柴胡皂苷a防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了柴胡皂苷a防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用，柴胡皂苷a對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無毒性作用，不影響細(xì)胞增殖；對過氧化氫造成的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡具有保護(hù)作用；并且在其分化過程中改善H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)；對H2O2造成的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化抑制具有保護(hù)作用；對H2O2造成的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化增強(qiáng)具有抑制作用；可以抑制骨吸收因子的表達(dá)，從而通過改善人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡和分化抑制及間接抑制破骨細(xì)胞活化來對骨質(zhì)疏松起保護(hù)作用。在去勢小鼠骨松模型中，柴胡皂苷a可以改善血清中的氧化應(yīng)激狀態(tài)，改善股骨遠(yuǎn)端和第四腰椎的松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)。因此，柴胡皂苷a能夠用于制備防治骨質(zhì)疏松的藥物。
【專利說明】柴胡皂苷a防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于骨質(zhì)疏松的防治【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及柴胡皂苷a防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，0P)是由多種病因?qū)е碌墓墙M織骨量丟失、骨微結(jié)構(gòu)惡化和生物力學(xué)性能減退的一種全身性、退行性、代謝性骨骼疾病，導(dǎo)致骨脆性增加，容易發(fā)生骨折，嚴(yán)重威脅著中老年人的身心健康。
[0003]氧化應(yīng)激(oxidative stress)是機(jī)體內(nèi)高活性物質(zhì)如ROS (Reactive oxygenspecies)產(chǎn)生過多，超出了機(jī)體的清除能力，導(dǎo)致氧化和抗氧化失衡的一種狀態(tài)。生理范圍內(nèi)的ROS在調(diào)節(jié)人體正常的功能如細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起著重要的作用。然而，高濃度的ROS可以導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)產(chǎn)生氧化反應(yīng)，損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，弓丨起疾病的發(fā)生。
[0004]近年來，研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中起重要作用。過量氧自由基(ROS)的產(chǎn)生可以抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)成骨分化，造成MSCs和成骨細(xì)胞(OB)凋亡，促進(jìn)破骨細(xì)胞(OC)活化和功能增強(qiáng)，導(dǎo)致骨吸收和骨形成失衡，引起骨微結(jié)構(gòu)改變和骨量降低。
[0005]柴胡是一種具有高度生物活性的藥用植物，廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)中藥中。柴胡皂苷是其主要活性成分，柴胡的大部分功效是通過柴胡皂苷發(fā)揮的。柴胡皂苷a (SSa)是包含在其中的最大量皂苷成分之一，具有多項(xiàng)生理功能:抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗過敏、抗癌等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明解決的問題在于提供柴胡皂苷a防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用，柴胡皂苷a可應(yīng)用于防治骨質(zhì)疏松的藥物的制備。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0008]柴胡皂苷a在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
[0009]含柴胡皂苷a的植物提取物在防治骨質(zhì)疏松藥物的制備中的應(yīng)用。
[0010]柴胡皂苷a在制備改善人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)藥物的制備中的應(yīng)用。
[0011]柴胡皂苷a在制備抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。
