并且在商店或超市無(wú)法獲得。醫(yī)學(xué)食物并非在健康飲食內(nèi)包括以減少疾病的風(fēng)險(xiǎn)的那些食物，例如減脂食物或低鈉食物，它們也不是重量減輕產(chǎn)品。當(dāng)患者具有特定營(yíng)養(yǎng)需求時(shí)，醫(yī)生開(kāi)出醫(yī)學(xué)食物處方，以便管理疾病或健康狀況，并且患者處于醫(yī)生的護(hù)理下。標(biāo)簽必須清楚闡述該產(chǎn)品預(yù)期用于管理特定醫(yī)學(xué)病癥或病狀。醫(yī)學(xué)食物的例子是設(shè)計(jì)用于向具有慢性炎癥病狀的患者提供靶向營(yíng)養(yǎng)支持的營(yíng)養(yǎng)上不同的醫(yī)學(xué)食物。這種產(chǎn)品的活性化合物例如是本文描述的一種或多種化合物。功能食物可以包括在健康飲食內(nèi)包含以減少疾病的風(fēng)險(xiǎn)的那些食物，例如減脂食物或低鈉食物，或重量減輕產(chǎn)品。因此，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)食品的食物或飲料。
[0109]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可以對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行眾多改變和修飾，并且可以進(jìn)行此種改變和修飾而不背離本發(fā)明的精神。因此，預(yù)期附加權(quán)利要求包含在本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍內(nèi)的所有此種等價(jià)變化。
[0110] 此外，在本發(fā)明化合物的描述中使用的所有術(shù)語(yǔ)具有其在本領(lǐng)域中眾所周知的含義。
[0111]附圖簡(jiǎn)述
[0112]圖1:LL-0VA的經(jīng)口飼喂顯著減少DTH應(yīng)答。Balb/c小鼠在第O天時(shí)通過(guò)皮下注射0VA/CFA進(jìn)行致敏，并且在第21天時(shí)接受0VA/IFA的加強(qiáng)免疫。在第7_11、14-18、21-25和28-31天時(shí)，小鼠用BM9、LLpTREX1、LL-OVA和I μ g OVA進(jìn)行經(jīng)口處理。在第31天時(shí)，小鼠用在10 μ I鹽水中的IOyg Ova在耳的耳廓中進(jìn)行攻擊。DTH應(yīng)答表示為攻擊后24小時(shí)時(shí)2只耳在OVA攻擊前和后的耳厚度的差異。
[0113]圖2 =LL-OVA的經(jīng)口飼喂顯著減少大量脾細(xì)胞的OVA特異性增殖(A)以及IFN- Y(B)、IL-6(C)和IL-10 (D)產(chǎn)生。Balb/c小鼠在第O天時(shí)通過(guò)皮下注射0VA/CFA進(jìn)行致敏，并且在第21天時(shí)接受0VA/IFA的加強(qiáng)免疫。在第21-25和28-31天時(shí)，小鼠用BM9、LLpTREXl和LL-OVA進(jìn)行經(jīng)口處理。在第31天時(shí)，分離大量脾細(xì)胞且在用100 μ g/ml OVA離體刺激72小時(shí)后就OVA特異性增殖進(jìn)行測(cè)試，其表示為在不同OVA濃度時(shí)的平均cpm土SEM，并且就IFN- Y、IL-6和IL-10產(chǎn)生進(jìn)行測(cè)試。
[0114]圖3 =LL-OVA的經(jīng)口飼喂顯著減少⑶4+脾T細(xì)胞的OVA特異性增殖。Balb/c小鼠在第O天時(shí)通過(guò)皮下注射OVA/CFA進(jìn)行致敏，并且在第21天時(shí)接受OVA/IFA的加強(qiáng)免疫。在第21-25和28-31天時(shí)，小鼠用BM9 (A)、LLpTREXl (B)和LL-OVA (C)進(jìn)行經(jīng)口處理。在第31天時(shí)，分離大量脾細(xì)胞，并且在用100 μ g/ml OVA離體再刺激90小時(shí)后，通過(guò)CFSE和⑶4-APC標(biāo)記以及流式細(xì)胞術(shù)分析評(píng)估⑶4+脾T細(xì)胞的OVA特異性增殖。
[0115]圖4 =LL-OVA處理的小鼠的⑶4+T細(xì)胞將耐受性轉(zhuǎn)移給首次用于實(shí)驗(yàn)的接受者。Balb/c小鼠在第O天時(shí)通過(guò)皮下注射0VA/CFA進(jìn)行致敏，并且在第21天時(shí)接受0VA/IFA的加強(qiáng)免疫。在第21-25和28-31天時(shí)，小鼠用BM9、LLpTREXl和LL-OVA進(jìn)行經(jīng)口處理。在第31天時(shí)，分離CD4+脾T細(xì)胞且就耐受性轉(zhuǎn)移能力進(jìn)行測(cè)試。耐受性通過(guò)CD4+脾T細(xì)胞從LL-OVA和LL-pTREX處理的小鼠轉(zhuǎn)移至首次用于實(shí)驗(yàn)的接受者通過(guò)對(duì)后者進(jìn)行致敏和攻擊就DTH應(yīng)答進(jìn)行評(píng)估，所述DTH應(yīng)答表示為攻擊后24小時(shí)時(shí)2只耳在OVA攻擊前和后的耳厚度的差異。
[0116]圖5:N0DAB° DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠在第I天時(shí)通過(guò)皮下注射在CFA中的100 μ g eDQ8d進(jìn)行免疫。小鼠在第1-10天時(shí)用LL-eDQ8d或LL-pTINX進(jìn)行經(jīng)口處理。對(duì)照小鼠接受BM9。在第10天時(shí)，小鼠用在10 μ I鹽水中的IOyg eDQ8d在耳的耳廓中進(jìn)行攻擊。DTH應(yīng)答表示為注射后24小時(shí)時(shí)平均值的增加(減去eDQ8d攻擊前的耳厚度后)。結(jié)果概括了包括6只小鼠/組的3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。
[0117]圖6:在DTH測(cè)量后，分離BM9 (對(duì)照)、LL_pTlNX和LL_eDQ8d組的脾(A)和腹股溝淋巴結(jié)(B)，并且用50yg eDQ8d肽離體進(jìn)行再刺激。大量脾細(xì)胞(p=0.048)和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞(P=0.0022)的eDQ8d特異性增殖應(yīng)答表示為平均cpm。
[0118]圖7:脾(A)和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞(B)的上清液中的細(xì)胞因子測(cè)量在再刺激后24小時(shí)時(shí)進(jìn)行。結(jié)果是代表至少2次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的以pg/ml表示的細(xì)胞因子分泌平均值。
[0119]圖8:減少的脾eDQ8d特異性增殖依賴(lài)于IL-10和TGF- β。實(shí)施例
[0120]實(shí)施例A:通過(guò)用遺傳修飾的乳酸乳球菌將OVA遞送給OVA致敏的野生型小鼠誘導(dǎo)OVA特異耐受性
[0121]前言
[0122]為了這個(gè)目的，遺傳改造分泌OVA的LL (LL-OVA)，并且在自身免疫/過(guò)敏的治療模型，即OVA免疫模型中評(píng)估全身耐受性的誘導(dǎo)。
[0123]材料與方法
[0124]細(xì)菌和培養(yǎng)基:乳酸乳球菌MG1363 (LL)菌株進(jìn)行遺傳修飾，并且在本研究自始至終使用。細(xì)菌在GM17E培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述GM17E培養(yǎng)基由補(bǔ)充有0.5%葡萄糖和5 μ g/ml 紅霉素(Abbott)的 Ml7 肉湯(Difco Laboratories, Detroit, Ml)組成。LL 菌株的貯備懸浮液于_20°C貯存于在GM17E培養(yǎng)基中的50%甘油中。貯備懸浮液在GM17E培養(yǎng)基中稀釋500倍，并且于30°C溫育過(guò)夜。在16小時(shí)內(nèi)，它們達(dá)到2xl09菌落形成單位(CFU)/ml的飽和密度。細(xì)菌通過(guò)離心進(jìn)行收獲，并且以21101°細(xì)菌/ml重懸浮于BM9培養(yǎng)基中。每只小鼠通過(guò)胃內(nèi)導(dǎo)管每天接受100μ I這種懸浮液。
[0125]質(zhì)粒:編碼原雞(Gallus gallus)卵白蛋白的mRNA序列從Genbank (登記號(hào)AY223553)和公開(kāi)數(shù)據(jù)中檢索。從雞子宮中分離總RNA，并且在25 μ I體積中使用2 μ g總RNA、2 μ M 寡核苷酸 dT 引物(Promega Corporation Benelux, Leiden, The Netherlands)、
0.01mM DTT (Sigma-Aldrich,Zwijndrecht,The Netherlands)』.5mM dNTP (Invitrogen,Merelbeke,Belgium)、20U Rnasin(Promega Incorporation Benelux)和 IOOU superscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)合成cDNA。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增OVA cDNA片段，使用下述引物:正向 5’ -GGCTCCATCGGTGCAGCAAGCATGGAATT-3’ (SEQ ID NO:9)和反向 5’ -ACTAGTTAAGGGGAAACACATCTGCCAAAGAAGAGAA-3’(SEQ ID NO:10)。反應(yīng)條件是 94°C 2 分鐘，隨后為94°C 45秒、62°C 30秒和72°C 90秒的30個(gè)循環(huán)。使擴(kuò)增片段與乳球菌屬Pl啟動(dòng)子17下游的紅霉素抗性pTINX載體的Usp45分泌信號(hào)融合。用攜帶OVA cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363菌株命名為分泌OVA的乳酸乳球菌(LL-OVA)。其為包含空載體pTREXl的MG1363的乳酸乳球菌-pTREXl充當(dāng)對(duì)照(LL-pTREX)。
[0126]小鼠:7周大的雌性 Balb/c 小鼠得自 Charles River Laboratories (Calco,Italy)，并且在常規(guī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中在特定無(wú)病原體條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。動(dòng)物研究由GhentUniversity 的 Ethics Committee of the Department for Molecular BiomedicalResearch 批準(zhǔn)(檔案號(hào) 07/029)。
[0127]抗原:完整的無(wú)LPS的OVA V級(jí)別蛋白質(zhì)在所有實(shí)驗(yàn)中用作抗原(SigmaAldrich)。
[0128]小鼠的免疫和口服耐受性的誘導(dǎo):Balb/c小鼠在第一天時(shí)通過(guò)在尾的基部處皮下注射在 100 μ I CFA (Difco, BD Bioscience, Erembodegem, Belgium)和鹽水溶液的 I: I混合物中的IOOyg OVA進(jìn)行免 疫。在第7-11、14-18、21-25和28-31天時(shí)(方案I)，以及在第21-25和28-31天時(shí)(方案2)，每天施用溶解于100 μ I ΒΜ9中的LL-OVA, LL-pTREX I或Iyg純化的0VA。對(duì)照小鼠僅接受BM9?？乖蚣?xì)菌懸浮液使用18號(hào)(18-gauge)不銹鋼動(dòng)物飼喂針導(dǎo)入胃內(nèi)。在第21天時(shí),通過(guò)皮下注射在100 μ I IFA (Sigma-Aldrich)的1:1混合物中的100 μ g OVA給予加強(qiáng)免疫。通過(guò)DTH應(yīng)答、細(xì)胞因子和OVA特異性增殖的測(cè)量、以及過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估耐受性誘導(dǎo)。
[0129]遲發(fā)型超敏反應(yīng):抗原特異性DTH應(yīng)答通過(guò)在第31天時(shí)注射OVA進(jìn)行評(píng)估。24小時(shí)后執(zhí)行DTH測(cè)量。對(duì)于抗原特異性DTH應(yīng)答的測(cè)量，小鼠用在10 μ I鹽水中的IOyg OVA在耳的耳廓中進(jìn)行攻擊。定義為由于攻擊引起的耳厚度增加的耳腫脹，在攻擊后24小時(shí)時(shí)使用數(shù)字測(cè)微計(jì)(Conrad，Belgium)以不知情方式進(jìn)行測(cè)量。DTH應(yīng)答表示為2只耳在OVA攻擊前和后的耳厚度的差異。
[0130]OVA特異性增殖和細(xì)胞因子測(cè)定:在第39天時(shí)，收獲脾，并且就OVA特異性增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生評(píng)估脾細(xì)胞。通過(guò)使細(xì)胞通過(guò)70-μ m細(xì)胞過(guò)濾器(Becton/DickinsonLabware)制備脾的單細(xì)胞懸浮液。通過(guò)與紅細(xì)胞裂解緩沖液一起溫育裂解細(xì)胞懸浮液中的紅細(xì)胞。使用OM+T細(xì)胞分離試劑盒和midiMACS柱(Miltenyi Biotec, Germany)富集⑶4+T細(xì)胞。
[0131]為了測(cè)定總脾細(xì)胞群體的增殖，在96孔U形底平板中在單獨(dú)或具有以
1.2-100 μ g/ml濃度加入的OVA的總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基[即包含10%胎牛血清(FCS)、10U/ml 青霉素、10 μ g/ml 鏈霉素、2mML-glutamax、0, 4mM 丙酮酸鈉的 RPM1-1640]中培養(yǎng) 2xl05 細(xì)胞。增殖通過(guò) 5，6-CFSE 標(biāo)記(Invitrogen, Merelbeke, Belgium)進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。脾細(xì)胞以IOVml重懸浮于PBS中，并且以10 μ M CFSE的終濃度于37°C溫育12分鐘。在96孔U形底平板中在具有100 μ g/mlOVA的總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中以2χ105細(xì)胞培養(yǎng)之前，標(biāo)記的細(xì)胞用冰冷的完全培養(yǎng)基洗滌2次。在37°C和5% CO2下在加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90小時(shí)后，收獲細(xì)胞并且用別藻藍(lán)蛋白標(biāo)記的抗-⑶4 (BDjiosciences)對(duì)細(xì)胞染色，并且使用流式細(xì)胞術(shù)(FACSCanto，BD Biosciences)測(cè)定增殖。
[0132]為了測(cè)定CD4+T細(xì)胞的增殖，在96孔U形底平板中在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中，以1/1、1/0.3、1/0.1、1/0.03和1/0的比例培養(yǎng)2χ105個(gè)CD4+T細(xì)胞與充當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞的絲裂霉素C處理的OVA裝載的脾細(xì)胞。細(xì)胞在37°C和5% CO2下在加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90小時(shí)。對(duì)于增殖測(cè)定，加入I μ Ci/孔[3Η]-胸苷進(jìn)行最后18小時(shí)的培養(yǎng)，在玻璃纖維濾器墊(Perkin Elmer, Boston, USA)上收獲DNA,并且在閃爍計(jì)數(shù)器(Perkin Elmer)上測(cè)量DNA結(jié)合的放射性活性。對(duì)于細(xì)胞因子測(cè)量，在培養(yǎng)72小時(shí)后收集在不同增殖測(cè)定中使用的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，且于-20°C進(jìn)行冷凍。細(xì)胞因子產(chǎn)生使用Mouse Flex Set CytometricBead Array (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)進(jìn)行定量。
[0133]過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn):在第39天時(shí)，從處理組中收集脾。通過(guò)切碎脾且使它們通過(guò)70-μ m細(xì)胞過(guò)濾器(Becton/Dickinson Labware)而獲得單細(xì)胞懸浮液。如上所述,細(xì)胞懸浮液就⑶4+T細(xì)胞進(jìn)行富集。⑶4+富集細(xì)胞通過(guò)靜脈內(nèi)注射IxlO6⑶4+T細(xì)胞而過(guò)繼轉(zhuǎn)移給首次用于實(shí)驗(yàn)的BALB/c受體小鼠。過(guò)繼轉(zhuǎn)移后I天，所有小鼠通過(guò)在尾基部處皮下注射100 μ g 0VA/25 μ I鹽水/25 μ I IFA (Sigma-Aldrich)進(jìn)行致敏，并且其后5天，小鼠根據(jù)上文描述的DTH方案進(jìn)行攻擊。
[0134]統(tǒng)計(jì)分析:在耳厚度和細(xì)胞因子測(cè)量中組間差異的顯著性使用單因素ANOVA進(jìn)行檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)顯著性標(biāo)示為* (p〈0.05)或** (p〈0.01)。
[0135]結(jié)果
[0136]與游離OVA比較，LL-OVA在OVA免疫模型中顯著增強(qiáng)耐受性誘導(dǎo)能力。
[0137]為了研究口服耐受性的誘導(dǎo)，小鼠如上所述進(jìn)行經(jīng)口飼喂。與致敏的對(duì)照小鼠(BM9組)以及用LL-pTREXl或I μ g純化的OVA處理的小鼠比較，給OVA致敏的BALB/c小鼠施用LL-OVA導(dǎo)致DTH應(yīng)答的顯著減少(圖1)。
[0138]這些數(shù)據(jù)伴隨與BM9組或LL-pTREXl處理組比較，LL-OVA處理的小鼠的大量脾細(xì)胞顯著減少的增殖能力以及IFN-Y、IL-10和IL-6產(chǎn)生(圖2)。
[0139]LL-OVA經(jīng)由⑶4+T細(xì)朐增強(qiáng)口服耐等件。
