基于p-硝基苯丙氨酸插入法構(gòu)建的骨質(zhì)疏松疫苗的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于P-硝基苯丙氨酸插入法構(gòu)建的骨質(zhì)疏松疫苗，其特征在于通過(guò)如下步驟制備：1)RANKL重組表達(dá)載體的構(gòu)建；2)非天然氨基酸p-硝基化苯丙氨酸編碼序列的定點(diǎn)插入/置換；3)p-硝基化苯丙氨酸-RANKL蛋白的重組表達(dá)與純化；4)動(dòng)物免疫與篩選；5)基于血清中和檢測(cè)及破骨細(xì)胞形成分析后的篩選；6)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，確定所需疫苗。該方法有效突破機(jī)體對(duì)自體蛋白的免疫耐受，通過(guò)主動(dòng)免疫手段，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)RANKL的特異性中和抗體，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨質(zhì)疏松良好的防治；同時(shí)克服或繞過(guò)工業(yè)化生產(chǎn)抗體的高額成本問(wèn)題。
【專(zhuān)利說(shuō)明】基于P-硝基苯丙氨酸插入法構(gòu)建的骨質(zhì)疏松疫苗
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，具體地說(shuō)是基于P-硝基苯丙氨酸插入法構(gòu)建的針對(duì)破骨細(xì)胞分化因子受體配體(RANKL)產(chǎn)生抗體的疫苗，本發(fā)明還涉及該藥物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]骨質(zhì)疏松癥主要是一種表現(xiàn)為骨量的減少、骨骼微細(xì)結(jié)構(gòu)的破壞，使得骨骼的承受力和強(qiáng)度降低，易于發(fā)生脆性骨折一類(lèi)全身性骨代謝障礙疾病，也是多種骨破壞性疾病共有的病理?yè)p害。骨質(zhì)疏松發(fā)病率高，且有逐年增高趨勢(shì)。骨質(zhì)疏松性骨折嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，威脅患者的生命安全，同時(shí)也帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前治療骨質(zhì)疏松性疾病的藥物包括鈣劑、維生素D3、雙膦酸鹽等藥物，每種治療手段都有其局限性。比如，隨著雙磷酸鹽類(lèi)藥物的廣泛應(yīng)用，其長(zhǎng)期使用所引起的一些副作用(下頜骨壞死、食道炎以及最近報(bào)道的食道癌病例)也不容忽視。因此，仍迫切地需要探索更加有效、安全、簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)的治療手段。
[0003]骨骼的強(qiáng)度和完整性，依賴(lài)于骨骼內(nèi)骨吸收和骨形成之間的動(dòng)態(tài)平衡，主要體現(xiàn)在對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間數(shù)量和功能狀態(tài)的精細(xì)調(diào)節(jié)。破骨細(xì)胞活動(dòng)的過(guò)度增強(qiáng)是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的主要 病理機(jī)制。0PG/RANKL-RANK信號(hào)通路(0PG:骨保護(hù)素；RANKL:破骨細(xì)胞分化因子受體配體；RANK:破骨細(xì)胞分化因子受體)是機(jī)體控制破骨細(xì)胞分化成熟和功能的關(guān)鍵信號(hào)通路，通過(guò)阻斷這一關(guān)鍵信號(hào)通路，可以抑制破骨細(xì)胞的分化和破骨活性，將實(shí)現(xiàn)對(duì)骨吸收作用的有效控制，以及對(duì)骨質(zhì)疏松癥等骨吸收性疾病的治療?？筊ANKL抗體可以特異性阻斷RANKL與其受體的結(jié)合，從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游有效地阻斷破骨分化信號(hào)的發(fā)放，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨質(zhì)疏松的治療。目前由美國(guó)Amgen公司研制的人源化抗RANKL抗體(商品名denosumab)治療骨質(zhì)疏松癥的II期臨床已經(jīng)完成，安全性和療效都得到充分的肯定，但是人源化抗體生產(chǎn)的高額成本使價(jià)格問(wèn)題成為其市場(chǎng)化的一大障礙。