[0012]柴胡皂苷a在制備抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化抑制的制備中的應(yīng)用。
[0013]柴胡皂苷a在制備提高人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中ALP活性藥物中的應(yīng)用。
[0014]柴胡皂苷a在制備提高人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中促成骨分化基因ALP、C0L-1、0CN及OPN表達(dá)水平的藥物中的應(yīng)用。
[0015]柴胡皂苷a在制備提高人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中抑制RANKL和IL_6水平的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0017]柴胡皂苷a對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSC)無毒性作用、對過氧化氫(H2O2)造成的hBMSC的凋亡具有保護(hù)作用；并且可以改善H2O2造成的氧化應(yīng)激狀態(tài)；對H2O2造成的hBMSC成骨分化抑制具有保護(hù)作用；對11202造成的hBMSC成脂分化增強(qiáng)具有抑制作用；可以抑制骨吸收因子的表達(dá)。在去勢小鼠模型中，柴胡皂苷a可以改善血清中的氧化應(yīng)激狀態(tài)，改善股骨遠(yuǎn)端和第四腰椎的松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)。
[0018]hBMSC細(xì)胞是研究早期成骨前體細(xì)胞生長、分化的較常用的細(xì)胞模型，鑒于柴胡皂苷a對hBMSC具有保護(hù)作用，促進(jìn)骨形成，并通過抑制骨吸收因子來抑制破骨細(xì)胞的活化，降低骨吸收，最終起到防治骨質(zhì)疏松的作用。卵巢切除小鼠模型為常用的絕經(jīng)后骨松模型，通過連續(xù)腹腔注射給與不同劑量柴胡皂苷a，明顯改善了血清氧化應(yīng)激狀態(tài)，對松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用，表明其能夠發(fā)揮預(yù)防及治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用。
[0019]柴胡皂苷a為我國傳統(tǒng)中藥柴胡的有效提取物之一，為純天然提取物，用藥較安全，毒副作用小。
[0020]因此，柴胡皂苷a可應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的防治，尤其是在防治骨質(zhì)疏松藥物的制備中的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】[0021]圖1-1為不同濃度柴胡皂苷a對細(xì)胞增殖作用的影響。
[0022]圖1-2為柴胡皂苷a對H2O2造成細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。
[0023]圖2為柴胡皂苷a可以改善細(xì)胞氧化應(yīng)激ROS水平的檢測結(jié)果。
[0024]圖3-1為柴胡皂苷a在H2O2作用后，對細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性的作用。
[0025]圖3-2為柴胡皂苷a在H2O2作用后，對細(xì)胞基質(zhì)鈣鹽沉積的作用。
[0026]圖3-3-1~圖3-3-4為柴胡皂苷a在H2O2作用后，對4種成骨分化基因表達(dá)水平的影響。
[0027]圖4-1為在H2O2作用后，柴胡皂苷a對細(xì)胞脂質(zhì)生成的作用。
[0028]圖4-2為在H2O2作用后，柴胡皂苷a對成脂分化基因PPAR Y 2表達(dá)水平的影響。
[0029]圖5為柴胡皂苷a在H2O2作用后，對2種骨吸收因子RANKL和IL_6表達(dá)的影響。
[0030]圖6-1A和圖6-1B為柴胡皂苷a可以改善小鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA和GSH水平的檢測結(jié)果。
[0031]圖6-2為柴胡皂苷a可以改善OVX小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)的Micro-CT結(jié)
果O
[0032]圖6-3為柴胡皂苷a可以改善OVX小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)的VG染色結(jié)果。【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合具體的實(shí)施方案對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0034]hBMSC為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化潛能，比如分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，是研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長、分化的較常用的細(xì)胞模型，H2O2處理也是較常用的體外氧化應(yīng)激模型，出于觀察柴胡皂苷a對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡和分化的影響，及其抗氧化損傷的作用，所以選擇hBMSC作為細(xì)胞模型，H2O2處理為體外氧化應(yīng)激模型。卵巢切除(去勢)小鼠模型作為動(dòng)物模型，是常用的模擬婦女絕經(jīng)后骨松的模型。[0035]1、柴胡皂苷a對氧化應(yīng)激導(dǎo)致hBMSC凋亡的保護(hù)作用
