露那辛多肽在防治白內(nèi)障藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物藥物領(lǐng)域，具體涉及露那辛(Lunasin)多肽在預(yù)防和治療白內(nèi)障藥物中的應(yīng)用。露那辛是一種最初從大豆中分離得到的活性肽，由43個(gè)氨基酸殘基組成，除具有抗腫瘤、抗炎癥的藥理活性外，還具有很強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激功能。本發(fā)明通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，露那辛多肽制成的滴眼液可有效抑制D-半乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的白內(nèi)障。同時(shí)，在細(xì)胞水平上證明，露那辛多肽可有效保護(hù)高濃度D-半乳糖對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞造成的損傷，抑制人晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡，顯著上調(diào)抗氧化酶(如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化物酶)基因的表達(dá)。
【專利說(shuō)明】露那辛多肽在防治白內(nèi)障藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物藥物領(lǐng)域，具體涉及露那辛(Lunasin)多肽在預(yù)防和治療白內(nèi)障藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]白內(nèi)障是世界上居首位的致盲性眼病，也是嚴(yán)重危害我國(guó)人民身體健康的重要疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)盲人中由白內(nèi)障而致盲者占41.06%，低視力患者中49.38%為白內(nèi)障所致。雖然白內(nèi)障可以通過(guò)手術(shù)加以摘除，但手術(shù)后常會(huì)引發(fā)晶狀體后囊膜渾濁(后發(fā)性白內(nèi)障)等并發(fā)癥，進(jìn)而嚴(yán)重影響其治療效果。因此，研制有效的白內(nèi)障防治藥物具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0003]白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是機(jī)體內(nèi)外多重因素對(duì)晶狀體長(zhǎng)期綜合作用的結(jié)果，這些因素包括紫外線照射、全身代謝性疾病、年齡、遺傳等。氧化應(yīng)激損傷學(xué)說(shuō)認(rèn)為，活性氧自由基(reactive oxygen species,R0S)引起的晶狀體氧化損傷及生化改變是導(dǎo)致白內(nèi)障的主要機(jī)制，即正常生理情況下機(jī)體產(chǎn)生的自由基受抗氧化防御系統(tǒng)的制約，而如果由于體內(nèi)外因素發(fā)生變化而打破這種平衡，就會(huì)導(dǎo)致自由基局部濃度過(guò)高，進(jìn)而對(duì)晶狀體產(chǎn)生氧化損傷，如脂質(zhì)過(guò)氧化作用、蛋白質(zhì)交聯(lián)和聚集、DNA損傷、細(xì)胞凋亡等，最終引發(fā)白內(nèi)障。
[0004]脂質(zhì)過(guò)氧化主要是指氧自由基對(duì)晶狀體細(xì)胞生物膜中所含的不飽和脂肪酸的攻擊而產(chǎn)生的氧化作用，這種氧化作用會(huì)引起膜的流動(dòng)性發(fā)生改變，通透性升高，細(xì)胞內(nèi)外離子分布異常，從而導(dǎo)致晶狀體渾濁。
[0005]自由基對(duì)晶狀體蛋白的作用，主要表現(xiàn)在引起蛋白結(jié)構(gòu)的交聯(lián)、聚合和肽鏈的斷裂，也可使蛋白質(zhì)和脂質(zhì)結(jié)合形成聚合物，使蛋白質(zhì)活性消失，它還可攻擊蛋白分子中還原性巰基，從而嚴(yán)重破壞蛋白的生物活性。
[0006]此外，自由基還可通過(guò)多種途徑引起DNA損傷和對(duì)膜泵系統(tǒng)的破壞，而由氧化損傷誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞(Lens epithelial cell, LEC)凋亡則是白內(nèi)障形成的重要細(xì)胞
學(xué)基礎(chǔ)。
[0007]雖然晶狀體上皮細(xì)胞(LEC)在正常情況下存在一系列抗氧化酶及抗氧化蛋白，如超氧化物歧化酶(SOD)，過(guò)氧化氫酶(CAT)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPx)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)，以及抗氧化蛋白A0P2等，它們可以消除R0S，然而，如果這些酶活性降低則會(huì)導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生。因此，提高晶狀體的抗氧化能力，抑制ROS的產(chǎn)生或清除ROS可以有效地防止或延緩白內(nèi)障的發(fā)生或發(fā)展。