[0004]骨質(zhì)疏松疫苗就是通過(guò)主動(dòng)免疫手段，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)RANKL的特異性中和抗體，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨質(zhì)疏松良好的治療，同時(shí)克服或繞過(guò)工業(yè)化生產(chǎn)抗體的高額成本問(wèn)題。目前，研制自體蛋白疫苗面臨的一個(gè)共同技術(shù)挑戰(zhàn)是如何克服機(jī)體對(duì)自體蛋白的免疫耐受。目前尚無(wú)能夠克服機(jī)體對(duì)自體蛋白R(shí)ANKL的免疫耐受，從而達(dá)到對(duì)骨質(zhì)疏松產(chǎn)生治療效果的疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決【背景技術(shù)】中所存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于P-硝基苯丙氨酸插入法構(gòu)建的骨質(zhì)疏松疫苗，可以有效地克服自體蛋白R(shí)ANKL的免疫耐受，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)骨質(zhì)疏松的治療。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0007](I)RANKL重組表達(dá)載體的構(gòu)建。從骨髓基質(zhì)細(xì)胞中提取RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增RANKL基因編碼區(qū)，將胞外段克隆入表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體。
[0008](2)非天然氨基酸P-硝基化苯丙氨酸編碼序列的定點(diǎn)插入/置換。通過(guò)基于PCR的體外突變技術(shù)定點(diǎn)將RANKL基因編碼酪氨酸或苯丙氨酸的密碼子置換成能被非天然氨基酸P-硝基化苯丙氨酸反密碼子特異識(shí)別的琥珀突變密碼子TAG。也可突變其他位點(diǎn)，或增加突變位點(diǎn)，或不同突變組合的復(fù)合突變體。
[0009](3) P-硝基化苯丙氨酸-RANKL蛋白的重組表達(dá)與純化。在共轉(zhuǎn)化表達(dá)琥珀突變抑制子tRNA (mutRNACUA)和p-硝基苯丙氨酸_tRNA合成酶的大腸桿菌內(nèi)表達(dá)插入p_硝基化苯丙氨酸RANKL突變體，純化重組蛋白。
[0010](4)動(dòng)物免疫與篩選。用純化的蛋白皮下注射免疫雌性C57BL/6小鼠，通過(guò)ELISA檢測(cè)血清中抗體的產(chǎn)生，并測(cè)定滴度。篩選出能夠產(chǎn)生高滴度RANKL抗體的突變蛋白。
[0011](5)基于血清中和檢測(cè)及破骨細(xì)胞形成分析后的篩選。建立RANKL和RANK體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析檢測(cè)RANKL突變體免疫小鼠的抗血清對(duì)RANKL和RANK結(jié)合的中和效應(yīng)。選擇能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度、良好中和效應(yīng)的P-硝基化苯丙氨酸RANKL突變體。大量表達(dá)和純化重組蛋白，即可作為候選疫苗。
[0012](6)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):觀察P-硝基苯丙氨酸-RANKL重組蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松的防治效果，挑選證實(shí)對(duì)骨質(zhì)疏松有良好治療效果的重組蛋白，大量表達(dá)純化，作為骨質(zhì)疏松疫苗。
[0013]該方法有效突破機(jī)體對(duì)自體蛋白的免疫耐受,通過(guò)主動(dòng)免疫手段,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)RANKL的特異性中和抗體，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨質(zhì)疏松良好的防治；同時(shí)克服或繞過(guò)工業(yè)化生產(chǎn)抗體的高額成本問(wèn)題。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1是本發(fā)明基于P-硝基苯丙氨酸插入法構(gòu)建骨質(zhì)疏松疫苗的流程圖【具體實(shí)施方式】
[0015]為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步地描述。
[0016]實(shí)施例1:p-硝基化苯丙氨酸置換型RANKL疫苗的構(gòu)建與篩選