[0036]1.1單純柴胡皂苷a對細(xì)胞的毒性作用
[0037]將hBMSC細(xì)胞以2 X IO3接種到96孔板上，待細(xì)胞長滿后，棄掉培養(yǎng)基，加含不同濃度0、0.1、1、10 μ M柴胡皂苷a的無血清培養(yǎng)基至孔板中，培養(yǎng)24h、48h和72h，觀察柴胡皂苷a對細(xì)胞增殖作用的影響。在觀察點(diǎn)，利用MTT法對細(xì)胞活性進(jìn)行檢測。
[0038]結(jié)果如圖1-1所示，橫坐標(biāo)為不同濃度的柴胡皂苷a作用時(shí)間，該圖的縱坐標(biāo)為吸光度OD值，以各組的OD值同空白對照組的OD值進(jìn)行比較的百分?jǐn)?shù)來表述。由圖可見，不同濃度的柴胡皂苷a在觀察時(shí)間內(nèi)，對細(xì)胞的增殖并無明顯影響。
[0039]1.2柴胡皂苷a對氧化應(yīng)激導(dǎo)致hBMSC凋亡的保護(hù)作用
[0040]分組情況:空白對照組；單純H2O2 處理組;0.I μ M SSa+H202; I μ M SSa+H202; 10 μ MSSa+H202。
[0041]將hBMSC細(xì)胞以2 X IO3接種到96孔板上，待細(xì)胞長滿后，棄掉培養(yǎng)基，加含不同濃度0、0.1、1、10 μ M柴胡皂苷a的無血清培養(yǎng)基至孔板中，培養(yǎng)24h，加入H2O2 (300 μ M),再培養(yǎng)24h，利用MTT法進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。
[0042]結(jié)果如圖1-2所示，橫坐標(biāo)為各組的作用方式，縱坐標(biāo)為吸光度OD值，以各組的OD值同空白對照組的OD值進(jìn)行比較的百分?jǐn)?shù)來表述。由圖可見，單純H2O2作用后，細(xì)胞活性降低，經(jīng)不同濃度柴胡皂苷a作用后細(xì)胞活性增加，同單純H2O2作用組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖中的#號表示:同對照組相比，#P〈0.05，##P〈0.01;圖中的*號表示:同單純H2O2作用組相比，*P < 0.05, #P < 0.01。這表明用柴胡皂苷a處理后能夠保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的hBMSC的凋亡。
[0043]綜上所述，經(jīng)柴胡皂苷a對hBMSC細(xì)胞作用，不同濃度柴胡皂苷a對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，然后施加H2O2干預(yù)，通過MTT檢測細(xì)胞活性，結(jié)果表明單純H2O2作用可以導(dǎo)致細(xì)胞活性降低，造成細(xì)胞凋亡，而0.1、1、10μΜ柴胡皂苷a預(yù)處理，對這種損傷具有保護(hù)作用。因此，柴胡皂苷a對H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。
[0044]2、柴胡皂苷a抗氧化作用檢測
[0045]hBMSC細(xì)胞鋪滿后，在柴胡皂苷a和/或H2O2作用下，處理方法同上，進(jìn)行氧化應(yīng)激相關(guān)檢測。
[0046]根據(jù)ROS檢測試劑盒，利用熒光探針DCFH-DA對細(xì)胞內(nèi)的活性氧進(jìn)行檢測。細(xì)胞爬片，0.1、1、10 μ M柴胡皂苷a預(yù)處理24h，300 μ M H2O2作用24h，然后進(jìn)行原位裝載探針，加入IOyM DCFH-DA,孵育20min，用無血清的培養(yǎng)液洗3次，去除未結(jié)合的探針，利用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。
[0047]結(jié)果如圖2所示，橫坐標(biāo)為各組的作用方式，縱坐標(biāo)為吸光度OD值的百分率，以各組的OD值同空白對照組的OD值進(jìn)行比較的百分?jǐn)?shù)來表述。由圖可見，單純H2O2處理后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平升高很明顯，而0.1、1、10μΜ柴胡皂苷a預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平降低。因此，柴胡皂苷a可以改善hBMSC氧化應(yīng)激ROS水平。
[0048]3、柴胡皂苷a對氧化應(yīng)激造成hBMSC成骨分化抑制的保護(hù)作用
[0049]柴胡皂苷a對氧化應(yīng)激造成hBMSC成骨分化抑制的保護(hù)作用:實(shí)驗(yàn)分組同上，將細(xì)胞鋪于6孔板上,鋪滿后,加入地塞米松0.1uM, IOmM甘油磷酸鈉,50ug/ml抗壞血酸進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。14天后，給予0.1、1、10 μ M柴胡皂苷a預(yù)處理24h，然后加入300 μ M H2O2處理 24h。
