系列鎮(zhèn)痛活性肽dkk及類似物的獲得方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其類似物與其獲得方法和作為鎮(zhèn)痛藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。所述鎮(zhèn)痛活性肽分別含有如下氨基酸序列：DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECKGFGAYYGYCWTWGLACW?CEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；DGYIRGSNGCKVSCLWGNDGCNKECRA?YGASYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；DGYIRGSNGCK?ISCLWGNEGCNKECIGFGAYYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCG?GKK。所述系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段，可利用基因工程技術(shù)表達(dá)獲得，獲得方法簡(jiǎn)單，獲得的產(chǎn)物具有很好的鎮(zhèn)痛活性。
【專利說明】系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及類似物的獲得方法和應(yīng)用
[0001]本申請(qǐng)是沈陽(yáng)藥科大學(xué)2010年3月9日申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮?01010120159.9，發(fā)明名稱為“系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其類似物的獲得方法和應(yīng)用”的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其類似物的獲得方法和作為鎮(zhèn)痛藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用，具體地說，本發(fā)明涉及系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段結(jié)構(gòu)及其獲得方法和作為鎮(zhèn)痛藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]疼痛是人類共有而又有較大個(gè)體差異性的一種不愉快的主觀感覺，它在軀體受到威脅時(shí)提供警報(bào)信號(hào)，是生命不可缺少的一種保護(hù)機(jī)制。專利名稱為蝎抗神經(jīng)興奮肽(發(fā)明專利號(hào):ZL00112016.6)的發(fā)明提供了一種蝎抗神經(jīng)興奮肽及其基因序列和作用為預(yù)防、治療神經(jīng)興奮性疾病(如癲癇、驚厥等)的藥物。Chun-Guang Wang等在文章中報(bào)道了抗癲癇月太結(jié)構(gòu)(Chun-Guang Wang, Xiao-Lin He, Feng Shao, Wei Liu, Min-Hua Ling, Da-Cheng Wangand Cheng—Wu Ch1.Molecular characterization of an ant1-epilepsy peptide from thescorpion Buthus martensi Karsch.Eur.J.Biochem.268, 2480-2485，2001)。上述專利和論文所涉及的多肽是 否具有鎮(zhèn)痛生物活性并沒有報(bào)道，因此，有必要針對(duì)其鎮(zhèn)痛生物活性進(jìn)行系統(tǒng)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是利用基因工程技術(shù)表達(dá)系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK，針對(duì)純化的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK，進(jìn)行其體內(nèi)鎮(zhèn)痛生物活性研究。
[0005]本發(fā)明的第二個(gè)目的是在證明系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK具有鎮(zhèn)痛生物活性的基礎(chǔ)上，利用基因工程技術(shù)獲得系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK的衍生物或類似物或活性片段，所獲得的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK的衍生物或類似物或活性片段仍具有鎮(zhèn)痛生物活性。
[0006]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供獲得系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段的方法，該方法包括:
[0007]1.分別構(gòu)建系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段所編碼DNA的重組表達(dá)載體；
[0008]2.用步驟I的重組載體分別轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；
[0009]3.在適合于表達(dá)系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段的條件下培養(yǎng)步驟2的被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；
[0010]4.收獲并純化所得到的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段。
[0011]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供含有如上限定的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段和一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上限定的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段在生產(chǎn)鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明提供了一種上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0014]本發(fā)明提供的上述表達(dá)產(chǎn)物分離純化可使用鹽析沉淀、超濾、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾等方法，從細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物及培養(yǎng)液中分離并純化所需的表達(dá)產(chǎn)物。在產(chǎn)物的分離和純化過程中，可使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印跡法(WESTERN)檢測(cè)產(chǎn)物的存在及相應(yīng)分子大小。
[0015]本發(fā)明還提供了系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用，具體地說包括鎮(zhèn)痛生物活性的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明首次進(jìn)行系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段的小鼠體內(nèi)鎮(zhèn)痛生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)。
[0017]本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有上述系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段和至少一種醫(yī)藥上可接受的惰性載體或賦形劑的藥物組合物。可按照制藥工業(yè)領(lǐng)域已知的基本原則和方法制備適于胃腸道外途徑給藥的藥物組合物(如參見Remington’ sPharmaceutical Science, 15th., Mack Publishing Company, 1980)。可通過各種給藥途徑，特別是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、腹腔內(nèi)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、皮下等胃腸道外途徑投用本發(fā)明的藥物組合物。
[0018]可使用本發(fā)明的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段或含有該系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段的藥物組合物作為治療劑，用于治療特定類型人體的各種疼痛相關(guān)疾病。本發(fā)明的藥物組合物的治療有效劑量一般應(yīng)根據(jù)疾病的性質(zhì)、嚴(yán)重程度及對(duì)藥物的敏感適應(yīng)性，以及給藥途徑等諸多因素由臨床醫(yī)生按照個(gè)體化原則來確定。
[0019]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。