[0017](I) RANKL重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0018]購(gòu)取RANKL cDNA克隆，通過(guò)PCR擴(kuò)增RANKL胞外段編碼序列，將PCR產(chǎn)物用限制性雙酶切，連入同樣經(jīng)過(guò)上述雙酶切處理的載體(如pET28a等)，構(gòu)建相應(yīng)的重組表達(dá)載體(如pET28a-RANKL重組表達(dá)載體)。通過(guò)雙向測(cè)序確認(rèn)序列的正確性。
[0019](2) RANKL基因的定點(diǎn)突變(以突變編碼酪氨酸的位點(diǎn)為例)
[0020]①RANKL蛋白的三維結(jié)構(gòu)分析，確定突變/置換的酪氨酸殘基。從蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取RANKL的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，用Cn3D4.1軟件對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢查分析，并逐個(gè)檢查蛋白序列中酪氨酸在三維結(jié)構(gòu)中的位置。分析結(jié)果表明，RANKL胞外段有8個(gè)酪氨酸殘基，其中Y187，Y234，Y240，Y272和Υ306 (Y為酪氨酸)暴露于球蛋白結(jié)構(gòu)表面，可以作為抗原表位的候選位點(diǎn)。
[0021] ②定點(diǎn)突變:通過(guò)基于PCR的體外突變技術(shù)將上述編碼酪氨酸殘基的密碼子序列突變成琥珀突變密碼子TAG。方法參照【Chiu J，March PE, Lee R，TillettD.Site-directed,Ligase-1ndependent Mutagenesis(SLIM):a single-tube methodologyapproachinglOO % efficiency in4h.Nucleic Acids Res.2004Dec7 ;32 (21):el74.】。
a.設(shè)計(jì)突變引物。b.設(shè)立突變PCR反應(yīng):方法以Y187N02F突變?yōu)槔?配制兩管50μ I高保真PCR反應(yīng)(含20ng pET28a-RANKL質(zhì)粒)，按照下列組合添加引物:管1:20pmolY187N02F-FL+Y187N02F-RS，管 2:20pmol Y187N02F-FS+Y187N02F-RL。加入 2U 高保真 DNA聚合酶(iProof，BIORAD)，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng):98°C 2min —(進(jìn)入循環(huán))98°C 20s ^ 55V30s —72°C 5min(20個(gè)循環(huán))一72°C IOmin0 (取ΙμL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析，判定擴(kuò)增效果。如果產(chǎn)物條帶特異，則進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)；如果無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物或條帶不特異，則需要優(yōu)化PCR反應(yīng)，如采用熱啟動(dòng)、改變退火溫度和時(shí)間等)。退火反應(yīng):從管I和管2各取20 μ I PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在一個(gè)新的PCR管混合，在PCR儀上進(jìn)行退火反應(yīng):98°C 5min —85°C5min — 80 °C 5min — 75 °C 5min — 70 °C 5min — 65 °C 5min — 60 °C 5min — 55 °C5min — 50°C IOmin.用PCR產(chǎn)物純化試劑盒將退火反應(yīng)產(chǎn)物純化，Dpn I酶切8hr (去除野生型)，直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取四個(gè)克隆，提取質(zhì)粒，通過(guò)序列測(cè)定進(jìn)行鑒定。對(duì)正確突變克隆，再做反向測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。
[0022](3)野生型與P-硝基苯丙氨酸-RANKL蛋白的重組表達(dá)與純化
[0023]①野生型RANKL蛋白的重組表達(dá):將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL_21 (DE3)大腸桿菌。挑取單個(gè)克隆，接種至5ml含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)接入2L含有上述三種抗生 素的2 X YT液體培養(yǎng)基(30g胰蛋白胨，16g酵母提取物，5g NaCl，IL雙蒸水，121°C消毒lhr)，37°C震蕩培養(yǎng)8hr，菌液0D600為0.6-1時(shí)加入IPTG至終濃度為