[0050]3.1根據(jù)堿性磷酸酶定量試劑盒(上海杰美)進(jìn)行ALP定量，收集細(xì)胞，裂解后，提取蛋白。測定蛋白濃度，然后根據(jù)試劑盒的說明，進(jìn)行ALP定量檢測。
[0051]結(jié)果如圖3-1所示，橫坐標(biāo)為各組的作用方式，縱坐標(biāo)為吸光度OD值的百分率，以各組的OD值同空白對照組的OD值進(jìn)行比較的百分?jǐn)?shù)來表述。單純H2O2作用后，細(xì)胞ALP活性表達(dá)同空白對照組相比顯著下降，柴胡皂苷a作用后，ALP活性表達(dá)升高，同單純H2O2作用組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ALP為成骨及其前體細(xì)胞分化中期的關(guān)鍵表達(dá)蛋白，為檢測成骨及其前體細(xì)胞分化的特異性指標(biāo)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致ALP活性降低，對成骨及其前體細(xì)胞分化為抑制作用，但經(jīng)柴胡皂苷a作用后，ALP表達(dá)增加，改善了氧化應(yīng)激對hBMSC成骨分化的抑制作用。
[0052]3.2鈣化結(jié)節(jié)染色:用PBS沖洗培養(yǎng)細(xì)胞，多聚甲醛固定后，1%茜素紅染色30分鐘，用水沖洗5次，倒置顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)沉積。
[0053]結(jié)果如圖3-2所示，單純H2O2作用后鈣化結(jié)節(jié)形成較少，但是柴胡皂苷a預(yù)處理后，結(jié)節(jié)面積有增加。鈣結(jié)節(jié)形成為成骨及其前體細(xì)胞分化的礦化階段，氧化應(yīng)激可以抑制成骨及其前體細(xì)胞分化，而柴胡皂苷a可以通過改善氧化應(yīng)激來改善hBMSC成骨分化。
[0054]3.3成骨基因的RT-PCR檢測:實(shí)驗(yàn)分組同上，將細(xì)胞鋪于6孔板上，鋪滿后，加入
0.1uM地塞米松，IOmM甘油磷酸鈉，50ug/ml抗壞血酸進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。14天后,給予0.1、
1、10μ M柴胡皂苷a預(yù)處理24h，然后加入300 μ M H2O2處理24h。用Trizol裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)的mRNA，根據(jù)實(shí)時(shí)定量RT-PCR的程序，對目的基因ALP、C0L_1、0CN及OPN進(jìn)行定量檢測。
[0055]結(jié)果如圖3-3-1~3-3-4所不，由圖可見，H2O2作用后，細(xì)胞成骨分化基因ALP、COL-1, OCN及OPN表達(dá)水平下降，柴胡皂苷a作用后，可以顯著促進(jìn)成骨基因表達(dá)。ALP、COL-1, OCN及OPN基因分別為成骨及其前體細(xì)胞分化中期和后期的關(guān)鍵基因，決定著細(xì)胞的分化水平。H2O2抑制成骨及其前體細(xì)胞成骨分化基因的表達(dá)，而柴胡皂苷a作用后，成骨分化基因表達(dá)有上調(diào)，說明柴胡皂苷a可以改善H2O2導(dǎo)致的hBMSC成骨分化抑制。
[0056]4、柴胡皂苷a對氧化應(yīng)激造成的hBMSC成脂增強(qiáng)的抑制作用
[0057]4.1油紅O檢測脂質(zhì)的生成:成脂誘導(dǎo)14天后，細(xì)胞經(jīng)柴胡皂苷a和/或H2O2處理2天，用PBS沖洗細(xì)胞，3.7%甲醛固定20分鐘，再用油紅O液體染色I(xiàn)小時(shí)。
[0058]結(jié)果如圖4-1所示，單純H2O2作用后脂滴形成較多，但是柴胡皂苷a預(yù)處理后，月旨滴生成明顯減少。脂質(zhì)生成為向成脂分化的標(biāo)志，氧化應(yīng)激可以促進(jìn)成脂分化，而柴胡皂苷a可以通過改善氧化應(yīng)激來抑制hBMSC成脂分化。
[0059]4.2成脂基因的RT-PCR檢測:實(shí)驗(yàn)分組同上，將細(xì)胞鋪于6孔板上，鋪滿后，再成脂誘導(dǎo)14天，之后給予0.1、1、10 μ M柴胡皂苷a預(yù)處理24h，然后加入300 μ M H2O2處理24h。用Trizol裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)的mRNA，根據(jù)實(shí)時(shí)定量RT-PCR的程序，對目的基因PPAR Y 2進(jìn)行定量檢測。
[0060]結(jié)果如圖4-2所示，由圖可見，H2O2作用后，細(xì)胞成脂分化基因PPAR Y 2表達(dá)水平升高，柴胡皂苷a作用后，可以顯著抑制成脂基因的表達(dá)。PPAR Y 2為成脂及其前體細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因，一定程度上決定著細(xì)胞的分化水平。H2O2促進(jìn)成脂分化基因的表達(dá)，而柴胡皂苷a作用后，成脂分化基因表達(dá)下調(diào)，說明柴胡皂苷a可以抑制H2O2導(dǎo)致的hBMSC成脂分化。