[0140]為了評(píng)估CD4T細(xì)胞是否介導(dǎo)口服耐受性的誘導(dǎo)，研究脾細(xì)胞中的OVA特異性增殖的⑶4T細(xì)胞應(yīng)答。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)與BM9和LL-pTREXl組中的4.5%和11.6%比較，在LL-OVA組中在OVA再刺激后僅0.8 %的⑶4+脾T細(xì)胞增殖(圖3)。此外，從LL-OVA處理組到首次用于實(shí)驗(yàn)的BALB/c小鼠的過(guò)繼轉(zhuǎn)移CD4+脾T細(xì)胞證實(shí)這些細(xì)胞可以轉(zhuǎn)移耐受性，因?yàn)檫@些細(xì)胞在用OVA免疫且攻擊受體小鼠后能夠減少DTH應(yīng)答(圖4)。
[0141]結(jié)論
[0142] 此處，證實(shí)OVA分泌乳酸乳球菌的胃內(nèi)施用經(jīng)由誘導(dǎo)⑶4+調(diào)節(jié)而抑制OVA特異性T細(xì)胞應(yīng)答。證實(shí)這種免疫耐受性誘導(dǎo)比游離OVA蛋白質(zhì)更有效，并且這可以在治療背景中建立。
[0143]實(shí)施例B:通過(guò)用遺傳修飾的乳酸乳球菌將DQ8特異性免疫顯性麥醇溶蛋白表位遞送給谷蛋白致敏的II類(lèi)轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)抗原特異性口服耐受性。[0144]前言
[0145]也稱(chēng)為口炎性腹瀉或谷蛋白敏感性腸病的乳糜瀉是慢性炎性疾病，其由針對(duì)包含谷蛋白的特別飲食谷物的免疫應(yīng)答發(fā)展。乳糜瀉是與基因強(qiáng)相關(guān)的復(fù)雜多基因病癥，所述基因編碼人白細(xì)胞抗原變體HLA-DQ2或HLA-DQ8。在乳糜瀉發(fā)病機(jī)理中的最重要方面之一是T輔助I免疫應(yīng)答的激活。這在表達(dá)HLA-DQ2/DQ8分子的抗原呈遞細(xì)胞將毒性谷蛋白肽呈遞給CD4+T細(xì)胞時(shí)發(fā)生。2類(lèi)谷蛋白，麥醇溶蛋白和麥谷蛋白包含結(jié)合DQ2和DQ8的肽。一般公認(rèn)免疫應(yīng)答例如來(lái)自谷蛋白特異性T細(xì)胞的IFN-Y產(chǎn)生觸發(fā)乳糜瀉患者的小腸中的粘膜破壞。因此，有害的免疫T細(xì)胞應(yīng)答在乳糜瀉患者的腸中的激活看起來(lái)在該疾病的起始和進(jìn)展中是關(guān)鍵的。
[0146]抗原特異性免疫抑制是治療乳糜瀉的有吸引力的治療目標(biāo)。重組谷蛋白蛋白質(zhì)/肽通過(guò)遺傳修飾的乳酸乳球菌(LL)在腸粘膜處的有效遞送提供了用于誘導(dǎo)耐受性的新治療方法。為了這個(gè)目的，遺傳改造分泌脫去酰胺基的DQ8表位的LL (LL-eDQ8d)，并且在經(jīng)口補(bǔ)充后在谷蛋白致敏的NOD AB° DQ8II類(lèi)轉(zhuǎn)基因小鼠中評(píng)估局部和全身免疫應(yīng)答。
[0147]此處，證實(shí)產(chǎn)生麥醇溶蛋白肽的乳酸乳球菌的經(jīng)口遞送經(jīng)由誘導(dǎo)抗原特異性⑶4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞而抑制麥醇溶蛋白特異性免疫應(yīng)答。
[0148]材料與方法
[0149]細(xì)菌和培養(yǎng)基:乳酸乳球菌MG1363 (LL)菌株進(jìn)行遺傳修飾，并且在本研究自始至終使用。細(xì)菌在GM17E培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述GM17E培養(yǎng)基是補(bǔ)充有0.5%葡萄糖和5 μ g/ml 紅霉素(Abbott)的 Ml7 肉湯(Difco Laboratories, Detroit, MI)。LL 菌株的忙備懸浮液于_20°C貯存于在GM17E培養(yǎng)基中的50%甘油中。貯備懸浮液在GM17E培養(yǎng)基中稀釋200倍，并且于30°C溫育過(guò)夜。在培養(yǎng)16小時(shí)內(nèi)，達(dá)到2xl09菌落形成單位(CFU)/ml的飽和密度。細(xì)菌通過(guò)離心進(jìn)行收獲，并且以2xl09細(xì)菌/100μ I在BM9接種緩沖液中進(jìn)行10倍濃縮。對(duì)于處理，每只小鼠通過(guò)胃內(nèi)導(dǎo)管每天接受100μ I這種懸浮液。
[0150]質(zhì)粒:編碼脫去酰胺基的DQ8表位的序列(編碼DQ8d:caa tac cca tea ggt gaaggt tea ttc caa cca tea caa gaa aac cca caa get (SEQ ID NO:1))從公開(kāi)數(shù)據(jù)中檢索?？傊?，將α-麥醇溶蛋白肽內(nèi)的2個(gè)谷氨酰胺殘基改變成谷氨酸，以對(duì)攜帶DQ8的乳糜瀉患者刺激脫去酰胺基的免疫顯性α -麥醇溶蛋白應(yīng)答，并且這個(gè)表位由這些小鼠的T細(xì)胞識(shí)別。DQ8d cDNA片段通過(guò)合成構(gòu)建(Operon, The Netherlands),并且通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增，使用下述正向和反向引物:5’ -caatacccatcaggtgaaggttc-3’ (SEQID NO:11)和 5，-cgactagttaagcttgtgggttttcttgtgat-3，(SEQ ID NO: 12)0 為了檢測(cè)目的，使e-標(biāo)簽(e)與由下述序列g(shù)gt get cca gttcca tac cca gat cca ctt gaa cca cgt(SEQ ID NO:13)組成的片段附著。為了給DQ8d基因的5’末端添加e_標(biāo)簽，在步驟I中產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物(DQ8d)在另一 PCR中用作模板,使用寡核苷酸5’-ggtgctccagttccatacccagatccacttgaaccacgtcaatacccatca-3J(SEQ ID NO:14)和S’-cgactagttaagcttgtgggttttcttgtgat-3’(SEQ ID N0:15)。使擴(kuò)增片段與乳球菌屬Pl啟動(dòng)子下游的紅霉素抗性pTINX載體的Usp45分泌信號(hào)融合。用攜帶eDQ8d cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363菌株命名為分泌eDQ8d的乳酸乳球菌(LL-eDQ8d)。其為包含空載體pTINX的MG1363的LL-pTINX充當(dāng)對(duì)照。
[0151] 功能分析分泌的表位:對(duì)于分泌的eDQ8d表位的功能分析，執(zhí)行用衍生自乳糜瀉(⑶)患者的腸的人T細(xì)胞克隆的增殖測(cè)定。細(xì)菌如上所述過(guò)夜生長(zhǎng)，1:50稀釋?zhuān)曳謩e生長(zhǎng)另外4或6小時(shí)。對(duì)于谷蛋白特異的T細(xì)胞克隆由得自患者S的小腸活組織檢查產(chǎn)生，患者S是已進(jìn)行不含谷蛋白飲食數(shù)年的成年荷蘭人CD患者?；颊呓o出關(guān)于該研究的知情同意書(shū)，這得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。該患者血清學(xué)分型為HLA-DR3/4，DQ2/8，因此攜帶2種⑶相關(guān)DQ 二聚體。發(fā)現(xiàn)當(dāng)與HLA-DQ8結(jié)合時(shí)，T細(xì)胞克隆1129響應(yīng)具有最少9氨基酸核心QGSFQPSQQ的α -麥醇溶蛋白衍生肽。發(fā)現(xiàn)Pl和/或Ρ9谷氨酰胺殘基(Q)通過(guò)組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性脫去酰胺基成為谷氨酸(Ε)，顯著增強(qiáng)這種谷蛋白肽的T細(xì)胞刺激能力。增殖測(cè)定在150 μ I培養(yǎng)基(Iscoves)中在96孔平底平板(Falcon)中一式兩份或一式三份地進(jìn)行，使用在幾個(gè)濃度的上清液不存在或存在的情況下用IO5HLA-DQ-匹配的和3000RAD輻射的外周血單核細(xì)胞刺激的IO4T細(xì)胞。48小時(shí)后，培養(yǎng)物用0.5uCi的3H-胸苷進(jìn)行脈沖，其后18小時(shí)時(shí)收獲培養(yǎng)物，這之后測(cè)定3H-胸苷摻入作為增殖的量度。
[0152]小鼠:在內(nèi)源MHC I1-缺陷背景中表達(dá)HLA-DQ8的轉(zhuǎn)基因小鼠(AB° DQ8+)與NOD小鼠回交10代，并且互交以產(chǎn)生同基因型NOD AB° DQ8+小鼠。7-16周大的小鼠用于實(shí)驗(yàn)。小鼠進(jìn)行斷奶且維持在常規(guī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，直至8-12周大。[0153]抗原和抗體:合成含(GAPVPYPDPLEPRQYPSGEGSFQPSQENPQA(SEQID NO:16))和不含(QYPSGEGSFQPSQENPQA (SEQ ID NO:2)) e_標(biāo)簽的脫去酰胺基的DQ8表位。對(duì)于T細(xì)胞表型分型，分別地，從BD-Biosciences (San Jose, CA)購(gòu)買(mǎi)CD4和CD25抗體，并且從eBiosciences (San Diego, USA)購(gòu)買(mǎi)APC抗_Foxp3染色試劑盒?？?1L-10中和單克隆抗體(148/!111，克隆邛5052八5)36卩-3中和單克隆抗體(I μ g/ml，克隆1D11)和LAP中和抗體(I μ g/ml,克隆 27235)得自 R&D systems (Minneapolis, MN)。
[0154]經(jīng)口飼喂和DTH(遲發(fā)型超敏)反應(yīng):以不含谷蛋白食物為生的NOD AB° DQ8小鼠在第一天時(shí)通過(guò)在尾基部中皮下注射在100 μ 11:1CFA (購(gòu)自Difco of Becton, Dickinsonand Company, San Jose, CA)鹽水溶液中的100 μ g脫去酰胺基的eDQ8肽進(jìn)行致敏。用于致敏作用的肽具有與分泌的表位相同的序列。對(duì)小鼠飼喂作為陰性對(duì)照的BM9、LL-pTINX或LL-eDQ8d[全部在第1_10天時(shí)溶解于100 μ I ΒΜ9中]。通過(guò)使用18號(hào)不銹鋼管飼針胃內(nèi)施用抗原或細(xì)菌懸浮液進(jìn)行飼喂。免疫后10天，評(píng)估抗原特異性DTH應(yīng)答。其后24小時(shí)時(shí)執(zhí)行DTH測(cè)量。對(duì)于抗原特異性DTH應(yīng)答的測(cè)量，小鼠用在10 μ I鹽水中的10 μ geDQ8d在耳的耳廓中進(jìn)行攻擊。在攻擊后24小時(shí)時(shí)使用工程師的測(cè)微計(jì)(Mitutoyo，Tokyo，Japan)以不知情方式測(cè)量耳厚度的增加。DTH應(yīng)答表示為在eDQ8d注射后24小時(shí)時(shí)增加的差異(減去攻擊前的耳厚度后)。隨后處死小鼠，收獲脾和淋巴結(jié)，并且就DQSd特異性增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生評(píng)估細(xì)胞。對(duì)于e-標(biāo)簽干擾，NOD AB° DQ8小鼠在第I天時(shí)在尾基部中用在100μ 11:1完全弗氏佐劑(CFA，Difco，BD)鹽水溶液中的100 μ g含(eDQ8d)或不含E-標(biāo)簽(DQSd)的脫去酰胺基的DQ8表位進(jìn)行免疫。在第7天時(shí)，如上所述用對(duì)應(yīng)于用于免疫的肽的IOyg含或不含e-標(biāo)簽的DQ8d執(zhí)行小鼠DTH測(cè)量。
[0155]細(xì)胞培養(yǎng)、增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生測(cè)定:在實(shí)驗(yàn)的第11天時(shí)通過(guò)用組織磨碎器在IXPBS中使組織均質(zhì)化制備脾和淋巴結(jié)的細(xì)胞懸浮液。通過(guò)與ACK(氯化銨/鉀(裂解緩沖液))一起溫育從脾細(xì)胞懸浮液中去除紅細(xì)胞。細(xì)胞以5x10s細(xì)胞/孔在0.2-ml體積中于37°C在RPMI1640 (1.5% HepesU% Penstrep和10% FBS)中在96孔微量滴定板中溫育，所述RPMI1640具有包含單獨(dú)的培養(yǎng)基、10 μ g Con A或50yg eDQ8d表位的補(bǔ)充物。在分開(kāi)的實(shí)驗(yàn)中，將IL-KKTGF-β、ILlO和TGF-β或LAP中和抗體加入LL_eDQ8d處理的小鼠的脾細(xì)胞中。24小時(shí)后，通過(guò)加入I μ Ci/孔[3H]-胸苷進(jìn)行最后24小時(shí)培養(yǎng)來(lái)評(píng)估增殖。在玻璃纖維濾器墊上收獲DNA結(jié)合的放射性活性,并且在閃爍計(jì)數(shù)器(Perkin Elmer)上測(cè)量胸苷摻入。結(jié)果表示為一式三份孔的平均cpm。對(duì)于細(xì)胞因子測(cè)量，在培養(yǎng)24小時(shí)后如上所述收集在不同增殖測(cè)定中使用的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，且于-20°C進(jìn)行冷凍直至執(zhí)行細(xì)胞因子分析。細(xì)胞因子產(chǎn)生使用 Mouse Inflammation Cytometric Bead Assay (BD Biosciences)進(jìn)行定量。
[0156]流式細(xì)胞術(shù)分析:分離BM9、LL-pTINX或LL_eDQ8d處理的小鼠的脾和腸相關(guān)淋巴結(jié)組織(GALT)，如上所述進(jìn)行制備，并且就⑶4、⑶25和Foxp3進(jìn)行染色。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(eBiosciences, San Diego, CA)針對(duì)Foxp3執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)染色,并且隨后使用流式細(xì)胞術(shù)在Becton Dickinson FACSCaliburs上進(jìn)行測(cè)量。對(duì)于分析，細(xì)胞針對(duì)CD4+CD25+和⑶4+CD25_亞群進(jìn)行門(mén)控，并且在這些群體內(nèi)，F(xiàn)oxp3直方圖用于測(cè)定平均熒光強(qiáng)度(MFI)。
[0157]統(tǒng)計(jì)分析:來(lái)自細(xì)胞因子測(cè)量的結(jié)果表示為平均值土SEM。eDQ8d特異性增殖、耳厚度和細(xì)胞因子測(cè)量就顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)，使用單因素ANOVA隨后為斯氏t檢驗(yàn)比較:2個(gè)樣品假定相等差異，以測(cè)定單獨(dú)的組間的差異。對(duì)于所有檢驗(yàn)，P值〈0.05:*，〈0.01:**用于指示2種檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)顯著性。
[0158]結(jié)果
[0159]eDQ8d表位經(jīng)由乳酸乳球菌的粘膜遞送顯著減少DQ8d誘導(dǎo)的DTH應(yīng)答以及大暈脾和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖能力。
[0160]與致敏的陰性對(duì)照小鼠比較，LL-eDQ8d在eDQ8d免疫的NOD AB° DQ8II類(lèi)轉(zhuǎn)基因小鼠中的每日胃內(nèi)施用導(dǎo)致DTH應(yīng)答的顯著減少(圖5 )。對(duì)照小鼠(飼喂BM9 )明顯對(duì)于eDQ8d免疫，但LL_eDQ8d的每日胃內(nèi)施用顯著減少DTH (13.1x10 2mm對(duì)5.1x10 2mm,p=0.0031)。與對(duì)照比較，耳腫脹在LL-pTINX處理的小鼠中也輕微減少(9.3xl(T2mm對(duì)
13.lxl(T2_ ρ=0.0343)，但程度比LL-eDQ8d處理的小鼠中小得多。非DQ8轉(zhuǎn)基因NOD AB。小鼠顯示耳厚度僅微小的增加(3.2xl0_2mm)。這些數(shù)據(jù)表明經(jīng)口施用的LL_eDQ8d抑制免疫的NOD AB° DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠中的全身性炎性T細(xì)胞應(yīng)答，并且分泌的抗原對(duì)于誘導(dǎo)顯著的致耐受性效應(yīng)是必需的。這些數(shù)據(jù)伴隨脾細(xì)胞和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞顯著減少的增殖能力(圖6)。減少的增殖應(yīng)答伴隨IL-10的顯著上調(diào)和IL-12產(chǎn)生的下調(diào)(在脾細(xì)胞的離體eDQ8d刺激后)(圖7)。此外，與BM9和LL-pTINX處理的小鼠比較，LL_eDQ8d顯著減少在腹股溝淋巴結(jié)中的eDQ8d誘導(dǎo)的IFN- Y產(chǎn)生?？傊@些數(shù)據(jù)表明LL_eDQ8d處理在eDQ8d刺激后抑制T細(xì)胞激活，并且暗示DC激活也可以進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0161]減小的脾eDQ8d特異件增葙依賴(lài)于IL-10和TGF- β ,并目.LL_DQ8d處理顯著增加脾和GALT的Foxd3表汰
[0162] TGF-β、IL-10和LAP (膜結(jié)合TGF-β )對(duì)于eDQ8d特異性脾增殖應(yīng)答的功能重要性使用中和抗體進(jìn)行分析。IL-10-、TGF- β -或LAP-中和抗體未顯著干擾LL_eDQ8d處理的小鼠減少的脾增殖應(yīng)答，但添加TGF- β和IL-10中和單克隆抗體的組合完全取消LL-eDQ8d處理的小鼠脾細(xì)胞減少的eDQ8d特異性增殖能力(圖8)。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈暗示LL-eDQ8d處理在eDQ8d免疫的NOD AB° DQ8II類(lèi)轉(zhuǎn)基因小鼠中能夠抑制T細(xì)胞激活，并且這種抑制依賴(lài)于IL-10和TGF-β。此外，與對(duì)照(BM9)比較，在LL-eDQ8d處理的小鼠的脾⑶4+CD25+以及⑶4+⑶25_細(xì)胞群體內(nèi)可見(jiàn)Foxp3的顯著上調(diào)(分別為MFI171對(duì)61和35對(duì)6)。值得注意的是，與BM9處理比較，F(xiàn)oxp3在LL-eDQ8d處理的小鼠的腸相關(guān)淋巴結(jié)組織(GALT)中的0)4+0025-群體中也是上調(diào)的(]\^173對(duì)30)，但在641^ CD4+CD25+群體中不是。LL-pTINX飼喂也誘導(dǎo)一定的Foxp3上調(diào)，但專(zhuān)有地在脾⑶4+CD25_T細(xì)胞群體中，并且程度比LL_eDQ8d低(分別為MFI15對(duì)35)。
[0163]結(jié)論