[0020]本發(fā)明的系列鎮(zhèn)痛活性肽及DKK及其衍生物或類似物或活性片段獲得方法簡(jiǎn)單，獲得的產(chǎn)物具有較好的鎮(zhèn)痛活性。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍。
[0022]實(shí)施例1:
[0023]鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1的獲得
[0024]1.鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0025]本實(shí)施例列舉描述用于表達(dá)本發(fā)明鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1的重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建策略和基本方法。
[0026]根據(jù)鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1 (— 級(jí)結(jié)構(gòu):DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECKGFGAYYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK)的氨基酸序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)寡核苷酸引物I和引物2，同時(shí)在上述兩個(gè)寡核苷酸引物的5'端，分別加上限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和BamH I水解位點(diǎn)序列。以已經(jīng)構(gòu)建含有DKK-1基因的質(zhì)粒為模板，利用上述引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物并進(jìn)行核酸片段的凝膠回收，經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和BamH I雙酶切后，與同樣進(jìn)行雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒在T4DNA Iigase的作用下進(jìn)行重組連接，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，經(jīng)過菌落PCR和限制性核酸內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后進(jìn)行DNA序列測(cè)定。結(jié)果表明，通過上述基因工程的方法構(gòu)建獲得鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1表達(dá)質(zhì)粒。
[0027]2.鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1的獲得
[0028]將上述鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1表達(dá)質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 ( λ DE3)，然后從該LB固體平板上挑取單菌落后接種至3ml LB (含卡那抗生素,50 μ g/ml),于37°C, 200r/min振蕩過夜培養(yǎng)。按照1%接種量將過夜培養(yǎng)物接種至400ml含相應(yīng)抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0.6-0.8，加入終濃度為0.166mmol/L的誘導(dǎo)物異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，培養(yǎng)4h。結(jié)束發(fā)酵，3000g，4°C離心20min，收集菌體。用40ml裂解緩沖液(0.1M PBS, 0.15M NaCl, 50mM咪唑)重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，超聲結(jié)束后于12，000g，4°C離心20min，得上清液，所得沉淀按照上述步驟重復(fù)破碎一次，合并兩次上清液，上樣于0.1MPBS(PH8.0)預(yù)先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經(jīng)過兩個(gè)不同階段的PH緩沖液分別充分洗滌5個(gè)柱床體積后，使用0.5M咪唑(pH9.0)進(jìn)行洗脫并收獲洗脫液。所得產(chǎn)物經(jīng)過15%SDS-PAGE驗(yàn)證純度。該重組表達(dá)質(zhì)粒編碼表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征為:MHHHHHHM DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECKGFGAYYGYCffTWGLACffCEGLPDDKTffKSESNTCGGKKo上述獲得的表達(dá)產(chǎn)物，利用化學(xué)法在M處斷裂肽鏈，從而獲得鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1，結(jié)構(gòu)特征為:DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECKGFGAYYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSES NTCGGKK。
[0029]實(shí)施例2: [0030]鎮(zhèn)痛活性肽DKK-2的獲得
[0031]本實(shí)施例獲得鎮(zhèn)痛活性肽DKK-2的策略和基本方法，類同實(shí)施例1的策略和基本方法。
[0032]鎮(zhèn)痛活性肽DKK-2 的結(jié)構(gòu)特征為:DGYIRGSNGCKVSCLWGNDGCNKECRAYGASYGYCffTffGLACffCEGLPDDKTffKSESNTCGGKK。
[0033]實(shí)施例3:
[0034]鎮(zhèn)痛活性肽DKK-3的獲得
[0035]本實(shí)施例獲得鎮(zhèn)痛活性肽DKK-3的策略和基本方法，類同實(shí)施例1的策略和基本方法。
[0036]鎮(zhèn)痛活性肽DKK-3 的結(jié)構(gòu)特征為:DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECIGFGAYYGYCffTffGLACffCEGLPDDKTffKSESNTCGGKK。
[0037]實(shí)施例4:
[0038]鎮(zhèn)痛活性肽DKK-4的獲得
[0039]本實(shí)施例獲得鎮(zhèn)痛活性肽DKK-4的策略和基本方法，類同實(shí)施例1的策略和基本方法。
[0040]鎮(zhèn)痛活性肽DKK-4 的結(jié)構(gòu)特征為:DGYIRGSNGCKVSCLLGNEGCNKECRAYGASYGYCffTffKLACffCQGLPDDKTffKSESNTCGGKK。
[0041]實(shí)施例5:[0042]系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK類似物的獲得
[0043]本實(shí)施例獲得系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK類似物的策略和基本方法，類同實(shí)施例1的策略和基本方法。系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK的類似物結(jié)構(gòu)包括:
[0044]
【權(quán)利要求】
1.系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，其特征在于， 所述的鎮(zhèn)痛活性肽DKK的序列為:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物利用基因工程技術(shù)表達(dá)獲得，其表達(dá)宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，其方法包括: 分別構(gòu)建系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物所編碼DNA的重組表達(dá)載 體； (2)用步驟I的重組載體分別轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞； (3)在適合于表達(dá)系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段的 條件下培養(yǎng)步驟2的被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞； (4)收獲并純化所得到的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK 及其衍生物利用化學(xué)合成技術(shù)獲得，化學(xué)合成為人工合成或合成儀合成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK 及其衍生物與藥學(xué)上可接受的載體混合制備臨床上可接受的注射劑、口服制劑、透皮吸收制劑、粘膜吸收制劑。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK103990110SQ201410145558
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2010年3月9日 優(yōu)先權(quán)日:2010年3月9日
【發(fā)明者】張景海, 宋永波, 吳春福 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)