[0061]5、柴胡皂苷a對骨吸收因子的表達(dá)影響
[0062]柴胡皂苷a對氧化應(yīng)激刺激骨吸收因子增加的抑制作用:分組同上，將細(xì)胞鋪于6孔板上，鋪滿后，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，14天后，給予柴胡皂苷a處理，然后加入H2O2,裂解細(xì)胞，提取蛋白，測定蛋白濃度，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA法)檢測RANKL和IL-6的表達(dá)情況。
[0063]結(jié)果如圖5所示，H2O2作用后，細(xì)胞表達(dá)的RANKL和IL-6水平增加，柴胡皂苷a預(yù)處理可以抑制骨吸收因子的表達(dá)。RANKL和IL-6為成骨及其前體細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可以活化破骨細(xì)胞，進(jìn)而引起骨吸收增強(qiáng)，導(dǎo)致骨量降低，因此，柴胡皂苷a可以通過抑制RANKL和IL-6的表達(dá)，來抑制破骨細(xì)胞的活化，進(jìn)而減少骨量的丟失。
[0064]綜合以上表明:柴胡皂苷a對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無毒性作用，不影響細(xì)胞增殖；對H2O2造成的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡具有保護(hù)作用；并且在其分化過程中改善H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)；對11202造成的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化抑制具有保護(hù)作用；對H2O2造成的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化增強(qiáng)具有抑制作用；可以抑制骨吸收因子的表達(dá)，從而通過改善人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡和分化抑制間接抑制破骨細(xì)胞活化來對骨質(zhì)疏松起保護(hù)作用。
[0065]6.動(dòng)物骨松模型的建立
[0066]50只8周大BALB/c雌性小鼠，體重為20_22g。本實(shí)驗(yàn)中5組小鼠的初始體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在切除卵巢前，先將它們置于實(shí)驗(yàn)室條件下I周(即通氣良好的20°C恒溫環(huán)境中，每12小時(shí)光照與黑暗交替，水糧足量，自由取用)。適應(yīng)I周后，用戊巴比妥鈉(50mg/kg體重)進(jìn)行麻醉，小鼠被切除卵巢(去勢，n=40)或者假手術(shù)(n=10)。卵巢切除是通過背側(cè)入路切除雙側(cè)卵巢。假手術(shù)意味著手術(shù)找到雙側(cè)卵巢，但不切除，直接縫合關(guān)閉切口。小鼠被隨機(jī)分為5組:不處理組(假手術(shù)對照組)；不處理組(單純卵巢切除組)；低劑量SSa給藥組(卵巢切除后每日通過腹腔注射給予lmg/kg體重的SSa溶液)；中劑量SSa給藥組(卵巢切除后每日通過腹腔注射給予5mg/kg體重的SSa溶液);高劑量SSa給藥組(卵巢切除后每日通過腹腔注射給予10mg/kg體重的SSa溶液。SSa溶解于去離子水中，通過腹腔注射對不處理組小鼠注射同體積去離子水。手術(shù)后I周開始給藥，連續(xù)給藥12周時(shí)間。給藥完成后，麻醉下通過心臟采血獲得血液標(biāo)本，并進(jìn)行離心。提取每只小鼠的左側(cè)股骨和第四腰椎，清除粘連的肌肉組織，妥善固定。
[0067]6.1使用脂質(zhì)過氧化物MDA檢測試劑盒檢測各組血液樣本。在脂質(zhì)過氧化過程中硫代巴比妥酸與MDA結(jié)合生成顯色復(fù)合物，其最大吸收峰在532nm，利用酶標(biāo)儀在此處讀數(shù)。同樣，使用GSH檢測試劑盒檢測各組血液樣本。GSH的檢測是根據(jù)GSH與二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反應(yīng)形成一個(gè)產(chǎn)物，此產(chǎn)物通過酶標(biāo)儀在412nm處進(jìn)行讀數(shù)檢測。
[0068]結(jié)果如圖6-1A和圖6-1B所示，橫坐標(biāo)為各組的作用方式，縱坐標(biāo)為吸光度OD值的百分率，以各組的OD值同空白對照組的OD值進(jìn)行比較的百分?jǐn)?shù)來表述。由圖可見，單純H2O2處理后，血清中的MDA水平明顯升高，GSH水平明顯降低；而高、中、低劑量的柴胡皂苷a給藥組血清中的MDA水平降低，GSH水平升高。因此，柴胡皂苷a可以改善血清中氧化應(yīng)激狀態(tài)。