[0164]我們的數(shù)據(jù)證實(shí)對(duì)于DQ8介導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答免疫顯性的麥醇溶蛋白衍生肽通過(guò)遺傳修飾的乳酸乳球菌的粘膜遞送，在NOD AB° DQ8II類(lèi)轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)局部和全身DQ8限制性T細(xì)胞應(yīng)答的抑制。處理導(dǎo)致脾細(xì)胞和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖能力的抗原特異性減少，這關(guān)鍵性地依賴(lài)IL-10和TGF-β的產(chǎn)生，并且與Foxp3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的顯著誘導(dǎo)相關(guān)。因?yàn)檫@種抗原遞送細(xì)菌方法具有甚至在確定的超敏性的背景中使得口服耐受性成為可能的能力，所以它可用于治療乳糜瀉和可能地其他自身免疫和/或變應(yīng)性疾病。
[0165]天然DQ8表位[0166]上述實(shí)驗(yàn)用天然α-麥醇溶蛋白表位即QYPSGQGSFQPSQQNPQA(SEQ ID NO: 4)進(jìn)行重復(fù)，所述表位對(duì)應(yīng)于可經(jīng)由UniProtKB/TrEMBL條目Q9M4L6檢索的序列的殘基203-220。所述天然的DQ8表位由核苷酸序列5’ -caa tac cca tea ggt caa ggt tea ttc caa ccatea caa caa aac cca caa gct_3’ (SEQ ID NO:3)編碼。
[0167]用天然α-麥醇溶蛋白DQ8表位的結(jié)果基本上等同于上文對(duì)于脫去酰胺基的α -麥醇溶蛋白DQ8表位描述的結(jié)果。
[0168]使用DQ8表位在乳糜瀉患者中進(jìn)行的試驗(yàn)
[0169]在預(yù)備研究中，根據(jù)本發(fā)明的改造的乳酸乳球菌在具有乳糜瀉的患者的試驗(yàn)中用作治療劑。我們的發(fā)現(xiàn)提供了這種方法以抗原特異性方式有效的希望。
[0170]由于LL在初次應(yīng)答的位點(diǎn)處遞送抗原以達(dá)到直接和旁觀(guān)者耐受性的能力，乳糜瀉是這種方法的特別有吸引力的靶。
[0171]使用DQ2表位在乳糜瀉患者中進(jìn)行的試驗(yàn)
[0172]不存在可與上文使用的HLA-DQ8小鼠比較的，在內(nèi)源MHC I1-缺陷背景中表達(dá)HLA-DQ2的轉(zhuǎn)基因小鼠。因此，上文對(duì)于DQ8表位描述的實(shí)驗(yàn)在合適的小鼠模型中是不可能的。因此在具有乳糜瀉的患者中進(jìn)行某些預(yù)備實(shí)驗(yàn)，使用天然以及脫去酰胺基的α-麥醇溶蛋白DQ2表位。
[0173]特別地，上述實(shí)驗(yàn)使用下述進(jìn)行重復(fù):
[0174]脫去酰胺基的DQ2 表位 LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF(SEQ ID N0:6)，其由核苷酸序列5’ -tta caa tta caa cca ttc cca caa cca gaa tta cca tac cca tta ccatac cca caa cca gaa tta cca tac cca caa cca caa cca ttc (SEQ ID NO:5)編石馬，
[0175]和天然DQ2 表位:LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (SEQ ID N0:8)，其由核苷酸序列5’ -tta caa tta caa cca ttc cca caa cca caa tta cca tac cca tta cca taccca caa cca caa tta cca tac cca caa cca caa cca ttc (SEQ ID NO:7)編石馬。
[0176]用天然和脫去酰胺基的α-麥醇溶蛋白DQ2表位的結(jié)果基本上等同于上文對(duì)于α -麥醇溶蛋白DQ8表位描述的結(jié)果。
[0177]實(shí)施例C:在分泌所述因子的乳酸乳球菌的經(jīng)口施用后誘導(dǎo)對(duì)凝血因子VIII和因子IX的耐受性[0178]前言
[0179]幾種治療(重組)蛋白質(zhì)，例如干擾素、因子VIII/IX和抗體(Remicade)在延長(zhǎng)的治療期以高劑量施用。然而，與其使用相關(guān)的并發(fā)癥是蛋白質(zhì)特異性免疫應(yīng)答例如抗體的發(fā)展。這些抗體(Ab)也稱(chēng)為抑制劑，使得治療蛋白質(zhì)更不有效。例子包括在經(jīng)歷慢性腎衰竭的治療的患者中在血友病中的因子VIII/IX、促紅細(xì)胞生成素(Epo)的抑制劑的形成，和在經(jīng)歷多發(fā)性硬化癥的治療的患者中IFN-的抑制劑的形成。此處，證實(shí)因子VIII (和因子IX)通過(guò)乳酸乳球菌的經(jīng)口遞送經(jīng)由誘導(dǎo)抗原特異性⑶4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞而抑制所述因子的抑制劑形成。
[0180]材料與方法
[0181]細(xì)菌和質(zhì)粒:乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至終使用。細(xì)菌在GM17培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述GM17培養(yǎng)基即補(bǔ)充有0.5%葡萄糖的M17 (Difco Laboratories,Detroit,MD0所有菌株的貯備懸浮液于_20°C貯存于在GM17中的50%甘油中。對(duì)于胃內(nèi)接種，貯備懸浮液在新鮮GM17中稀釋200倍，并且于30°C進(jìn)行溫育。它們?cè)?6小時(shí)內(nèi)達(dá)到2xl09菌落形成單位(CFU) /ml的飽和密度。本研究自始至終，使用混合的細(xì)菌懸浮液。因此，混合的細(xì)菌通過(guò)離心進(jìn)行收獲，并且2種細(xì)菌培養(yǎng)物的沉淀在BM9培養(yǎng)基(Schotte，Steidler等人2000)中進(jìn)行10倍濃縮。對(duì)于處理，每只小鼠通過(guò)胃內(nèi)導(dǎo)管接受100 μ I這種懸浮液。
[0182]代表FVIII和FIX特異性CD4+T細(xì)胞表位的人FVIII和FIX cDNA或cDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，并與乳球菌屬Pl啟動(dòng)子下游的紅霉素抗性PTlNX載體的Usp45分泌信號(hào)融合。
[0183]用攜帶人FVIII (和/或表位片段)、FIX (和/或表位片段)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363菌株命名為分泌FVII1、FIX的乳酸乳球菌LL-FVII1、LL-FIX。其為包含空載體pTINX的MG1363的LL-pTINX充當(dāng)對(duì)照。
[0184]FVIII和FIX的定量:分別來(lái)自L(fǎng)L-FVIII和LL-1X的FVIII或FIX使用人FVIII和FIX特異性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)進(jìn)行測(cè)定，所述ELISA先前已得到描述(Chuah等人，2003)。重組蛋白質(zhì)也通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析以及COATests和aPTT測(cè)定進(jìn)行分析,如所描述的(Chuah等人,2003 ;VandenDriessche等人，1999)。這種蛋白質(zhì)的NH2-末端通過(guò)自動(dòng)化埃德曼(Edman)降解進(jìn)行測(cè)定。因?yàn)镕VIII和FIX通常在肝中表達(dá)，在其中它們經(jīng)歷廣泛的翻譯后修飾，所以由改造的乳酸乳球菌產(chǎn)生的凝血因子可能是無(wú)生物學(xué)活性的。然而，這些翻譯后差異將可能對(duì)這些乳酸乳球菌產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)誘導(dǎo)免疫耐受性的能力不具有影響。事實(shí)上，迄今為止已詳細(xì)表征的大多數(shù)抑制劑一般識(shí)別氨基酸殘基(Villard等人，2003),而不是糖基化部分。
[0185]動(dòng)物:使用如由Bi等人，(1995)和Wang等人，(1997)描述的在ES細(xì)胞中的同源重組，通過(guò)敲除鼠類(lèi)FVIII或FIX基因獲得的血友病A或B小鼠在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行培育。在CFA存在下用純化的重組FVIII或FIX抗原進(jìn)行攻擊時(shí)，這些接受小鼠產(chǎn)生中和抗體(Mingozzi等人，2003)。抑制劑狀態(tài)可以使用Bethesda測(cè)定或抗-FVIII/抗-FIX特異性ELISA隨著時(shí)間過(guò)去進(jìn)行監(jiān)控。用FVIII或FIX (+CFA)攻擊的接受小鼠一般在抗原攻擊后2_3周發(fā)展抑制劑。
[0186] 實(shí)驗(yàn)設(shè)置:4-6周大的小鼠接受 FVII1、FIX、LL-FVIII, LL-FIX 或 LL-pTINX 或LL-OVA (無(wú)關(guān)抗原)(I或10yg)。作為耐受性誘導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照，用從肝細(xì)胞特異性啟動(dòng)子表達(dá)FIX的腺伴隨病毒載體(AAV)注射小鼠。接受動(dòng)物發(fā)展FIX特異性免疫耐受性，其在用FIX+CFA后續(xù)攻擊后阻止抗-FIX抗體的誘導(dǎo)。
[0187]在預(yù)防背景中，單獨(dú)的FVII1、FIX、LL-FVII1、LL-FIX使用胃導(dǎo)管經(jīng)口施用于血友病A或B小鼠，使用不同的處理間隔和劑量。這些接受小鼠隨后在CFA的存在下用純化的重組FVIII和FIX抗原進(jìn)行攻擊(Mingozzi等人，2003)。使對(duì)照動(dòng)物暴露于LL-pTINX和LL-0VA。通過(guò)眶后采血收獲血漿。針對(duì)FVIII或FIX的抗體的發(fā)展使用Bethesda測(cè)定(Kasper 等人，1975)或使用改良的抗-FVIII 或抗-FIX 特異性 ELISA (VandenDriessche等人，1999)以不同時(shí)間間隔進(jìn)行評(píng)估。
[0188]在治療背景中，如所述的(Mingozzi等人，2003)，血友病A或B小鼠首先用FVIII或FIX進(jìn)行免疫。抑制劑狀態(tài)使用Bethesda測(cè)定或抗-FVIII/抗-FIX特異性ELISA隨著時(shí)間過(guò)去進(jìn)行監(jiān)控。具有低或高抑制劑滴度的小鼠隨后用單獨(dú)的FVII1、FIX、LL-FVII1、LL-FIX進(jìn)行處理，使用不同的處理間隔和劑量，并且抑制劑滴度隨著時(shí)間過(guò)去進(jìn)行測(cè)定?？赡艿拿庖吣褪苄缘奶禺愋酝ㄟ^(guò)用無(wú)關(guān)抗原(破傷風(fēng)類(lèi)毒素或Ova)攻擊接受單獨(dú)的FVII1、FIX、LL-FVII1、LL-FIX的小鼠進(jìn)行評(píng)估。
[0189]細(xì)胞培養(yǎng)、增殖和細(xì)胞因子測(cè)定:通過(guò)使細(xì)胞通過(guò)70 μ m細(xì)胞過(guò)濾器(Becton/Dickinson Labware)制備脾和淋巴結(jié)的單細(xì)胞懸浮液。通過(guò)與紅細(xì)胞裂解緩沖液一起溫育從脾細(xì)胞懸浮液中去除紅細(xì)胞。
[0190]對(duì)于總脾細(xì)胞群體的增殖測(cè)定，2xl05細(xì)胞在96孔U形底平板中在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基單獨(dú)或具有純化的FVIII或FIX、并且含有或不含抗-1L-10或抗-TGF-β中和單克隆抗體。FVIII和FIX以1-100 μ g/ml的濃度加入。中和抗體以1、0.1和0. 01 μ g/ml加入。對(duì)于⑶4+T細(xì)胞和⑶4+⑶25_T細(xì)胞群體的增殖測(cè)定，0.2χ105個(gè)⑶4+Τ細(xì)胞或⑶4+CD25_T細(xì)胞在96孔U形底平板中與充當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞的IxlO5經(jīng)輻射的⑶4_細(xì)胞，和FVIII或FIX (O或100μ g/ml) —起在含或不含中和抗體的總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。于37°C在5% CO2加濕培養(yǎng)箱中72小時(shí)后，通過(guò)加Λ IuCi/孔[3H]-胸苷來(lái)評(píng)估增殖。在16-18小時(shí)后在玻璃纖維濾器墊(Perkin Elmer,Boston, USA)上收獲DNA結(jié)合的放射性活性，并且在閃爍計(jì)數(shù)器(Perkin Elmer)上測(cè)量胸苷摻入。
[0191]對(duì)于細(xì)胞因子測(cè)量，在培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后收集在不同增殖測(cè)定中使用的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，且于-20°C進(jìn)行冷凍直至執(zhí)行細(xì)胞因子分析。細(xì)胞因子產(chǎn)生使用MouseInflammation Cytometric Bead Assay (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)進(jìn)行定量。
[0192]體內(nèi)T調(diào)節(jié)活性測(cè)定:為了測(cè)試小鼠中抗體形成的有效抑制，將從不同實(shí)驗(yàn)乳酸乳球菌處理的組中分離的脾細(xì)胞、珠純化的⑶4+T細(xì)胞、⑶4+⑶25_或⑶4+⑶25+T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移給首次用于實(shí)驗(yàn)的C3H/HeJ小鼠。未處理的小鼠用作對(duì)照。轉(zhuǎn)移細(xì)胞的數(shù)目對(duì)于整體脾細(xì)胞、亞群耗盡的脾細(xì)胞、或陽(yáng)性選擇的CD4+細(xì)胞以及CD4+CD25_和CD4+CD25+T細(xì)胞是107。接受小鼠(n=4-5/實(shí)驗(yàn)群組)在過(guò)繼轉(zhuǎn)移后36小時(shí)時(shí)用在cFA中的5 μ g hF.1X進(jìn)行皮下注射。血漿中的抗hF.1X IgG滴度在免疫后2.5周進(jìn)行測(cè)量。
[0193]結(jié)果
[0194]與游離FVIII或FIX比較，LL-FVIII和LLzIX顯著增強(qiáng)血友病A或B小鼠的耐等性誘導(dǎo)能力
[0195]為了研究口服耐受性的誘導(dǎo)，小鼠如上所述(實(shí)驗(yàn)設(shè)置)進(jìn)行經(jīng)口飼喂。LL-FVIII或LL-FIX的添加顯著增強(qiáng)針對(duì)FVIII和FIX的耐受性誘導(dǎo)，因?yàn)榕c對(duì)照以及游離FVIII和FIX組比較，脾細(xì)胞的因子特異性增殖應(yīng)答在這個(gè)組中顯著減少。
[0196]LL-FIIIV和LL-FK增強(qiáng)與響應(yīng)所沭閔子的減小的FVII1-和FK特異件滴度和IFN-Y以及更多的ILlO和TGF-β產(chǎn)生相關(guān)的口服耐受性。
[0197]為了研究口服耐受性的誘導(dǎo)，小鼠如上所述(實(shí)驗(yàn)設(shè)置)進(jìn)行經(jīng)口飼喂。脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中響應(yīng)所述因子的FVIII和FIX特異性抗體以及細(xì)胞因子產(chǎn)生如上所述進(jìn)行定量。與對(duì)照和游離FVIII/IX組比較，在LL-FVIII/FIX組中抑制劑形成和促炎細(xì)胞因子IFN- Y的產(chǎn)生強(qiáng)烈減少，并且免疫抑制細(xì)胞因子IL-10和TGF- β顯著增加。
[0198]LL-FVI11/FIX經(jīng)由CD4+T細(xì)朐增強(qiáng)口服耐等件
[0199]為了評(píng)估CD4+T細(xì)胞是否介導(dǎo)口服耐受性的誘導(dǎo)，因子特異性增殖CD4+T細(xì)胞應(yīng)答在脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中進(jìn)行研究。因此，小鼠如上所述(實(shí)驗(yàn)設(shè)置)進(jìn)行經(jīng)口飼喂，并且因子特異性CD4+T細(xì)胞增殖如細(xì)胞培養(yǎng)、增殖和細(xì)胞因子測(cè)定中所述進(jìn)行測(cè)定。與對(duì)照和游離FVIII/IX組比較，LL-FVIII/FIX組中的因子特異性⑶4Τ細(xì)胞應(yīng)答顯著減少。
[0200]在LL-FVIII/FIX處理后抗原誘導(dǎo)的T調(diào)節(jié)細(xì)胞可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)移保護(hù)避免抑制劑碰
[0201]為了在用口服耐受性方案處理的小鼠中測(cè)試抗體形成的有效抑制，如上所述(體內(nèi)T調(diào)節(jié)活性測(cè)定)過(guò)繼轉(zhuǎn)移來(lái)自不同處理組的脾細(xì)胞。與對(duì)照和游離FVIII/IX組比較，抗因子IgG形成在LL-FVIII/FIX組中顯著減少，表明在我們的組合口服耐受性方案中調(diào)節(jié)⑶4+Τ細(xì)胞激活。
[0202]結(jié)論
[0203]我們的數(shù)據(jù)證實(shí)分泌重組FVIII或FIX的乳酸乳球菌的粘膜遞送在抑制血友病A和B小鼠中的FVII1-和FIX-特異性抑制劑的形成中分別比游離FVIII或FIX更有效。
[0204]實(shí)施例D:在分泌所述變應(yīng)原的乳酸乳球菌的經(jīng)口施用后誘導(dǎo)對(duì)變應(yīng)原Der pi的耐受性
[0205]前言
[0206]變應(yīng)性哮喘是氣道的慢性炎性病癥。它的特征在于可逆的氣道阻塞、變應(yīng)原特異性免疫球蛋白E升高的血清水平、粘液分泌過(guò)多和對(duì)ronchospasmogenic刺激的氣道高應(yīng)答性(AHR)。它的癥狀通過(guò)暴露于患者已對(duì)其致敏的變應(yīng)原(例如，樹(shù)、草和雜草花粉、粉塵和塵螨、霉菌、動(dòng)物毛屑)而變得更糟。2型T-輔助(Th2)淋巴細(xì)胞在疾病的起始、進(jìn)展和持續(xù)中起關(guān)鍵作用。目前數(shù)據(jù)暗示對(duì)變應(yīng)原的Th2應(yīng)答通常由調(diào)節(jié)T細(xì)胞抑制。此外，由這個(gè)亞集進(jìn)行的抑制在過(guò)敏個(gè)體中減少。此處，證實(shí)變應(yīng)原經(jīng)由乳酸乳球菌的經(jīng)口遞送經(jīng)由誘導(dǎo)抗原特異性CD4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞而抑制哮喘樣應(yīng)答。
[0207]材料與方法