[0008]露那辛(Lunasin)是一種最初從大豆中分離得到的活性肽，由43個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為5KDa(J Biol Chem，1987，262 (22): 10502-10505)?，F(xiàn)已有研究證明，露那辛具有抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化等藥理活性(Protein Peptide Lett, 2013, 20 (4):424-432)。在抗氧化活性方面，露那辛具有較強(qiáng)的清除自由基功效，可顯著抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的過(guò)量產(chǎn)生，從而保護(hù)細(xì)胞和組織免受氧化應(yīng)激(Oxidative Stress)所帶來(lái)的損傷(FoodChem Toxicol, 2013,65:155-161 ;Cancer Lett, 2010, 293 (I):58-64.)。露那辛多肽抗氧化作用明顯，可大量減少體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)多的活性氧(ROS)，因此，可應(yīng)用于由于體內(nèi)活性氧自由基(reactive oxygen species,R0S)產(chǎn)生過(guò)多而引起的疾病預(yù)防與治療藥物。白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制與晶狀體內(nèi)活性氧(ROS)過(guò)量產(chǎn)生有著緊密的聯(lián)系，而露那辛可以顯著抑制體內(nèi)活性氧自由基(reactive oxygen species, R0S)的過(guò)量產(chǎn)生。因此,露那辛可應(yīng)用于預(yù)防和治療白內(nèi)障的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明公開(kāi)了多肽露那辛(Lunasin)多肽的一種新用途，即在預(yù)防和治療白內(nèi)障藥物中的應(yīng)用。
[0010]露那辛是一種最初從大豆中分離得到的活性肽，由43個(gè)氨基酸殘基組成，露那辛除了具有抗腫瘤、抗炎癥的藥理活性之外，還可有效抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，清除體內(nèi)的自由基，具有很強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激的功能(Food Chem Toxicol，2013，65:155-161 ；Cancer Lett, 2010, 293 (I):58-64.)。由于白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制與晶狀體內(nèi)活性氧自由基(ROS)的過(guò)量產(chǎn)生密切相關(guān)，而露那辛具有很強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激的功能，因此本發(fā)明將露那辛多肽應(yīng)用于白內(nèi)障防治藥物。
[0011]本發(fā)明將露那辛多肽制成滴眼液，并在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行了抑制白內(nèi)障藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用3周齡的清潔級(jí)SD大鼠為研究對(duì)象，首先采用D-半乳糖溶液誘導(dǎo)的方法(按25ml / kg的劑量腹腔注射0.08%的D-半乳糖溶液，同時(shí)飲用10% D-半乳糖溶液)進(jìn)行白內(nèi)障造模，當(dāng)晶狀體中的空泡占晶狀體前皮質(zhì)面積的I / 3時(shí)，說(shuō)明造模成功。然后對(duì)模型組、露那辛滴眼液組、芐達(dá)賴氨酸滴眼液(陽(yáng)性藥)組分別用露那辛滴眼液空白基質(zhì)、露那辛滴眼液滴眼以及芐達(dá)賴氨酸滴眼液滴眼進(jìn)行給藥，連續(xù)給藥30天后，結(jié)果表明露那辛滴眼液可以有效抑制D-半乳糖誘導(dǎo)的白內(nèi)障。
[0012]本發(fā)明在細(xì)胞水平上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，露那辛能夠保護(hù)人晶狀體上皮細(xì)胞(Human lens epithelial cell line SRAOl / 04)免受高濃度 D-半乳糖對(duì)其損傷。通過(guò)Hoechst33342-Propidium iodide熒光雙染色法證實(shí)，露那辛能夠抑制250mM D-半乳糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡。RT-PCR分析表明，Lunasin可顯著增強(qiáng)經(jīng)250mMD-半乳糖處理的人晶狀體上皮細(xì)胞中重要的抗氧化酶(如超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase, S0D)、過(guò)氧化氧酶(Catalase, CAT)、谷胱;甘妝疏基轉(zhuǎn)移酶(GlutathioneS-transferase,GST)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX1)、過(guò)氧化物酶(Peroxiredoxin6, Prdx6))等基因的表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例只用于舉例說(shuō)明的目的，并不限制本發(fā)明的范圍:
[0014]實(shí)施例1露那辛滴眼的制備
[0015]露那辛滴眼液配方:露那辛，0.04g ;透明質(zhì)酸鈉，0.1g;硼酸，1.116g;硼砂，
0.191g ;氯化鈉,0.22g ;乙二胺四乙酸二鈉,0.5g ;對(duì)羥基苯甲酸乙酯,0.03g。注射用水定容至100ml。
[0016] 露那辛滴眼制備工藝:[0017]1.在60_80°C的水浴條件下，快速攪拌并緩緩將0.1g透明質(zhì)酸鈉加入到70ml注射用水中，使其完全分散，充分溶脹，勿使粘結(jié)成團(tuán)，攪拌30分鐘左右即可完全溶解。
[0018]2分別將硼酸、硼砂、氯化鈉、乙二胺四乙酸鈉和對(duì)羥基苯甲酸乙酯加入到上述透明質(zhì)酸鈉溶液中，攪勻溶解，然后定容至100ml，即得pH7.4的滴眼液空白基質(zhì)。
[0019]3.將露那辛凍干粉加入到上述滴眼液空白基質(zhì)中，攪勻溶解，通過(guò)0.22 μ m濾器過(guò)濾除菌，然后分裝，4°C冰箱中保存，即得終濃度為80 μ M的露那辛滴眼液。
[0020]實(shí)施例2露那辛對(duì)D-半乳糖損傷的人晶狀體上皮細(xì)胞的保護(hù)作用
[0021]以人晶狀體上皮細(xì)胞(Humanlens epithelial cell line SRAOl / 04,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所)為研究對(duì)象，MTT法測(cè)細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)組共分為正常組(空白對(duì)照)，模型組(僅用250mM D-半乳糖處理細(xì)胞)，露那辛藥物組(用250mM D-半乳糖和ΙμΜ，10 μ Μ，20 μ Μ，40 μ Μ，80 μ M的露那辛共同處理細(xì)胞)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人晶狀體上皮細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)DMEM(Gibco)制備成細(xì)胞懸液，以5 X IO3細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔200 μ 1，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),長(zhǎng)至占孔底面積8 0%時(shí)候，將原培養(yǎng)基棄掉，PBS清洗一次，每孔加入200 μ I無(wú)血清DMEM。正常組加入PBSlO μ I做對(duì)照；模型組加入含D-半乳糖的PBSlO μ 1，加入后使半乳糖終濃度為250mM ;露那辛藥物組加入含D-半乳糖和露那辛的PBSlO μ 1，加入后使半乳糖終濃度為 250mM，露那辛終濃度依次為 14]?，1(^]\1，2(^]\1，4(^]\1，8(^]\1，于371:，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后，每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔加入20 μ I MTT (5mg / ml)，置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，之后將孔內(nèi)溶液棄掉，每孔加入150 μ I DMS0，振蕩器振蕩lOmin，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)A57tlnmt5結(jié)果表明，與模型組相比，露那辛濃度達(dá)到ΙΟμΜ時(shí)就可以對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞起到保護(hù)作用(*ρ〈0.05)，顯著提高細(xì)胞存活率(見(jiàn)表1)。
[0022]表1露那辛對(duì)D-半乳糖損傷的人晶狀體上皮細(xì)胞的保護(hù)作用SD, η=5)
[0023]
【權(quán)利要求】
1.露那辛(Lunasin)多肽在預(yù)防和治療白內(nèi)障藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利I所述的露那辛多肽在防治白內(nèi)障藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的露那辛多肽可以通過(guò)重組表達(dá)或化學(xué)合成的方法獲得。
3.根據(jù)權(quán)利I所述的露那辛多肽在防治白內(nèi)障藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的露那辛多肽可以制備成不同類型的滴眼液劑型，為了增加其穩(wěn)定性或生物利用度可以添加藥學(xué)上可接受的藥用輔料及穩(wěn)定劑。
【文檔編號(hào)】A61K38/16GK103933548SQ201410153231
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】譚樹(shù)華, 代廣知, 張萍, 徐振雷 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)