[0069] 6.2顯微CT檢測骨微結(jié)構(gòu):第四腰椎和股骨遠(yuǎn)端的骨微結(jié)構(gòu)通過探索軌跡SP預(yù)臨床標(biāo)本顯微CT進(jìn)行檢測。分辨率為8mm,管電壓為50kV,管電流為0.1mA。通過一個(gè)桌面顯微CT處理軟件進(jìn)行重建和3D定量分析。所有標(biāo)本的掃描環(huán)境和分析方法相同。股骨掃描區(qū)域限定為遠(yuǎn)端干垢端，并且向近端的初級松質(zhì)近末端區(qū)域延伸2.0mm。在排除了顱骨及尾終板區(qū)后，椎體的松質(zhì)骨區(qū)域被包含在每一個(gè)顯微CT選區(qū)中。在這些待掃描的區(qū)域中，松質(zhì)骨與皮質(zhì)骨的分界為內(nèi)皮質(zhì)骨面。選定的感興趣區(qū)的3D參數(shù)用于數(shù)據(jù)分析，包括:骨礦物質(zhì)密度、連接密度、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁分離度和相對骨體積分?jǐn)?shù)。進(jìn)行掃描分析的操作者對標(biāo)本的處理過程單盲。
[0070]結(jié)果如圖6-2所示，相對于假手術(shù)組，卵巢切除導(dǎo)致了小鼠松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)的損害，表現(xiàn)為骨礦密度、連接密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度及骨體積分?jǐn)?shù)的下降。同時(shí)，卵巢切除后結(jié)構(gòu)模型指數(shù)和骨小梁分離度明顯提高。結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，高、中、低劑量柴胡皂苷a給藥組明顯逆轉(zhuǎn)了卵巢切除引起的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化趨勢，起到保持第四腰椎及股骨遠(yuǎn)端小梁骨骨量的作用。因此，柴胡皂苷a能夠?qū)^經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)揮預(yù)防及治療作用。
[0071]6.3通過VG染色進(jìn)行組織學(xué)檢測:小鼠的左側(cè)股骨取材完成后，用4%多聚甲醛固定48小時(shí)。所有標(biāo)本用80%酒精脫水，并用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)進(jìn)行包埋。用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切取240mm片厚的冠狀位薄片，然后將所有切片打磨成20mm片厚，用于進(jìn)行VG染色。
[0072]結(jié)果如圖6-3所示，相對于假手術(shù)組，卵巢切除組骨小梁數(shù)量明顯下降，小梁間的距離明顯變寬。給予高、中、低劑量柴胡皂苷a藥物處理后，上述骨小梁損害效果明顯得到改善，表現(xiàn)為骨小梁數(shù)量的增加及骨小梁間距的減小。[0073]因此，柴胡皂苷a可應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的防治，尤其是在防治骨質(zhì)疏松藥物的制備中的應(yīng)用。
[0074]而柴胡皂苷a是柴胡中主要活性成分之一，那么含有柴胡皂苷a的柴胡提取物也具有相應(yīng)的應(yīng)用。
【權(quán)利要求】
1.柴胡皂苷a在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
2.含柴胡皂苷a的植物提取物在防治骨質(zhì)疏松藥物的制備中的應(yīng)用。
3.柴胡皂苷a在制備改善人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)藥物的制備中的應(yīng)用。
4.柴胡皂苷a在制備抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。
5.柴胡皂苷a在制備抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化抑制的藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，柴胡皂苷a在制備提高人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中ALP活性藥物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，柴胡皂苷a在制備提高人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中促成骨分化基因ALP、COL-1、OCN及OPN表達(dá)水平的藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，柴胡皂苷a在制備提高人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中抑制RANKL和IL-6水平的藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1~8所述的應(yīng)用，其特征在于，柴胡皂苷a的給藥量至少為lmg/kg。
【文檔編號】A61P19/10GK103933055SQ201410150437
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月15日
【發(fā)明者】劉建, 黃強(qiáng), 高博, 楊柳, 羅卓荊 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)