[0208]模擬人疾病的2種變應(yīng)性哮喘小鼠模型是Ova變應(yīng)原模型和人源化SCID模型。
[0209]Ova變應(yīng)原模型:0VA致敏的小鼠用OVA氣溶膠進(jìn)行吸入攻擊，這導(dǎo)致Th2細(xì)胞因子依賴(lài)性 嗜酸性粒細(xì)胞性氣道炎癥、支氣管高反應(yīng)性和IgE產(chǎn)生，從而表現(xiàn)出人變應(yīng)性哮喘的高度特征(Brusselle, 1994, Clin Exp Allergy24:73 ;Kips 等人 1996, Am J RespirCrit Care Medl53:535 ;Brusselle 等人 1995，Am J Respir Cell Mol Bioll2:254)。
[0210]細(xì)菌:乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至終使用。細(xì)菌在GM17培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述GM17培養(yǎng)基即補(bǔ)充有0.5%葡萄糖的M17 (Difco Laboratories,Detroit,MI)?所有菌株的貯備懸浮液于_20°C貯存于在GM17中的50%甘油中。對(duì)于胃內(nèi)接種，貯備懸浮液在新鮮GM17中稀釋500倍，并且于30°C進(jìn)行溫育。它們?cè)?6小時(shí)內(nèi)達(dá)到2xl09菌落形成單位(CFU) /ml的飽和密度。細(xì)菌通過(guò)離心進(jìn)行收獲，并且在BM9培養(yǎng)基中進(jìn)行10倍濃縮。對(duì)于處理，每只小鼠通過(guò)胃內(nèi)導(dǎo)管每天接受100μ I這種懸浮液。
[0211]質(zhì)粒:編碼原雞卵白蛋白的mRNA序列從Genbank (登記號(hào)AY223553)中檢索。從雞子宮中分離總RNA，并且在25 μ I體積中使用2 μ g總RNA、2 μ M寡核苷酸dT引物(Promega Corporation Benelux,Leiden,The Netherlands)』.0lmM DTT(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht, The Netherlands)』.5mM dNTP (Invitrogen, Merelbeke, Belgium)、20U Rnasin (Promega Incorporation Benelux)和 100U superscript II 逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)合成cDNA。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增OVA cDNA片段,使用下述條件:94°C 2分鐘，隨后為94°C 45秒、62°C 30秒和72°C 90秒的30個(gè)循環(huán)，使用下述正向和反向引物 5’-GGCTCCATCGGTGCAGCAAGCATGGAATT-3，(SEQ ID NO: 17)和 5’-ACTAGTTAAGGGGAAAC-ACATCTGCCAAAGAAGAGAA-3’ (SEQ ID NO: 18)。
[0212]使擴(kuò)增片段與乳球菌屬Pl啟動(dòng)子下游的紅霉素抗性pTINX載體的Usp45分泌信號(hào)融合。
[0213]用攜帶OVA cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的M G1363菌株命名為L(zhǎng)L-0VA。其為包含空載體的MG1363 的 LL-pTREXl 充當(dāng)對(duì)照。
[0214]OVA的定量:來(lái)自L(fǎng)L-OVA的OVA使用內(nèi)部開(kāi)發(fā)的OVA特異性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)進(jìn)行測(cè)定。重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生也通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行評(píng)估。
[0215]小鼠:BALB/c小鼠(6-8 周大)購(gòu)自 Charles River Laboratories(Calco, Italy)。小鼠在特定無(wú)病原體條件下維持。
[0216]小鼠的免疫:小鼠用在Img氫氧化鋁(alum)中的10 μ g OVA (V級(jí)別；Sigma-Aldrich)進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫。這種免疫在21天后進(jìn)行重復(fù)(在第O和21天時(shí))。對(duì)照小鼠接受鹽水注射代替OVA/alum溶液。免疫后26天，致敏的小鼠吸入在PBS中溶解的I %OVA的氣溶膠化溶液10分鐘。OVA吸入連續(xù)進(jìn)行3天(第47、48和49天)。對(duì)照小鼠在用于實(shí)驗(yàn)組的相同條件下吸入單獨(dú)的PBS。
[0217]口服耐受性的誘導(dǎo):小鼠在第0-4、7-11、14_18和21-25天時(shí)接受LL-0VA、LL-pTREXlU μ g OVA或BM9。作為口服耐受性誘導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照，小鼠通過(guò)胃內(nèi)導(dǎo)管飼喂30mg0VA，其減少支氣管嗜酸性粒細(xì)胞增多和氣道高應(yīng)答性，其中高劑量飼喂比低劑量飼喂更有效。
[0218]氣道高應(yīng)答性(AHR)的測(cè)量:最后吸入后24小時(shí)(第50天)，氣道高應(yīng)答性通過(guò)乙酰甲膽堿誘導(dǎo)的氣流阻塞進(jìn)行評(píng)估。小鼠暴露于霧化生理鹽水(Otsuka Pharmaceutical)之^分鐘^逭后為增加劑量^^。!^/!^)的霧化乙酰甲膽堿。在噴霧作用后將這些小鼠置于整體體積描記器中2.5分鐘，并且使用Biosystem XA WBP系統(tǒng)(Buxco Electronics)測(cè)量增強(qiáng)的間歇(Penh)?！癙enh”代表肺氣流阻塞并且使用下式進(jìn)行計(jì)算:Penh= ((Te-Tr)/(Tr xPEF/PIF))，其中Penh=增強(qiáng)的間歇(無(wú)量綱的)，Te=呼氣時(shí)間(秒)，Tr=松弛時(shí)間(秒)，PEF=呼氣流量峰值(毫升/秒)，和PIF=吸氣流量峰值(毫升/秒)。Penh約每5秒進(jìn)行測(cè)量且求平均值，并且累積值平均為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Penh值。氣道高應(yīng)答性表示為PC200Mch(乙酰甲膽堿的200%激發(fā)濃度)，這是雙倍基線(xiàn)Penh值的乙酰甲膽堿濃度。
[0219]支氣管肺泡灌洗液(BALF)分析:在氣道高應(yīng)答性測(cè)量后，獲得支氣管肺泡灌洗樣品。小鼠通過(guò)腹膜內(nèi)注射過(guò)量氯胺酮和賽拉嗪實(shí)施安樂(lè)死，隨后肺用0.5ml鹽水灌洗4次。將灌洗液離心，并且使細(xì)胞重懸浮于具有1% BSA的Iml鹽水中。使用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)目。通過(guò)使懸浮液在300rpm下離心5分鐘制備Cytospin樣品。為了明確區(qū)分嗜酸性粒細(xì)胞與嗜中性粒細(xì)胞，應(yīng)用3種不同染劑:Diff-Quick、May-Griinwald-Giemsa和Hansel(曙紅)染劑。基于標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)光學(xué)顯微鏡檢查區(qū)分至少300個(gè)白細(xì)胞。BALF中的IL_13、IL_4 和 IL-5 水平通過(guò) Cytometric Bead Assay (BD Biosciences,Mountain View,CA，USA)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。
[0220]血清總IgE和OVA特異性Ig的測(cè)量:在第50天時(shí)，在麻醉下從眶后竇獲得血樣。在樣品已完全凝固后，將它們離心，并且收集血清且貯存于_80°C直至使用?？侷gE通過(guò)ELISA使用配對(duì)Ab (BDPharmingen)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。為了測(cè)量血清中的 OVA 特異性 IgE、IgGl 和 IgG2a，用 2 μ g/ml OVA 包被微量滴定板(Maxisorp，Nunc, VffRInternational, Haasrode, Belgium)。隨后,用在PBS中的0.1 %酪蛋白封閉孔,這之后使平板與在包含0.1 %酪蛋白和0.05% Tween20的PBS (PBS-CT)中以1:10-1:20480稀釋的小鼠血清樣品一起溫育，使用山羊抗小鼠IgG2a_HRP [SouthernBiotechnology Associates(SBA), Imtec ITK Diagnostics, Antwerpen,Belgium, 1:5000 稀釋]、山羊抗小鼠 IgGl-HRP或山羊抗小鼠IgE-HRP (SBA, 1:5000稀釋)。洗滌后，向每個(gè)孔中加入底物[3，3，，5，5’四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物試劑，Pharmingen, Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium]。最后，通過(guò)向孔中加入IM H2SO4來(lái)終止反應(yīng)。吸光度在450nm處讀取。ELISA得分表示為滴度，其是仍具有比計(jì)算的截止值更高的OD45tl的最高稀釋度的倒數(shù)。截止值計(jì)算為伴隨3倍SD增加的5只非免疫小鼠的平均0D45Q。
[0221]肺組織的組織學(xué)檢查:獲得支氣管肺泡灌洗樣品后，使肺充滿(mǎn)生理鹽水并且從小鼠中切除。用中和緩沖的福爾馬林使肺固定，并且在石蠟中進(jìn)行包埋。切片(3-μπι厚)用Η&Ε或過(guò)碘酸-希夫(PAS)進(jìn)行染色。肺中的組織學(xué)改變強(qiáng)度用4級(jí)得分進(jìn)行評(píng)估(0，無(wú)炎癥；1，輕度/弱；2，中等；和3，重度)，根據(jù)下述發(fā)現(xiàn)的分布和強(qiáng)度:I)上皮脫落或支氣管上皮細(xì)胞核的波動(dòng)(undulation)，2)杯形細(xì)胞數(shù)目的增加，3)炎性細(xì)胞從血管到支氣管和支氣管周間質(zhì)的粘膜和粘膜下層區(qū)域內(nèi)的浸潤(rùn)，和4)平滑肌細(xì)胞層的肥大和增厚。
[0222]用于分析肺中的細(xì)胞因子和趨化因子基因表達(dá)的RT-PCR:在用生理鹽水灌注后摘除肺，并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用ISOGEN (Nippon Gene)提取總RNA?？俁NA (IOyg)使用寡核苷酸(dT)15 引物(Promega)和 Superscript II RNA 酶 H-逆轉(zhuǎn)錄酶(InvitrogenLife Technologies)于42°C逆轉(zhuǎn)錄2小時(shí)。為了確保每個(gè)樣品包含相同量的cDNA，使用β-肌動(dòng)蛋白特異性引物首先測(cè)定每種樣品的β_肌動(dòng)蛋白cDNA濃度。使這些樣品擴(kuò)增合適的循環(huán)數(shù)目，從而使得PCR產(chǎn)物量保持在擴(kuò)增曲線(xiàn)的線(xiàn)性部分上。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并且通過(guò)溴化乙啶染色進(jìn)行顯現(xiàn)。IL-13、eotaxin、IL-10、IFN-Y和TGF-β的水平使用下述特定引物組進(jìn)行測(cè)定。
[0223]用于 β-肌動(dòng)蛋白的有義引物 5’ -ACGACATGGAGAAGATCTGG-3’ (SEQ ID NO:19),和
[0224]反義引物5’ -TCGTAGATGGGCACAGTGTG-3’(SEQ ID NO:20)。
[0225]用于IL-13 的有義引物 5’ -TCTTGCTTGCCTTGGTGGTCTCGC-3’ (SEQ ID NO:21)，和
[0226]反義5’ -GATGGCATTGCAATTGGAGATGTTG-3’(SEQ ID NO:22)。
[0227]用于eotaxin 的有義引物 5’ -GGGCAGTAACTTCCATCTGTCTCC-3’ (SEQ ID NO:23),和
[0228]反義引物5’ -CACTTCTTCTTGGGGTCAGC-3’(SEQ ID NO:24)。
[0229]用于IL-10 的有義引物 5’ -TACCTGGTAGGAGTGATGCC-3’ (SEQ ID NO:25)，和
[0230]反義5’ -GCATAGAAGCATACATGATG-3’ (SEQ ID NO:26)。
[0231]用于IFN-Y 的有義引物 5’ -CATAGATGTGGAAGAAAAGA-3’ (SEQ ID NO:27)和
[0232]反義5’ -TTGCTGAAGAAGGTAGTAAT-3’ (SEQ ID NO:28)。
[0233]用于TGF-β 的有義引物 5’ -CTTTAGGAAGGACCTGGGTT-3’ (SEQ ID Ν0:29)，和
[0234]反義5’ -CAGGAGCGCACAATCATGTT-3’ (SEQ ID NO:30)。
[0235]細(xì)胞培養(yǎng)、增殖和細(xì)胞因子測(cè)定:最后吸入后I天(第50天)，通過(guò)使細(xì)胞通過(guò)70-μ m細(xì)胞過(guò)濾器(Becton/Dickinson Labware)制備脾和縱隔淋巴結(jié)的單細(xì)胞懸浮液。通過(guò)與紅細(xì)胞裂解緩沖液一起溫育從脾細(xì)胞懸浮液中去除紅細(xì)胞。⑶4+T細(xì)胞和⑶4+⑶25_T細(xì)胞分別使用CD4+T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Germany)或CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec,Germany),以及MACS 柱(midiMACS ；Miltenyi Biotec)進(jìn)行富集。
[0236]對(duì)于大量脾細(xì)胞和LN群體的增殖測(cè)定，2xl05細(xì)胞在96孔U形底平板中在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中單獨(dú)或與純化的OVA —起進(jìn)行培養(yǎng)。OVA以1-100 μ g/ml的濃度加入。對(duì)于⑶4+T細(xì)胞和⑶4+⑶251細(xì)胞群體的增殖測(cè)定，2xl05個(gè)⑶4+T細(xì)胞或^4+^251細(xì)胞在96孔U形底平板中與絲裂霉素處理的脾細(xì)胞一起，以⑶4+T細(xì)胞或⑶4+⑶25-T細(xì)胞/APC1/1U/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0的比例在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)，所述脾細(xì)胞裝載有l(wèi)mg/ml OVA,充當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞。于37°C在5% CO2加濕培養(yǎng)箱中72小時(shí)后，通過(guò)加入I μ Ci/孔[3H]-胸苷來(lái)評(píng)估增殖。在18小時(shí)后在玻璃纖維濾器墊(PerkinElmer, Boston, USA)上收獲DNA結(jié)合的放射性活性,并且在閃爍計(jì)數(shù)器(Perkin Elmer)上測(cè)量胸苷摻入。
[0237]對(duì)于細(xì)胞因子測(cè)量，在培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后收集在不同增殖測(cè)定中使用的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，且于-80°C進(jìn)行冷凍直至執(zhí)行細(xì)胞因子分析。細(xì)胞因子產(chǎn)生使用MouseInflammation Cytometric Bead Array (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)進(jìn)行定量。
[0238] 體內(nèi)T調(diào)節(jié)活性測(cè)定:最后吸入后I天(第21天)，經(jīng)處理的小鼠的脾用0.1%膠原酶(Sigma-Aldrich)于37°C消化20分鐘。在某些實(shí)驗(yàn)中，制備整體脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液，并且與Con Α(2 μ g/ml ;Sigma_Aldrich)—起培養(yǎng)48小時(shí)。收集細(xì)胞，并且將IO7細(xì)胞靜脈內(nèi)過(guò)繼轉(zhuǎn)移到首次用于實(shí)驗(yàn)的BALB/c小鼠內(nèi)。對(duì)于陰性選擇，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用具有生物素化的抗小鼠⑶4、⑶8、⑶11c、⑶19和⑶lib mAb (BD Pharmingen)的磁珠(MACS ；Miltenyi Biotec)使 CD4+、CD8+、CDllc+、CD19+ 或 CDllb+ 細(xì)胞從整體脾細(xì)胞中耗盡。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢查耗盡的效率(>99%)。⑶4+、⑶4+⑶25_細(xì)胞使用⑶4+T細(xì)胞分離試劑盒、調(diào)節(jié)T細(xì)胞分離試劑盒遵循制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化。使用流式細(xì)胞術(shù)檢查陽(yáng)性選擇的細(xì)胞的純度。對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，緊在它們用OVA/alum進(jìn)行第一次免疫前或進(jìn)行第二次免疫后，細(xì)胞從尾靜脈轉(zhuǎn)移到BALB/c小鼠內(nèi)。轉(zhuǎn)移細(xì)胞的數(shù)目對(duì)于整體脾細(xì)胞、亞群耗盡的脾細(xì)胞、或陽(yáng)性選擇的CD4+細(xì)胞和CD4+CD25_細(xì)胞是107。
[0239]在人源化的SCID (hu-SCID)模型中(如由Duez等人，2000 ;Hammad等人，2000描述的)
[0240]在這個(gè)模型中，可以研究對(duì)房塵螨(HDM)變應(yīng)原Der pi的變應(yīng)性免疫應(yīng)答。此種hu-SCID小鼠用來(lái)自HDM過(guò)敏患者的PBMC進(jìn)行腹膜內(nèi)重構(gòu)，并且隨后暴露于HDM的氣溶膠，從而產(chǎn)生人IgE，發(fā)展由活化T細(xì)胞和DC組成的肺浸潤(rùn)，并且響應(yīng)支氣管收縮劑顯示AHR(Pestel 等人 1994, J Tmmunol , 153:3804 ；Duez 等人，Am J Respir Crit Care Med,第 161卷，第 200-206 頁(yè)，2000)。