0.2mM，繼續(xù)培養(yǎng)7小時(shí)。離心收集菌體，取其中少量(約Iml菌液)用于檢測(cè)蛋白的表達(dá)，其余_80°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0024]②P-硝基化苯丙氨酸mRANKL突變體的表達(dá):將攜帶p_硝基化苯丙氨酸RANKL突變體的表達(dá)質(zhì)粒與表達(dá)琥珀突變抑制子tRNA (mutRNACUA)和p-硝基苯丙氨酸-tRNA合成酶的質(zhì)粒(mutN02PheRS)共轉(zhuǎn)化BL-21 (DE3)大腸桿菌，在同時(shí)含有氨芐青霉素、卡那霉素和氯霉素的瓊脂培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆，接種至5ml含有相應(yīng)抗生素和ImM P-硝基苯丙氨酸的培養(yǎng)液，37°C震蕩培養(yǎng)IOhr后，轉(zhuǎn)接入2L上述培養(yǎng)液，繼續(xù)37°C震蕩培養(yǎng)至0D600 = 0.5，加入0.02%阿拉伯糖，半小時(shí)后加入ImM IPTG，10-37。。持續(xù)震蕩培養(yǎng)4-16hr。離心收集菌體，取其中少量(約Iml菌液)用于檢測(cè)蛋白的表達(dá)，其余-80°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0025]③重組蛋白的純化(野生與突變蛋白純化方案類(lèi)同):A.細(xì)胞裂解。IL菌液收集的菌體以50ml T-150(20mM Tris.HCl pH8.0，150mM氯化鈉1，10%甘油)洗滌、離心沉淀后，用50ml冰冷的裂解緩沖液(20mM Tris.HCl pH8.0，150mM氯化鈉，10%甘油，0.5%TritonX-100，5mMe-巰基乙醇，5mM咪唑，復(fù)合蛋白酶抑制劑(Roche))重懸，放置于冰上超聲破菌(20s x5,功率200W，間隔30s)。B.親和層析初步純化(常壓)將細(xì)胞裂解液50000g離心20min,將上清轉(zhuǎn)移至新的50ml塑料離心管,加入3ml鎳親和層析基質(zhì),4°C上下顛倒旋轉(zhuǎn)2hr，然后將混懸液加入5ml玻璃層析柱，利用重力除去液體。以IOml細(xì)胞裂解液洗滌柱體，再以 50ml T-400 緩沖液洗滌(20mM Tri s.HCl ρΗ8.0，600mM 氯化鈉，10% glycerol，80mM咪唑)，然后以IOml含復(fù)合蛋白酶抑制劑劑的T-150緩沖液平衡。最后，以IOml洗脫緩沖液(20mM Tris.HCl pH8.0，150mM氯化鈉，10%甘油，300mM咪唑，復(fù)合蛋白酶抑制劑)將蛋白洗脫，取5 μ I通過(guò)12% SDS-PAGE電泳鑒定純度和估計(jì)產(chǎn)率。C.離子交換層析(FPLC)將洗脫蛋白溶液以10倍20Mm T150緩沖液稀釋?zhuān)^(guò)超級(jí)上樣環(huán)(Super Loop)上樣至經(jīng)過(guò)T150緩沖液平衡過(guò)的5mi SOURCE-Q陰離子交換柱，以T150作為基本緩沖液，氯化鈉梯度洗脫(150-1000mM)，分段收集，從各個(gè)洗脫組分中取5 μ I進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析，確定蛋白分離純化。D.根據(jù)蛋白經(jīng)過(guò)B或C步驟純化的具體情況設(shè)計(jì)增加后續(xù)的純化方式。備選方案:高分辨率的Mono-Q和S ;另外B和C的先后可做不同組合。Ε.蛋白的濃縮與保存洗脫的蛋白溶液經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾除鹽，BCA kit (Sigma)定量，凍干，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0026](4)確定P-硝基苯丙氨酸的置換與活性分析
[0027]將純化的蛋白(野生型和各種突變體)進(jìn)行:1) 一般的生化分析，如測(cè)定大小的變化、蛋白的穩(wěn)定性；2)同時(shí)送樣進(jìn)行質(zhì)譜分析，確定P-硝基苯丙氨酸的置換以及穩(wěn)定性；3)受體結(jié)合活性分析。將野生型RANKL重組包被在ELISA用的96孔板底(10 μ g/ml溶于50mM碳酸氫鈉緩沖液，pH = 8.5)，將小鼠血清用含有16ng/ml RANK-Fc重組蛋白(向國(guó)外實(shí)驗(yàn)室獲得表達(dá)載體，本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)純化)和0.05%吐溫-20的的PBS緩沖液做倍比稀釋?zhuān)缓蠹尤氚挥衜RANKL蛋白的孔中(100 μ I/孔)，室溫孵育2hr ;吸去上清，加入200 μ I含0.05%吐溫-20的的PBS緩沖液洗滌3次。結(jié)合的RANK-FC用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體檢測(cè)。