[0241]細(xì)菌
[0242]乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至終使用。細(xì)菌在GM17培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述GM17培養(yǎng)基即補(bǔ)充有0.5%葡萄糖的M17 (Difco Laboratories, Detroit, MI)。所有菌株的貯備懸浮液于-20°C貯存于在GM17中的50%甘油中。對(duì)于胃內(nèi)接種，貯備懸浮液在新鮮GM17中稀釋200倍，并且于30°C進(jìn)行溫育。它們?cè)?6小時(shí)內(nèi)達(dá)到2xl09菌落形成單位(CFU) /ml的飽和密度。細(xì)菌通過(guò)離心進(jìn)行收獲并且在BM9培養(yǎng)基中進(jìn)行10倍濃縮。對(duì)于處理，每只小鼠通過(guò)胃內(nèi)導(dǎo) 管每天接受100μ I這種懸浮液。
[0243]質(zhì)粒
[0244]Der pi, 222個(gè)氨基酸殘基的球狀糖蛋白，是來(lái)自屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus) (Dpt)的主要變應(yīng)原之一。合成編碼Der pi蛋白質(zhì)的具有最佳乳酸乳球菌密碼子使用的DNA序列，進(jìn)行擴(kuò)增且將其與乳球菌屬Pl啟動(dòng)子下游的紅霉素抗性pTINX載體的Usp45分泌信號(hào)融合。用攜帶鼠類(lèi)Der pl、Der plaa52_71和Der plaall7_133cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的 MG1363 菌株命名為 LL-Derpl、LL-Derplaa52-71 和 LL_Derplaall7_133。其為包含空載體pTINX的MG1363的LL-pTINX充當(dāng)對(duì)照。
[0245]Der pi 的定量
[0246]來(lái)自L(fǎng)L-Derpl的Der pi使用內(nèi)部開(kāi)發(fā)的Der pi特異性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)進(jìn)行測(cè)定。重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生也通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行評(píng)估。
[0247]患者
[0248]從對(duì)房塵螨敏感或不敏感的供體中收集血液。過(guò)敏患者呈現(xiàn)房塵螨致敏的通常特征。針對(duì)屋塵螨(Dpt)變應(yīng)原的皮膚點(diǎn)刺測(cè)試(StallergSnes, Fresnes, France)(直徑≥IOmm)是陽(yáng)性的，并且所有患者具有血清特異性IgE抗體?？侷gE濃度超過(guò)150IU/ml(150-1600IU/ml)。健康供體作為陰性對(duì)照進(jìn)行測(cè)試(總IgE水平小于150IU/ml，并且它們針對(duì)通常吸入的變應(yīng)原具有陰性的皮膚點(diǎn)刺測(cè)試)。
[0249]人外周血單核細(xì)胞制備
[0250]在離心(120x g，15分鐘)后獲得富含血小板的血漿且棄去。血細(xì)胞隨后在RPMI1640 (Life Technologies, Paisley, Scotland)(體積 / 體積)中進(jìn)行稀釋?zhuān)⑶以贔icoll 梯度(Pharmacia, Uppsala, Sweden)上分層。離心(400x g，30 分鐘)后，在界面處收獲PBMC，并且在轉(zhuǎn)移前在無(wú)菌RPMI培養(yǎng)基中洗滌3次。[0251]小鼠
[0252]C.B.-17SCID小鼠(6_8周大)維持在特定動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中的具有無(wú)菌墊層的隔離器中。SCID集落通過(guò)ELISA就小鼠血清免疫球蛋白的不存在進(jìn)行定期檢查。
[0253]在SCID小鼠中的外周血單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移:PBMC hu-SCID小鼠
[0254]SCID小鼠在細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)為6-8周大。小鼠通過(guò)經(jīng)由23號(hào)針腹膜內(nèi)注射在400 μ IRPMI中的來(lái)自過(guò)敏患者或健康供體的IOxlO6單核細(xì)胞進(jìn)行重構(gòu)。在同一天，它們腹膜內(nèi)接受2指數(shù)反應(yīng)性(index reactivity) [IR]單位Dpt。細(xì)胞重構(gòu)后4天,使SCID小鼠每天暴露于包含100IR單位Dpt (100IR單位等價(jià)于包含在Dpt提取物中的約200 μ g蛋白質(zhì))的變應(yīng)原氣溶膠，進(jìn)行連續(xù)4天(第O天-第4天)。對(duì)照組不暴露于Dpt。氣道應(yīng)答性測(cè)量前I天(第35天和第60天)，使hu-SCID小鼠暴露于另一個(gè)100IR單位Dpt溶液的氣溶膠。
[0255]實(shí)驗(yàn)設(shè)置
[0256]小鼠接受經(jīng)改造以表達(dá)Der pi或作為陰性對(duì)照的無(wú)關(guān)抗原(OVA)的乳酸乳球菌。
[0257]改造的乳酸乳球菌細(xì)菌使用胃導(dǎo)管經(jīng)口施用于SCID小鼠，在PBMC重構(gòu)后I天開(kāi)始且使用不同處理間隔和劑量。通過(guò)測(cè)量人血清IgE抗體、分析肺浸潤(rùn)、測(cè)量AHR以及分析在BALF中的細(xì)胞群 和細(xì)胞因子產(chǎn)生來(lái)評(píng)估口服耐受性的誘導(dǎo)。此外，耐受性的誘導(dǎo)通過(guò)分析針對(duì)Derpl的增殖T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行評(píng)估。
[0258]氣道應(yīng)答性(AHR)的評(píng)估
[0259]氣道應(yīng)答性(表示為引起肺阻力增加50%的氨甲酰膽堿的激發(fā)劑量)在第35天或第60天時(shí)進(jìn)行測(cè)量，如由Duez等人2000描述的。
[0260]人IgE測(cè)量
[0261]用人細(xì)胞移植后數(shù)天，小鼠在麻醉下從眶后竇進(jìn)行采血?？?cè)薎gE通過(guò)雙位點(diǎn)免疫放射測(cè)定方法進(jìn)行研究，使用對(duì)于ε -鏈特異的2種不同小鼠mAb (ImmunotechInternational, Luminy,France)ο在一式兩份的測(cè)試中使用至少20 μ I血清。該方法的靈敏度允許檢測(cè) 0.1IUiml (0.24ng/ml)。
[0262]抗Dpt變應(yīng)原的特定IgE Ab通過(guò)ELISA進(jìn)行定量。簡(jiǎn)言之，塑料管(MaxisorbStartube, Nunc, Denmark)用在0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的Dpt變應(yīng)原于4°C包被過(guò)夜，并且用在0.1M PBS (pH7.4)中的1% BSA在室溫下飽和2小時(shí)。洗滌后，管與在包含BSA (1%)和Tween (0.01 %)的PBS中稀釋的Hu-SCID小鼠血清在室溫下溫育2小時(shí)，并且于4°C溫育過(guò)夜。充分洗滌后，加入HRP標(biāo)記的抗人IgE Ab。洗滌后，向每個(gè)孔中加入底物[3,3，,5,5，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物試劑，Pharmingen, Becton Dickinson,Erembodegem, Belgium] ?最后，通過(guò)向孔中加入IM H2SO4來(lái)終止反應(yīng)。吸光度在450nm處讀取。
[0263]肺的組織學(xué)檢查
[0264]肺在第35天時(shí)進(jìn)行切除，并且在低聚甲醛中進(jìn)行固定，并且進(jìn)行加工以用于石蠟包埋。石蠟組織切片進(jìn)行染色以檢測(cè)人⑶45+細(xì)胞，這之后鼠類(lèi)肺切片上的人細(xì)胞通過(guò)組織學(xué)評(píng)分進(jìn)行定量，如由Duez等人2000描述的。
[0265]支氣管肺泡灌洗液(BALF)的分析
[0266]BALF如OVA變應(yīng)原模型中所述進(jìn)行分析。
[0267]細(xì)胞培養(yǎng)、增殖和細(xì)胞因子測(cè)定:[0268]通過(guò)使細(xì)胞通過(guò)70 μ m細(xì)胞過(guò)濾器(Becton/Dickinson Labware)制備脾的單細(xì)胞懸浮液。通過(guò)與紅細(xì)胞裂解緩沖液一起溫育從脾細(xì)胞懸浮液中去除紅細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25_T細(xì)胞分別使用人CD4+T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Germany)或人CD4+CD25+調(diào)節(jié) T 細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Germany)以及 MACS 柱(midiMACS ；Miltenyi Biotec)進(jìn)行富集。
[0269]對(duì)于大量脾細(xì)胞的增殖測(cè)定，2xl05細(xì)胞在96孔U形底平板中在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基單獨(dú)或具有純化的Der p1、并且含或不含抗-1L-1O或抗-TGF-β中和單克隆抗體。Der pi以1-100 μ g/ml的濃度加入。中和抗體以1、0.1和0.01 μ g/ml加入。對(duì)于人⑶4+T細(xì)胞和人⑶4+⑶25—T細(xì)胞群體的增殖測(cè)定，2xl05個(gè)⑶4+T細(xì)胞或⑶4+⑶25_T細(xì)胞在96孔U形底平板中與絲裂霉素處理的人PBMC —起，以⑶4+Τ細(xì)胞或CD4+CD25-T細(xì)胞/APC1/1U/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0的比例在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)，所述培養(yǎng)基含或不含中和抗體，所述人PBMC裝載有l(wèi)mg/ml Der pl，充當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞。于37°C在5% CO2加濕培養(yǎng)箱中72小時(shí)后，通過(guò)加入I μ Ci/孔[3H]-胸苷來(lái)評(píng)估增殖。在18小時(shí)后在玻璃纖維濾器墊(Perkin Elmer, Boston, USA)上收獲DNA結(jié)合的放射性活性，并且在閃爍計(jì)數(shù)器(Perkin Elmer)上測(cè)量胸苷摻入。
[0270]對(duì)于細(xì)胞因子測(cè)量，在培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后收集在不同增殖測(cè)定中使用的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，且于-80°C進(jìn)行冷凍直至執(zhí)行細(xì)胞因子分析。細(xì)胞因子產(chǎn)生使用HumanInflammation Cytometric Bead Assay (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)進(jìn)行定量。 [0271]結(jié)果
[0272]LL-OVA和LL-Der pl分別在哮喘的0VA-和huSCID小鼠樽型中顯著增強(qiáng)耐等件誘導(dǎo)能力。
[0273]為了研究口服耐受性的誘導(dǎo)，小鼠如上所述(實(shí)驗(yàn)設(shè)置)進(jìn)行經(jīng)口飼喂。LL-OVA/Derpl的添加顯著增強(qiáng)針對(duì)0VA/Derpl的耐受性誘導(dǎo)，因?yàn)榕c對(duì)照以及游離0VA/Derpl組比較，脾細(xì)胞的變應(yīng)原特異性增殖應(yīng)答在LL-OVA/Derpl組中顯著減少。
[0274]LL-OVA/Derpl增強(qiáng)與響應(yīng)所述變應(yīng)原的減少的AHR，嗜酸性粒細(xì)胞性浸潤(rùn)，血 清I迚水平，以及減少的IL-13、IL-4和IL-5細(xì)胞因子產(chǎn)生相關(guān)的口服耐受性。
[0275]為了研究口服耐受性的誘導(dǎo)，小鼠如上所述(實(shí)驗(yàn)設(shè)置)進(jìn)行經(jīng)口飼喂。響應(yīng)所述抗原的AHR、嗜酸性粒細(xì)胞性BALF浸潤(rùn)、IgE滴度以及細(xì)胞因子產(chǎn)生如上所述進(jìn)行測(cè)定。與對(duì)照和游離0VA/Derpl組比較，在LL-OVA/Derpl組中AHR、嗜酸性粒細(xì)胞性BALF浸潤(rùn)、IgE滴度顯著減少，并且IL-13、IL-4和IL-5顯著降低。
[0276]LL-OVA/Derpl經(jīng)由CD4+T細(xì)朐增強(qiáng)口服耐等件。
[0277]為了評(píng)估CD4T細(xì)胞是否介導(dǎo)口服耐受性的誘導(dǎo)，變應(yīng)原特異性增殖CD4T細(xì)胞應(yīng)答在脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中進(jìn)行研究。因此，小鼠如上所述(實(shí)驗(yàn)設(shè)置)進(jìn)行經(jīng)口飼喂，并且變應(yīng)原特異性CD4+T細(xì)胞增殖如細(xì)胞培養(yǎng)、增殖和細(xì)胞因子測(cè)定中所述進(jìn)行測(cè)定。與對(duì)照和游離0VA/Derpl組比較，LL-OVA/Derpl組中的變應(yīng)原特異性⑶4T細(xì)胞應(yīng)答顯著減少。
[0278]在LL-OVA處理后抗原誘導(dǎo)的T調(diào)節(jié)細(xì)胞可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)移保護(hù)避免哮喘樣應(yīng)答
[0279]為了在用口服耐受性方案處理的小鼠中測(cè)試哮喘樣應(yīng)答的有效抑制，如上所述(體內(nèi)T調(diào)節(jié)活性測(cè)定)過(guò)繼轉(zhuǎn)移來(lái)自不同處理組的脾細(xì)胞。與對(duì)照和游離OVA組比較，哮喘樣應(yīng)答在LL-OVA組中顯著減少，表明在我們的組合口服耐受性方案中調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞激活。
[0280]結(jié)論
[0281]我們的數(shù)據(jù)證實(shí)分泌變應(yīng)原的乳酸乳球菌的粘膜遞送比游離變應(yīng)原更有效地經(jīng)由誘導(dǎo)抗原特異性CD4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)變應(yīng)原特異性免疫耐受性，即使在建立的超敏性的背景中。
[0282]實(shí)施例E:在分泌所述變應(yīng)原的乳酸乳球菌的經(jīng)口施用后誘導(dǎo)對(duì)BLG食物變應(yīng)原的耐受性
[0283]前言
[0284]食物過(guò)敏是影響約2 % -5 %人口的疾病。在人類(lèi)中，升高的IgE抗體以及產(chǎn)生IL_4的、抗原特異性T淋巴細(xì)胞的存在暗示Th2傾斜(Th2-skeWed)機(jī)制。此處，證實(shí)食物變應(yīng)原通過(guò)乳酸乳球菌的經(jīng)口遞送經(jīng)由誘導(dǎo)抗原特異性CD4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞而抑制變應(yīng)原特異性免疫應(yīng)答。[0285]實(shí)施例的材料與方法
[0286]細(xì)菌和質(zhì)粒
[0287]乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至終使用。細(xì)菌在GM17培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述GM17培養(yǎng)基即補(bǔ)充有0.5%葡萄糖的M17 (Difco Laboratories, Detroit, MI)。所有菌株的貯備懸浮液于-20°C貯存于在GM17中的50%甘油中。對(duì)于胃內(nèi)接種，貯備懸浮液在新鮮GM17中稀釋200倍，并且于30°C進(jìn)行溫育。它們?cè)?6小時(shí)內(nèi)達(dá)到2xl09菌落形成單位(CFU) /ml的飽和密度。細(xì)菌通過(guò)離心進(jìn)行收獲并且在BM9培養(yǎng)基中進(jìn)行10倍濃縮。對(duì)于處理，每只小鼠通過(guò)胃內(nèi)導(dǎo)管每天接受100μ I這種懸浮液。
[0288]牛β -乳球蛋白cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，且與乳球菌屬Pl啟動(dòng)子下游的紅霉素抗性pTINX載體的Usp45分泌信號(hào)融合。
[0289]用攜帶鼠類(lèi)BLG的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363菌株命名為L(zhǎng)L-BLG。其為包含空載體pTINX的MG1363的LL-pTINX充當(dāng)對(duì)照。
[0290]牛β -乳球蛋白(BLG)的定量
[0291]來(lái)自L(fǎng)L-BLG的BLG使用內(nèi)部開(kāi)發(fā)的BLG特異性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行測(cè)定。
[0292]實(shí)驗(yàn)設(shè)置
[0293]用于研究乳酸乳球菌的保護(hù)效應(yīng)的食物過(guò)敏鼠類(lèi)模型是食物誘導(dǎo)的IgE型應(yīng)答的小鼠模型，如由 Frossard 等人(J Allergy Clin Immunol 113:958-964, 2004)描述的。小鼠接受LL-BLG或作為陰性對(duì)照的無(wú)關(guān)抗原(0VA)。作為耐受性誘導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照，小鼠接受在飲用水中的高劑量BLG，其在用BLG經(jīng)口攻擊后使小鼠免于過(guò)敏反應(yīng)(anaphylaxis)。
[0294]在預(yù)防背景中，產(chǎn)生BLG的經(jīng)改造的乳酸乳球菌細(xì)菌使用胃導(dǎo)管經(jīng)口施用于小鼠，使用不同的處理間隔和劑量。隨后，這些接受小鼠在霍亂毒素的存在下用純化的BLG抗原進(jìn)行經(jīng)口攻擊。使對(duì)照動(dòng)物暴露于用不表達(dá)BLG (但表達(dá)0VA)的對(duì)照載體改造的乳酸乳球菌。通過(guò)測(cè)量血清和糞便中的BLG特異性IgGl、IgG2a和IgE滴度，通過(guò)測(cè)定脾和PP中的抗體分泌細(xì)胞數(shù)目，通過(guò)分析MLN、PP和脾中的T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生，在胃內(nèi)抗原攻擊后分析過(guò)敏反應(yīng)，從而評(píng)估耐受性的誘導(dǎo)。[0295]為了評(píng)估針對(duì)BLG的免疫耐受性的誘導(dǎo)是否可以通過(guò)乳酸乳球菌增強(qiáng)，對(duì)小鼠施用 LL-BLG 或 I μ g 游離 BLG。
[0296]BLG的經(jīng)口致敏。
[0297]4-5周大的雌性C3H/He0uJ小鼠(Charles River)在第O、7、14和21天時(shí)通過(guò)用在 0.2mol/L NaHCO3 中的購(gòu)自 List Biological Laboratories 的 20mg BLG (Sigma)和IOug CTX胃內(nèi)管飼(gavage)進(jìn)行免疫。陽(yáng)性對(duì)照組(耐受的小鼠)隨意接受在其飲用水中的0.8mg/mL BLG，進(jìn)行4周。給予的蛋白質(zhì)總量(22.4mg)類(lèi)似于給予致敏小鼠的BLG總量。為了證實(shí)耐受操作也持久地激活外周以及粘膜免疫系統(tǒng)，耐受小鼠組在第28和42天時(shí)用吸附于Img alum的80 μ g ip BLG注射2次。
[0298]抗原攻擊
[0299]在第28天時(shí)，所有小鼠通過(guò)用在0.4mL0.2mol NaHC03中的IOOmg BLG胃內(nèi)管飼進(jìn)行攻擊。觀(guān)察到過(guò)敏反應(yīng)，并且通過(guò)使用其他地方詳細(xì)描述的(Frosssard等人,2001)反應(yīng)得分(0，無(wú)反應(yīng)，至3，嚴(yán)重反應(yīng)或死亡)進(jìn)行分級(jí)。核心體溫在攻擊前和管飼后30分鐘在耳處通過(guò)紅外線(xiàn)進(jìn)行測(cè)量。處死動(dòng)物，并且血液通過(guò)心臟穿刺收集到含EDTA的管內(nèi)，并且獲得血衆(zhòng)以用于通過(guò)商業(yè)ELISA試劑盒(Immunotech,MarseiIle,France)進(jìn)行的組胺測(cè)量。
[0300]細(xì)胞培養(yǎng)、增殖和細(xì)胞因子測(cè)定:
[0301]脾、腸系膜淋巴結(jié)和PP的單細(xì)胞懸浮液如由Frossard等人(2004)所述進(jìn)行制備。CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞分別使用CD4+T細(xì)胞分離試劑盒(MiItenyi Biotec，Germany )或 CD4+CD25+ 調(diào)節(jié) T 細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Germany)以及 MACS 柱(midiMACS ；Miltenyi Biotec)進(jìn)行富集。
[0302]對(duì)于大量脾細(xì)胞和LN群體的增殖測(cè)定，2xl05細(xì)胞在96孔U形底平板中在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基單獨(dú)或具有純化的BLG，并且含有或不含抗-1L-1O或抗TGF-β中和單克隆抗體。BLG以1-100 μ g/ml的濃度加入。中和抗體以1、
0.1和0.01 μ g/ml加入。對(duì)于⑶4+T細(xì)胞和⑶4+⑶25飛細(xì)胞群體的增殖測(cè)定，2xl05個(gè)⑶4+T細(xì)胞或⑶4+⑶25_T細(xì)胞在96孔U形底平板中與絲裂霉素處理的脾細(xì)胞一起，以⑶4+Τ細(xì)胞或⑶4+⑶25_Τ細(xì)胞/APC1/1、1/0.3、1/0.1、1/0.03、1/0的比例在含或不含中和抗體的總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)，所述脾細(xì)胞裝載有l(wèi)mg/ml BLG，充當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞。于37 °C在5% CO2加濕培養(yǎng)箱中72小時(shí)后，通過(guò)加入I μ Ci/孔[3H]-胸苷來(lái)評(píng)估增殖。在18小時(shí)后在玻璃纖維濾器墊(Perkin Elmer, Boston, USA)上收獲DNA結(jié)合的放射性活性，并且在閃爍計(jì)數(shù)器(Perkin Elmer)上測(cè)量胸苷摻入。
[0303]對(duì)于細(xì)胞因子測(cè)量，在培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后收集在不同增殖測(cè)定中使用的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，且于-80°C進(jìn)行冷凍直至執(zhí)行細(xì)胞因子分析。細(xì)胞因子產(chǎn)生使用MouseInflammation Cytometric Bead Assay (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)進(jìn)行定量。
[0304]體內(nèi)T調(diào)節(jié)活性測(cè)定
[0305] 為了測(cè)試抗體形成在小鼠中的有效抑制，將從不同實(shí)驗(yàn)乳酸乳球菌處理的組中分離的脾細(xì)胞、珠純化的⑶4+T細(xì)胞、⑶4+⑶25_或⑶4+⑶25+T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移給首次用于實(shí)驗(yàn)的C3H/He0uJ小鼠。未處理的小鼠用作對(duì)照。轉(zhuǎn)移細(xì)胞的數(shù)目對(duì)于整體脾細(xì)胞、亞群耗盡的脾細(xì)胞、或陽(yáng)性選擇的⑶4+細(xì)胞以及⑶4+CD25_和⑶4+⑶25+T細(xì)胞是107。如果牽涉TregJP么這些小鼠用BLG抗原的后續(xù)攻擊應(yīng)阻止針對(duì)BLG的體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和過(guò)敏反應(yīng)。
[0306]用于BLG特異性血清和糞便抗體的酶聯(lián)免疫測(cè)定。
[0307]在第0、7、14、21和28天時(shí)通過(guò)尾部采血獲得血清。同時(shí)獲得糞便，并且重懸浮于補(bǔ)充有 0.lmg/mL 的胃酶抑素(P印statin) 1:1000 (Fluka)的 PBS 加 I % FCS (Lifetechnologies)中。樣品進(jìn)行機(jī)械解聚，并且潤(rùn)旋2分鐘，隨后2次于4°C在14，OOOrpm下離心20分鐘。
[0308]血清和糞便通過(guò)從Adel-Patient等人(2000, J.1mmunol Methods)改良的方法就BLG特異性IgE、IgGl、IgG2a和/或IgA抗體水平進(jìn)行測(cè)定。簡(jiǎn)言之，MaxiSorp微量滴定板(Nunc)在室溫下用250ng/孔鏈霉抗生物素蛋白(Fluka)包被18小時(shí)，隨后用300 μ L聚乙烯吡咯烷酮K25(Fluka)溶液包被過(guò)夜。I微克生物素化的BLG溫育3小時(shí)，并且在0.5 μ g/mL山羊抗小鼠IgA、大鼠抗小鼠IgGl或抗小鼠IgG2a過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體(SouthernBiotechnologies)的存在下,一式兩份地加入在PBS加10%馬血清中的稀釋血清(1:6666和 1:2222 用于 IgGlU:666 和 1:222 用于 IgG2a、l:66 和 1:22 用于 IgE)或糞便(1:3、1:10和1:33)，溫育2小時(shí)。對(duì)于IgE測(cè)量，加入單克隆大鼠抗小鼠IgE Ab (克隆R35-72，BDPharmingen),隨后加入過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗大鼠Ab (Caltag)。光密度在490nm處進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果表示為任 意單位，且來(lái)自BLG加alum免疫的小鼠的混合血清用作參考血清。
[0309]抗原特異性抗體產(chǎn)生通過(guò)ELISP0T方法進(jìn)行測(cè)量。
[0310]淋巴集結(jié)(Peyer’s patches)機(jī)械地從腸切除，并且在補(bǔ)充有5mmol EDTA (LifeTechnologies)的HBSS培養(yǎng)基中溫育30分鐘。類(lèi)似地，將淋巴集結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)輕輕壓碎，并且通過(guò)70-μ m尼龍濾器進(jìn)行過(guò)濾。脾細(xì)胞在Tris緩沖的NH4Cl中預(yù)溫育5分鐘以去除紅細(xì)胞。淋巴母細(xì)胞在PercollGO1^ /66%梯度(Amersham)上進(jìn)行分離。
[0311]對(duì)于BLG特異性IgGU IgG2a和IgA抗體的測(cè)量，ELISP0T平板(Millipore)用鏈霉抗生物素蛋白于37°C包被過(guò)夜，隨后添加Iyg生物素化的BLG并溫育3小時(shí)。在Percoll60% /66 %梯度上分離的淋巴母細(xì)胞以2個(gè)不同濃度(I和2X106)重懸浮于Iscove's改良的Dulbecco’ s培養(yǎng)基中并于37°C溫育24小時(shí),所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有青霉素、鏈霉素、L-谷氨酰胺、慶大霉素、多粘菌素B和5% FCS，隨后與抗-1gA、抗-1gGl和抗-1gG2a抗體(Southern Biotechnology)—起于4°C溫育過(guò)夜。加入氨基乙基咔唑100 μ L/孔并溫育10分鐘，并且通過(guò)使用KS ELISP0T4.2.1Software (Zeiss)自動(dòng)計(jì)數(shù)斑點(diǎn)，且將其表示為細(xì)胞形成單位/IO6細(xì)胞(CFU)。
[0312]LL-BLG在食物過(guò)敏鼠類(lèi)模型中顯著增強(qiáng)BLG的耐受性誘導(dǎo)能力
[0313]為了研究口服耐受性的誘導(dǎo)，小鼠如上所述(實(shí)驗(yàn)設(shè)置)進(jìn)行經(jīng)口飼喂。LL-BLG的添加顯著增強(qiáng)針對(duì)BLG的耐受性誘導(dǎo)，因?yàn)榕c對(duì)照以及游離BLG組比較，脾細(xì)胞的變應(yīng)原特異性增殖應(yīng)答在LL-BLG組中顯著減少。
[0314]LL-BLG增強(qiáng)與響應(yīng)所述變應(yīng)原的減少的BLG特異性抗體應(yīng)答和降低的IL_4細(xì)胞因子產(chǎn)生相關(guān)的口服耐受性。
[0315]為了研究口服耐受性的誘導(dǎo)，小鼠如上所述(實(shí)驗(yàn)設(shè)置)進(jìn)行經(jīng)口飼喂。響應(yīng)所述因子的BLG特異性抗體應(yīng)答和細(xì)胞因子產(chǎn)生如上所述進(jìn)行測(cè)定。與對(duì)照和游離BLG組比較，BLG特異性抗體水平和IL-4在LL-BLG組中顯著減少。[0316]結(jié)果
[0317]LL-BLG經(jīng)由CD4+T細(xì)朐增強(qiáng)口服耐等件。
[0318]為了評(píng)估CD4T細(xì)胞是否介導(dǎo)口服耐受性的誘導(dǎo)，變應(yīng)原特異性增殖CD4T細(xì)胞應(yīng)答在脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中進(jìn)行研究。因此，小鼠如上所述(實(shí)驗(yàn)設(shè)置)進(jìn)行經(jīng)口飼喂，并且變應(yīng)原特異性CD4+T細(xì)胞增殖如細(xì)胞培養(yǎng)、增殖和細(xì)胞因子測(cè)定中所述進(jìn)行測(cè)定。與對(duì)照和游離BLG組比較，LL-BLG組中的變應(yīng)原特異性⑶4T細(xì)胞應(yīng)答顯著減少。
[0319]在LL-BLG處理后抗原誘導(dǎo)的T調(diào)節(jié)細(xì)胞可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)移保護(hù)避免過(guò)敏樣應(yīng)答
[0320]為了在用口服耐受性方案處理的小鼠中測(cè)試過(guò)敏樣應(yīng)答的有效抑制，如上所述(體內(nèi)T調(diào)節(jié)活性測(cè)定)過(guò)繼轉(zhuǎn)移來(lái)自不同處理組的脾細(xì)胞。與對(duì)照和游離BLG組比較，過(guò)敏樣應(yīng)答在LL-BLG組中顯著減少，表明在我們的組合口服耐受性方案中調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞激活。
[0321]結(jié)論
[0322]我們的數(shù)據(jù)證實(shí)分泌變應(yīng)原的乳酸乳球菌的粘膜遞送比游離變應(yīng)原更有效地經(jīng)由誘導(dǎo)抗原特異性CD4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)變應(yīng)原特異性免疫耐受性。
[0323]實(shí)施例F:在分泌所述自身抗原的乳酸乳球菌的經(jīng)口施用后誘導(dǎo)對(duì)胰島素的耐受性
[0324]前言
[0325]自身免疫的特征在于由對(duì)自體抗原的耐受性的喪失導(dǎo)致的自發(fā)性炎性組織損害和損傷的生理功能。它與部分過(guò)度活躍的免疫系統(tǒng)相關(guān)，所述免疫系統(tǒng)特征在于過(guò)量的T輔助(Th)細(xì)胞。誘病因素例如易感基因和環(huán)境因素難以影響，因此，開(kāi)發(fā)免疫治療的近期努力集中于重新建立病原性效應(yīng)細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞之間的功能平衡(通過(guò)耗盡前者和/或增強(qiáng)后者)。胰島β細(xì)胞的自身免疫破壞是I型糖尿病(TlD)的主因。這種破壞與針對(duì)幾種β細(xì)胞自身抗原的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答相關(guān)，這兩種應(yīng)答可以在疾病的臨床發(fā)作之前。
[0326]此處，證實(shí)自身抗原遞送乳酸乳球菌的經(jīng)口遞送經(jīng)由誘導(dǎo)抗原特異性⑶4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞而抑制糖尿病特異性免疫應(yīng)答。
[0327]材料與方法
[0328]細(xì)菌和質(zhì)粒
[0329]乳酸乳球菌菌株MG1363在本研究自始至終使用。細(xì)菌在GM17培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述GM17培養(yǎng)基即補(bǔ)充有0.5%葡萄糖的Μ17 (Difco Laboratories, Detroit, MI)。所有菌株的貯備懸浮液于-20°C貯存于在GM17中的50%甘油中。對(duì)于胃內(nèi)接種，貯備懸浮液在新鮮GM17中稀釋200倍，并且于30°C進(jìn)行溫育。它們?cè)?6小時(shí)內(nèi)達(dá)到2xl09菌落形成單位(CFU) /ml的飽和密度。細(xì)菌通過(guò)離心進(jìn)行收獲并且在BM9培養(yǎng)基中進(jìn)行10倍濃縮。對(duì)于處理，每只小鼠通過(guò)胃內(nèi)導(dǎo)管每天接受100μ I這種懸浮液。
[0330] 合成編碼人胰島素原II B24-C36肽(hpllp)、豬胰島素和免疫顯性肽InsB9_23(B9-23在許多物種包括人、大鼠和小鼠中基本上相同)的具有最佳乳酸乳球菌密碼子使用的DNA序列，進(jìn)行擴(kuò)增且將其與乳球菌屬Pl啟動(dòng)子下游的紅霉素抗性pTINX載體的Usp45分泌信號(hào)融合。
[0331]用攜帶鼠類(lèi)hpllp、胰島素、InsB9_23的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MG1363菌株命名為L(zhǎng)L_hpIIp、LL-胰島素、LL-1nsB9_23。其為包含空載體pTINX的MG1363的LL-pTINX充當(dāng)對(duì)照。這些蛋白質(zhì)的表達(dá)使用抗原特異性ELISA和蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行測(cè)定。
[0332]小鼠
[0333]非肥胖雌性和雄性糖尿病(NOD)小鼠和NOD嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID) (Balb/c背景)小鼠購(gòu)自Jackson實(shí)驗(yàn)室。Balb/c野生型(WT)小鼠購(gòu)自Charles River Italy。小鼠維持于特定無(wú)病原體中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中。小鼠依照機(jī)構(gòu)指導(dǎo)進(jìn)行處理和使用。
[0334]實(shí)驗(yàn)設(shè)置
[0335]在預(yù)防背景中，LL-hpIIp、LL_胰島素、LL-1nsB9_23從第21天大時(shí)(斷奶)開(kāi)始經(jīng)口施用于NOD小鼠，使用最佳飼喂方案或直至100天大時(shí)(此時(shí)大多數(shù)小鼠發(fā)展糖尿病)。此外，LL-pTINX作為陰性對(duì)照進(jìn)行經(jīng)口施用。對(duì)于陽(yáng)性(耐受)對(duì)照組，3周大的NOD小鼠用0.8mg人胰島素/hpIIp/InsB9_23進(jìn)行經(jīng)口處理,每周3次,進(jìn)行2或4周。糖尿病的發(fā)展通過(guò)每周3次連續(xù)監(jiān)控尿糖水平進(jìn)行測(cè)定，并且在糖尿的情況下監(jiān)控血糖水平。在12-23周時(shí)以及在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(35周)收集胰腺，并且連續(xù)切片用蘇木精/曙紅染色以對(duì)單核細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分，或通過(guò)免疫組織化學(xué)以分析T細(xì)胞浸潤(rùn)。
[0336]在治療背景中，LL-hpIIp、LL-膜島素、LL_InsB9_23經(jīng)口施用于顯不穩(wěn)定糖尿和聞血糖癥的糖尿病NOD雌性(12-23周)。此外，LL-pTINX作為陰性對(duì)照進(jìn)行經(jīng)口施用。對(duì)于陽(yáng)性(耐受)對(duì)照組，糖尿病NOD小鼠如Bresson等人2006中所述進(jìn)行處理。完全緩解定義為糖尿的消失和回復(fù)正常血糖。
[0337]在同基因島移植背景中，具有近期發(fā)作的糖尿病的雌性NOD小鼠用LL-hpIIp、LL-胰島素、LL-1nsB9_23或用作為陰性對(duì)照的LL-pTINX經(jīng)口處理3周。3周后，將來(lái)自非糖尿病NOD小鼠的500個(gè)新近分離的胰島移植給糖尿病NOD小鼠。血糖隨后每周監(jiān)控3次，直至糖尿病復(fù)發(fā)或直至移植后15周時(shí)。具有連續(xù)2次葡萄糖水平> 250mg/dL的動(dòng)物視為患有糖尿病，并且隨后將其處死用于血清收集和移植物的組織學(xué)分析。
[0338]耐受性誘導(dǎo)的精確機(jī)制在用特定自身抗原再攻擊NOD小鼠后通過(guò)將T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移到NOD-SCID小鼠內(nèi)在體外、在體內(nèi)進(jìn)行分析。
[0339]糖尿病的檢測(cè):
[0340]葡萄糖監(jiān)控:尿糖通過(guò)使用Diastix (Miles)進(jìn)行測(cè)量，并且通過(guò)血糖測(cè)量用血糖監(jiān)控系統(tǒng)OneTouch Ultra (LifeScan Inc.)加以證實(shí)。糖尿病定義為連續(xù)2次血糖值超過(guò) 250mg/dl。
[0341]胰島炎:通過(guò)CO2窒息殺死小鼠，并且胰腺在10%福爾馬林中固定過(guò)夜，在石蠟中進(jìn)行包埋，并且連續(xù)5μπι切片用蘇木精和曙紅進(jìn)行染色。胰島炎得分(平均值土SD)通過(guò)用顯微鏡將10-15個(gè)島/小鼠中的細(xì)胞浸潤(rùn)程度如下分級(jí)進(jìn)行測(cè)定:0，無(wú)可見(jiàn)的島浸潤(rùn)標(biāo)志；1，島周?chē)?rùn)；2,〈50%浸潤(rùn)；3, >50%浸潤(rùn)。
[0342]島分離和移植:通過(guò)在劇烈振蕩過(guò)程中用在Hanks’平衡鹽溶液中的膠原酶消化胰腺進(jìn)行無(wú)菌去除后分離無(wú)胰島炎和糖尿病的14-21天大的供體NOD小鼠的島。通過(guò)在立體顯微鏡下的直接人工挑選進(jìn)行島分離。糖尿病受體NOD小鼠通過(guò)腹膜內(nèi)注射阿佛丁(0.02ml/g BWT)進(jìn)行麻醉，經(jīng)由腰部切開(kāi)暴露左腎，并且在腎小囊下給予500個(gè)新近分離的
島O
[0343]免疫組織化學(xué)[0344]為了檢測(cè)在胰腺β細(xì)胞中的胰島素、⑶4和⑶8表達(dá)，將一抗(來(lái)自Dako的豚鼠抗豬胰島素[稀釋度1:300]、來(lái)自BD Biosciences的抗-CD4RM4.5和抗_CD8a IHC[稀釋度1:50])應(yīng)用于冷凍組織切片，如Christen等人,2004中所述。
[0345]體外增殖測(cè)定
[0346]制備脾、腸系膜LN(MLN)和PLN的單細(xì)胞懸浮液。對(duì)于總脾細(xì)胞群體的增殖測(cè)定，2xl05細(xì)胞在96孔U形底平板中在總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基單獨(dú)或具有分級(jí)濃度(1-100 μ g/ml)的純化的人胰島素、或?qū)τ冖?T細(xì)胞(InsB9_23, H-2dB8g限制的)或?qū)τ贑D8T細(xì)胞(InsB15_23，Kd限制的)特異的肽(Sigma)、并且含有或不含抗-1L-10或抗-TGF-β中和單克隆抗體。中和抗體以1、0.1和0.01 μ g/ml加入。對(duì)于總⑶3+T細(xì)胞、⑶8+T細(xì)胞、⑶4+T細(xì)胞和⑶4+⑶25-T細(xì)胞群體的增殖測(cè)定，0.2xl05個(gè)T細(xì)胞在96孔U形底平板中與來(lái)自WT Balb/c小鼠的IxlO5經(jīng)輻射的脾細(xì)胞一起，在含或不含中和抗體的總體積200 μ I的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述脾細(xì)胞裝載有胰島素或GAD65或者對(duì)于CD4+或⑶8+Τ細(xì)胞特異的肽。于37°C在5% CO2加濕培養(yǎng)箱中72小時(shí)后，通過(guò)加入I μ Ci/孔[3H]-胸苷來(lái)評(píng)估增殖。在16-18小時(shí)后在玻璃纖維濾器墊(Perkin Elmer, Boston, USA)上收獲DNA結(jié)合的放射性活性，并且在閃爍計(jì)數(shù)器(Perkin Elmer)上測(cè)量胸苷摻入。使用0)3+、0)4+或0)8+分離試劑盒(MACS ；Milteny Biotec, Auburn, CA),通過(guò)磁珠分離經(jīng)由陰性選擇從PLN或脾中純化T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞作為總細(xì)胞使用，或使用CD25+分離試劑盒(Milteny Biotec)通過(guò)MACS進(jìn)一步分離成CD25+和CD25'細(xì)胞群體的純度(>90% )通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)行測(cè)定。
[0347]對(duì)于細(xì)胞因子測(cè)量，在培養(yǎng)72小時(shí)后收集在如上所述的不同增殖測(cè)定(抗原特異性刺激)中使用的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，且于-80°C進(jìn)行冷凍直至執(zhí)行細(xì)胞因子分析。細(xì)胞因子產(chǎn)生使用 Mouse Infla mmation Cytometric Bead Assay (BD Biosciences, MountainView，CA，USA)進(jìn)行定量。純化的⑶3+T細(xì)胞、⑶4+Τ或⑶8+Τ細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并且用抗-⑶3/抗-CD28混合物(各I μ g/ml)在體外非特異性刺激24小時(shí)，或它們保持未刺激作為對(duì)照。收獲上清液，并且使用在 BD FACSArray Bioanalyzer 上的 BD? Cytometric Bead Arrayflex set 使用 FCAP 陣列軟件(BD Biosciences)就 IL-10、IL-4, IL-5 和 IFNy 產(chǎn)生進(jìn)行分析。捕獲ELISA實(shí)驗(yàn)使用Quantikine試劑盒(R&D Systems)進(jìn)行,用于測(cè)定TGF-β I。
[0348]體外T細(xì)胞增殖抑制測(cè)定
[0349]在來(lái)自WT Balb/c小鼠的T細(xì)胞耗盡的經(jīng)輻射的胰島素或肽裝載的2xl04脾細(xì)胞的存在下，從最近的糖尿病雌性NOD (8-12周)中分離的2xl04純化的總脾⑶4+CD25—T細(xì)胞與不同數(shù)目的CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25—T細(xì)胞群體進(jìn)行共培養(yǎng)，所述細(xì)胞群體從來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)組的脾、MLN或PLN中分離。于37°C在5% CO2加濕培養(yǎng)箱中72小時(shí)后，通過(guò)加入I μ Ci/孔[3H]-胸苷來(lái)評(píng)估增殖。在16-18小時(shí)后在玻璃纖維濾器墊(Perkin Elmer,Boston, USA)上收獲DNA結(jié)合的放射性活性，并且在閃爍計(jì)數(shù)器(Perkin Elmer)上測(cè)量胸苷摻入。
[0350]體外細(xì)胞毒性測(cè)定
[0351]所使用的淋巴母細(xì)胞靶是來(lái)自BALB/c小鼠的Con A-激活的脾細(xì)胞?？偣睮O6靶細(xì)胞用 100 μ Ci51Cr (Amersham International,Buckinghamshire,U.K)于 37°C標(biāo)記 90 分鐘，洗滌3次，隨后與I μ g/ml肽(InsB15_23或無(wú)關(guān)肽)于37°C溫育I小時(shí)。將靶細(xì)胞洗滌2次，并且以IO4細(xì)胞/孔進(jìn)行接種。以各種效應(yīng)物:靶(Ε:T)的比例向每個(gè)孔中一式三份地加入從脾、MLN和PLN中分離的⑶8+Τ細(xì)胞。平板在500rpm下離心2分鐘，并且于37°C溫育4小時(shí)。溫育后，收集上清液用于測(cè)定51Cr釋放[裂解％ =IOOx (測(cè)試cpm-自發(fā)cpm) /(總cpm-自發(fā)cpm)]。對(duì)于間接殺死測(cè)定,在與效應(yīng)物一起溫育前，⑶8+T細(xì)胞與5 μ g/ml抗-0)3 抗體(克隆 145-2C11, Pharmingen) 一起溫育。
[0352]糖尿病的過(guò)繼轉(zhuǎn)移
[0353]8-10周大的NOD-SCID小鼠用2xl07脾細(xì)胞進(jìn)行靜脈內(nèi)注射或用5xl06脾細(xì)胞進(jìn)行腹膜內(nèi)注射，所述脾細(xì)胞從糖尿病雌性NOD小鼠(6周、12周和18周)中分離，與或不與分級(jí)數(shù)目的從不同實(shí)驗(yàn)乳酸乳球菌處理的組中分離的珠純化的⑶3+T細(xì)胞、⑶8+T細(xì)胞、⑶4+T細(xì)胞、⑶4+CD25_或⑶4+⑶25+T細(xì)胞組合。未處理的小鼠用作對(duì)照。糖尿病的發(fā)展通過(guò)每周3次連續(xù)監(jiān)控血糖水平進(jìn)行測(cè)定。
[0354]結(jié)果
[0355]在同基因島移棺后，LL_hpIIp、LL-膜島素、LL_InsB?！?。，延遲糖尿病復(fù)發(fā)
[0356]為了評(píng)估LL-hpIIp、LL-膜島素和LL-1nsB (9-23)是否誘導(dǎo)口服耐受性，研究在同基因島移植后的糖尿病復(fù)發(fā)。因此，小鼠如上所述(實(shí)驗(yàn)設(shè)置)進(jìn)行經(jīng)口飼喂，并且如(島分離和移植)所述的移植胰島。與對(duì)照比較，糖尿病復(fù)發(fā)在LL-hpIIp/胰島素/InsB9_23組中延遲。
[0357]LL-hpIIp、LL_胰島素和LL_InsB9_23在非肥胖糖尿病小鼠中顯著增強(qiáng)游離hpllp、胰島素或InsB9_23的耐受性誘導(dǎo)能力
[0358]為了研究口服耐受性的誘導(dǎo)，小鼠如上所述(實(shí)驗(yàn)設(shè)置)進(jìn)行經(jīng)口飼喂。LL-hpIIp、LL-胰島素和LL-1nsB9_23的添加顯著增強(qiáng)針對(duì)自身抗原的耐受性誘導(dǎo)，因?yàn)榕c對(duì)照以及游離hpllp/胰島素/InsB9_23組比較，脾細(xì)胞的自身抗原特異性增殖應(yīng)答在LL-hpIIp/胰島素/InsB9^23組中顯著減少。
[0359]LL-hpIIp、LL-胰島素和LL_InsB9_23增強(qiáng)與減少的胰島炎、減少的β細(xì)胞破壞率和脾細(xì)胞增加的IL-10產(chǎn)生相關(guān)的口服耐受性。
[0360]為了研究口服耐受性的誘導(dǎo)，小鼠如上所述(實(shí)驗(yàn)設(shè)置)進(jìn)行經(jīng)口飼喂。響應(yīng)所述自身抗原的胰島炎的存在、β細(xì)胞破壞率和細(xì)胞因子產(chǎn)生如上所述進(jìn)行測(cè)定。組織學(xué)分析顯示與對(duì)照以及游離hpllp/胰島素/InsB9_23組比較,在LL-hpIIp/胰島素/InsB9_23組中顯著降低程度的胰島炎和β細(xì)胞破壞以及增加的IL-10產(chǎn)生。
[0361]LL-hpIIp、LL-胰島素和LL-1nsBg^經(jīng)由CD4+T細(xì)胞增強(qiáng)口服耐受性
[0362]為了評(píng)估CD4T細(xì)胞是否介導(dǎo)口服耐受性的誘導(dǎo)，自身抗原特異性增殖CD4T細(xì)胞應(yīng)答在脾細(xì)胞和淋巴結(jié)中進(jìn)行研究。因此，小鼠如上所述(實(shí)驗(yàn)設(shè)置)進(jìn)行經(jīng)口飼喂，并且自身抗原特異性CD4+T細(xì)胞增殖如所述的(體外增殖測(cè)定)進(jìn)行測(cè)定。與對(duì)照以及游離hpllp/胰島素/InsB9_23組比較，LL-hpIIp/胰島素/InsB9_23組中的自身抗原特異性CD4T細(xì)胞應(yīng)答。
[0363]實(shí)施例F5:在LL-1nsB，處理后，自身攻擊性CD8+應(yīng)答在NOD小鼠中被抑制
[0364] 為了檢查我們的組合方法是否誘導(dǎo)抑制性⑶4+T細(xì)胞，所述⑶4+T細(xì)胞能夠通過(guò)旁觀(guān)者抑制機(jī)制調(diào)節(jié)糖尿病，我們分析對(duì)CD8+自身攻擊性T細(xì)胞的作用?？乖禺愋宰陨砉粜寓?+細(xì)胞的百分比和/或活性在LL-1nsB9_23處理后強(qiáng)烈減少。[0365]在LL-1nsB^處理后抗原誘導(dǎo)的T調(diào)節(jié)細(xì)胞可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)移保護(hù)避免自身免疫樣歷
[0366]為了在用口服耐受性方案處理的小鼠中測(cè)試糖尿病樣應(yīng)答的有效抑制，如上所述(糖尿病的過(guò)繼轉(zhuǎn)移)過(guò)繼轉(zhuǎn)移來(lái)自不同處理組的脾細(xì)胞。與對(duì)照和游離InsB9_23組比較，糖尿病樣應(yīng)答在LL-1nsB9_23組中顯著減少，表明在我們的組合口服耐受性方案中調(diào)節(jié)⑶4+T細(xì)胞激活。
[0367]結(jié)論
[0368]證實(shí)自身抗原遞送乳酸乳球菌的經(jīng)口遞送經(jīng)由誘導(dǎo)抗原特異性⑶4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞來(lái)抑制糖尿病特異性免疫應(yīng)答。
[0369]討論
[0370]總的來(lái)說(shuō)，上文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明，即使在致敏受試者中，分泌抗原的遺傳修飾的乳酸乳球菌的經(jīng)口補(bǔ)充也可以減少由該抗原誘導(dǎo)的全身性炎癥。有利地，乳球菌屬介導(dǎo)的抑制通?？雌饋?lái)比游離抗原的粘膜施用后的抑制更有效。潛在地，該抑制可以通過(guò)誘導(dǎo)Foxp3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)。[0371]本申請(qǐng)涉及下述實(shí)施方案:
[0372]1.用于粘膜遞送以治療患者中的免疫應(yīng)答相關(guān)疾病的分泌抗原的微生物，其中所述免疫應(yīng)答相關(guān)疾病選自變應(yīng)性哮喘、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無(wú)力、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、食物過(guò)敏或乳糜瀉。
[0373]2.用于粘膜遞送以治療、預(yù)防和/或減輕患者中的免疫應(yīng)答相關(guān)疾病的組合物，所述免疫應(yīng)答相關(guān)疾病選自變應(yīng)性哮喘、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無(wú)力、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、食物過(guò)敏或乳糜瀉，所述組合物的特征在于其包含至少分泌抗原的微生物。
[0374]3.根據(jù)項(xiàng)目I使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2使用的組合物，其中所述微生物是乳酸細(xì)菌或酵母，更優(yōu)選是乳酸乳球菌(LL)。
[0375]4.根據(jù)項(xiàng)目I或3中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2或3中任一項(xiàng)使用的組合物，其中所述抗原組成型分泌。
[0376]5.根據(jù)項(xiàng)目1、3或4中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2、3或4中任一項(xiàng)使用的組合物，其中所述微生物每天進(jìn)行施用。
[0377]6.根據(jù)項(xiàng)目I或3-5中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2_5中任一項(xiàng)使用的組合物，其中所述抗原誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)。
[0378]7.根據(jù)項(xiàng)目6使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目6使用的組合物，其中所述Treg細(xì)胞是Foxp3+Treg細(xì)胞。
[0379]8.根據(jù)項(xiàng)目I或3-7中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2_7中任一項(xiàng)使用的組合物，其中所述抗原是免疫顯性的脫去酰胺基的抗原。
[0380]9.根據(jù)項(xiàng)目I或3-8中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2-8中任一項(xiàng)使用的組合物，其中所述抗原在HLA-DQ2或-DQ8的背景中被識(shí)別。
[0381]10.根據(jù)項(xiàng)目I或3-9中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2-9中任一項(xiàng)使用的組合物，其中所述抗原是α -麥醇溶蛋白或大麥醇溶蛋白。
[0382]11.根據(jù)項(xiàng)目10使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目10使用的組合物，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2、4、6或8，或由SEQ ID NO:2、4、6或8組成。
[0383]12.根據(jù)項(xiàng)目I或3-11中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2_11中任一項(xiàng)使用的組合物，其中所述抗原減少脾和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖。
[0384]13.根據(jù)項(xiàng)目I或3-12中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2_12中任一項(xiàng)使用的組合物，其中所述抗原抑制炎性抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。
[0385]14.根據(jù)項(xiàng)目I或3-13中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2_13中任一項(xiàng)使用的組合物，其中所述粘膜遞送選自直腸遞送、頰遞送、肺遞送、眼遞送、鼻遞送、陰道遞送和經(jīng)口遞送。
[0386]15.根據(jù)項(xiàng)目I或3-14中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2_14中任一項(xiàng)使用的組合物，其中遞送所述微生物至少I(mǎi)周、更優(yōu)選至少I(mǎi)個(gè)月或I年。
[0387]16.根據(jù)項(xiàng)目I或3-15中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2_15中任一項(xiàng)使用的組合物，其中所述微生物每天遞送至少I(mǎi)次，優(yōu)選每天2次。
[0388]17.根據(jù)項(xiàng)目I或3-16中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2_16中任一項(xiàng)使用的組合物，其中所述微生物以至少10毫微微克-1OOmg/天,例如IOOfg-1Omg/天、或 Ipg-1mg/ 天、或 IOpg-1OO μ g/ 天、或 IOOpg-1O μ g/ 天、或 Ing-1 μ g/ 天、或 IOng-1OOmg/天的劑量進(jìn)行遞送。
[0389]18.根據(jù)項(xiàng)目I或3-17中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2_17中任一項(xiàng)使用的組合物，其中所述微生物通過(guò)噴霧劑、膠囊、氣霧劑、錠劑、大丸劑、片劑、囊劑、液體、懸浮液、乳狀液或糖錠進(jìn)行施用。
[0390]19.根據(jù)項(xiàng)目I或3-18中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2_18中任一項(xiàng)使用的組合物，其中所述微生物或組合物配制為藥劑、醫(yī)學(xué)食物或營(yíng)養(yǎng)食品。
[0391]20.用于治療、預(yù)防和/或減輕患者中的免疫應(yīng)答相關(guān)疾病的方法，其包括粘膜遞送包含表達(dá)抗原的微生物的組合物，其中所述抗原被分泌，并且其中所述組合物每天進(jìn)行遞送。
[0392]21.根據(jù)項(xiàng)目20的方法，其中所述微生物是乳酸細(xì)菌或酵母，更優(yōu)選是乳酸乳球菌(LL)。
[0393]22.根據(jù)項(xiàng)目20或21中任一項(xiàng)的方法，其中所述疾病選自變應(yīng)性哮喘、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無(wú)力、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、食物過(guò)敏或乳糜瀉。
[0394]23.根據(jù)項(xiàng)目20-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述分泌是組成型的。
[0395]24.根據(jù)項(xiàng)目20-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)。
[0396]25.根據(jù)項(xiàng)目24的方法，其中所述Treg細(xì)胞是FoXp3+Treg細(xì)胞。
[0397]26.根據(jù)項(xiàng)目20-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原是免疫顯性的脫去酰胺基的抗原。
[0398]27.根據(jù)項(xiàng)目20-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原在HLA-DQ2或-DQ8的背景中被識(shí)別。
[0399]28.根據(jù)項(xiàng)目20-27中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原是α -麥醇溶蛋白或大麥醇溶蛋白。
[0400] 29.根據(jù)項(xiàng)目28的方法，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2、4、6或8，或由SEQ IDNO:2、4、6 或 8 組成。
[0401]30.根據(jù)項(xiàng)目20-29中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原減少脾和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖。
[0402]31.根據(jù)項(xiàng)目20-30中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原抑制炎性抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。
[0403]32.根據(jù)項(xiàng)目20-31中任一項(xiàng)的方法，其中所述粘膜遞送選自直腸遞送、頰遞送、肺遞送、眼遞送、鼻遞送、陰道遞送和經(jīng)口遞送。
[0404]33.根據(jù)項(xiàng)目20-32中任一項(xiàng)的方法，其中遞送所述微生物至少I(mǎi)周、更優(yōu)選至少I(mǎi)個(gè)月或I年。
[0405]34.根據(jù)項(xiàng)目20-33中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物每天遞送至少I(mǎi)次，優(yōu)選每天2次。
[0406]35.根據(jù)項(xiàng)目20-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物以至少10毫微微克-1OOmg/ 天,例如 IOOfg-1Omg/ 天、或 Ipg-1mg/ 天、或 IOpg-1OO μ g/ 天、或 IOOpg-1O μ g/天、或Ing-1 μ g/天、或IOng-1OOmg/天的劑量進(jìn)行遞送。
[0407]36.根據(jù)項(xiàng)目20-35中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物通過(guò)噴霧劑、膠囊、氣霧劑、錠劑、大丸劑、片劑、囊劑、液體、懸浮液、乳狀液或糖錠進(jìn)行施用。
[0408]37.包含微生物的組合物，其中所述微生物組成型分泌抗原，所述抗原涉及變應(yīng)性哮喘、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無(wú)力、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、食物過(guò)敏或乳糜瀉的誘導(dǎo)。
[0409]38.根據(jù)項(xiàng)目37的組合物，其中所述微生物是乳酸細(xì)菌或酵母，更優(yōu)選是乳酸乳球菌(LU。
[0410]39.根據(jù)項(xiàng)目37或38中任一項(xiàng)的組合物，其中所述微生物以至少10毫微微克-1OOmg,例如 100fg-10mg、或 lpg-lmg、或 IOpg-1OO μ g、或 IOOpg-1O μ g、或 Ing-1 μ g、或IOng-1OOmg的劑量存在。
[0411]40.產(chǎn)品，其包含項(xiàng)目37-39中任一項(xiàng)的組合物。
[0412]41.項(xiàng)目40的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品選自噴霧劑、膠囊、氣霧劑、錠劑、大丸劑、片劑、囊劑、液體、懸浮液、乳狀液或糖錠。
[0413]42.用于治療、預(yù)防和/或減輕涉及免疫應(yīng)答相關(guān)疾病的疾病或病癥的藥劑、醫(yī)學(xué)食物或營(yíng)養(yǎng)食品，其包含至少微生物，其中所述微生物組成型分泌抗原，所述抗原涉及變應(yīng)性哮喘、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性重癥肌無(wú)力、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、食物過(guò)敏或乳糜瀉的誘導(dǎo)。
[0414]43.根據(jù)項(xiàng)目42的藥劑、醫(yī)學(xué)食物或營(yíng)養(yǎng)食品，其中所述微生物是乳酸細(xì)菌或酵母，更優(yōu)選是乳酸乳球菌(LL)。
[0415]44.根據(jù)項(xiàng)目I或3-19中任一項(xiàng)使用的分泌抗原的微生物，或根據(jù)項(xiàng)目2_19中任一項(xiàng)使用的組合物，其中所述抗原被制備以在所述患者中持續(xù)存在。
[0416]參考文獻(xiàn)
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【權(quán)利要求】
1.用于粘膜遞送以治療、預(yù)防和/或減輕受試者中的過(guò)敏的分泌抗原的微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述過(guò)敏是變態(tài)反應(yīng)、變應(yīng)性哮喘或食物過(guò)敏。
3.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原涉及受試者中過(guò)敏的誘導(dǎo)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述微生物是乳酸細(xì)菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述微生物是乳酸乳球菌(LL)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6 使用的分泌抗原的微生物,其中所述Treg細(xì)胞是Foxp3+Treg細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原是Derpi或β_乳球蛋白(BLG)肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原減少脾和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖。
10.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述抗原抑制炎性抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。
11.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述粘膜遞送選自直腸遞送、頰遞送、肺遞送、眼遞送、鼻遞送、陰道遞送和經(jīng)口遞送。
12.根據(jù)權(quán)利要求1使用的分泌抗原的微生物，其中所述分泌是組成型的。
13.用于粘膜遞送以治療、預(yù)防和/或減輕受試者中的過(guò)敏的組合物，所述組合物的特征在于其包含至少分泌抗原的微生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述過(guò)敏是變態(tài)反應(yīng)、變應(yīng)性哮喘或食物過(guò)敏。
15.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述抗原涉及受試者中過(guò)敏的誘導(dǎo)。
16.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述微生物是乳酸細(xì)菌。
17.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述微生物是乳酸乳球菌(LL)。
18.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述抗原誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18使用的組合物,其中所述Treg細(xì)胞是Foxp3+Treg細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述抗原是Derpi或β-乳球蛋白(BLG)肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述抗原減少脾和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖。
22.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述抗原抑制炎性抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。
23.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述粘膜遞送選自直腸遞送、頰遞送、肺遞送、眼遞送、鼻遞送、陰道遞送和經(jīng)口遞送。
24.根據(jù)權(quán)利要求13使用的組合物，其中所述分泌是組成型的。
25.表達(dá)抗原的微生物在制備用于粘膜遞送以治療、預(yù)防和/或減輕過(guò)敏的組合物中的用途，其中所述抗原被分泌。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述過(guò)敏是變態(tài)反應(yīng)、變應(yīng)性哮喘或食物過(guò)敏。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述抗原涉及受試者中過(guò)敏的誘導(dǎo)。
28.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述微生物是乳酸細(xì)菌。
29.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述微生物是乳酸乳球菌(LL)。
30.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述抗原誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的用途,其中所述Treg細(xì)胞是Foxp3+Treg細(xì)胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述抗原是Derpi或β -乳球蛋白(BLG)肽。
33.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述抗原減少脾和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖。
34.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述抗原抑制炎性抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。
35.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述粘膜遞送選自直腸遞送、頰遞送、肺遞送、眼遞送、鼻遞送、陰道遞送和經(jīng)口遞送。
36.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述分泌是組成型的。
37.包含微生物的組合物，其中所述微生物組成型分泌抗原，所述抗原涉及過(guò)敏的誘導(dǎo)。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，其中所述過(guò)敏是變態(tài)反應(yīng)、變應(yīng)性哮喘或食物過(guò)敏。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，其中所述微生物是乳酸細(xì)菌。
40.根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，其中所述微生物是乳酸乳球菌(LL)。
41.根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，其中所述微生物以至少10飛克-1OOmg的劑量存在。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中所述微生物以IOOfg-1Omg/天的劑量存在。
43.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中所述微生物以Ipg-1mg/天的劑量存在。
44.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中所述微生物以IOpg-1OOμ g/天的劑量存在。
45.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中所述微生物以IOOpg-1Oyg/天的劑量存在。
46.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中所述微生物以Ing-1μ g/天的劑量存在。
47.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物,其中所述微生物以IOng-1OOmg/天的劑量存在。
48.權(quán)利要求37的組合物，其中所述組合物選自噴霧劑、膠囊、氣霧劑、錠劑、大丸劑、片劑、囊劑、液體、懸浮液、乳狀液或糖錠。
49.用于治療、預(yù)防和/或減輕過(guò)敏的藥劑，其包含至少乳酸細(xì)菌，其中所述乳酸細(xì)菌組成型分泌異源抗原，所述抗原涉及過(guò)敏的誘導(dǎo)。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的藥劑，其中所述過(guò)敏是變態(tài)反應(yīng)、變應(yīng)性哮喘或食物過(guò)敏。
51.根據(jù)權(quán)利要求49的藥劑，其中所述乳酸細(xì)菌是乳酸乳球菌(LL)。
52.用于治療、預(yù)防和/或減輕過(guò)敏的醫(yī)學(xué)食物，其包含至少乳酸細(xì)菌，其中所述乳酸細(xì)菌組成型分泌異源抗原，所述抗原涉及過(guò)敏的誘導(dǎo)。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的醫(yī)學(xué)食物，其中所述過(guò)敏是變態(tài)反應(yīng)、變應(yīng)性哮喘或食物過(guò)敏。
54.根據(jù)權(quán)利要求52的醫(yī)學(xué)食物，其中所述乳酸細(xì)菌是乳酸乳球菌(LL)。
55.用于治療、預(yù)防和/或減輕過(guò)敏的營(yíng)養(yǎng)食品，其包含至少乳酸細(xì)菌，其中所述乳酸細(xì)菌組成型分泌異源抗原，所述抗原涉及過(guò)敏的誘導(dǎo)。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的營(yíng)養(yǎng)食品，其中所述過(guò)敏是變態(tài)反應(yīng)、變應(yīng)性哮喘或食物過(guò)敏。
57.根據(jù)權(quán)利要求55的營(yíng)養(yǎng)食品，其中所述乳酸細(xì)菌是乳酸乳球菌(LL)。
【文檔編號(hào)】A61K39/35GK103933563SQ201410145481
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2007年1月25日
【發(fā)明者】P·羅迪爾斯, V·斯努克 申請(qǐng)人:阿克圖杰尼斯公司