[0028]實(shí)施例2:ρ-硝基化苯丙氨酸-RANKL重組疫苗對(duì)骨質(zhì)疏松小鼠的治療效應(yīng)
[0029]1)小鼠骨質(zhì)疏松模型的制備根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，我們采用雌性C57BL/6小鼠行卵巢切除術(shù)模擬絕經(jīng)后骨 質(zhì)疏松癥模型。
[0030]2)動(dòng)物免疫與生物學(xué)效應(yīng)觀察:選取12周齡的雌性C57BL/6小鼠48只，隨機(jī)分成四組(每組12只)，
[0031]一組:抗原免疫+卵巢切除手術(shù)
[0032]二組:抗原免疫+假手術(shù)
[0033]三組:PBS注射+卵巢切除手術(shù)
[0034]四組:PBS注射+假手術(shù)
[0035]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在25±2°C，通風(fēng)良好條件下分籠飼養(yǎng)，配對(duì)攝食、飲水。一、二組小鼠分別在0，14，21，42和63天，靠近淋巴結(jié)附近皮下注射IOyg/只P-硝基化苯丙氨酸-RANKL重組疫苗；第二、三組注射無(wú)菌200 μ I PBS。第一次免疫后第28天，一、三組(免疫一組和對(duì)照組)施以卵巢完全切除術(shù):用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(20mg/kg)，下腹部剪毛消毒后，剪開(kāi)約Icm的正中切口，模型組行雙側(cè)卵巢結(jié)扎切除術(shù)，逐層縫合，術(shù)后肌注青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組除未行卵巢結(jié)扎切除外，其余步驟同模型組。術(shù)后12周測(cè)量各項(xiàng)指標(biāo)。
[0036]3)各項(xiàng)骨代謝指標(biāo)檢測(cè)
[0037]①抗體產(chǎn)生與滴度(ELISA):處死動(dòng)物，收集血液，分離血清，以野生型RANKL和作為抗原包被在96孔板底，用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG抗體進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)血清中抗體的產(chǎn)生,并測(cè)定滴度。
[0038]②鈣代謝生物學(xué)指標(biāo)的測(cè)定:血鈣、磷測(cè)定，血中骨鈣素的水平
[0039]③骨生物學(xué)參數(shù)的測(cè)定:Α.骨密度(bone mineral density, BMD)運(yùn)用DPX L型(美國(guó)Lunar)雙能X線骨密度檢測(cè)儀，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)軟件測(cè)量每只小鼠雙側(cè)股骨的骨密度，測(cè)量數(shù)據(jù)以SPSSl1.5軟件處理和分析數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；B.通過(guò)立體結(jié)構(gòu)/密度綜合掃描，取小鼠右側(cè)股骨，放入直徑為60mm的裝滿PBS溶液的丙烯管內(nèi)，用Micro-CT (GE Healthcare)圍繞股骨分別進(jìn)行縱軸旋轉(zhuǎn)掃描和橫切掃描(0.5度/層，共200度)，三維像素為33x33x33 μ m,依據(jù)儀器生產(chǎn)商提供的通用優(yōu)化的閾值，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得骨結(jié)構(gòu)和密度綜合的評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，再以SPSS11.5軟件處理和分析數(shù)據(jù)。
[0040]4)血清中和實(shí)驗(yàn)(通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析檢測(cè)RANKL突變體免疫小鼠的抗血清對(duì)RANKL和RANK結(jié)合的中和效應(yīng))將重組野生型mRANKL蛋白包被在ELISA用的96孔板底(10 μ g/ml溶于50mM碳酸氫鈉緩沖液，pH = 8.5)，將小鼠抗血清用含有16ng/ml RANK-Fc重組蛋白(向國(guó)外實(shí)驗(yàn)室獲得表達(dá)載體，本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)純化)和0.05%吐溫-20的的PBS緩沖液做倍比稀釋?zhuān)缓蠹尤氚挥幸吧蚼RANKL蛋白的孔中(100 μ I/孔)，室溫孵育2hr ；吸去上清，加入200 μ I含0.05%吐溫-20的的PBS緩沖液洗滌3次。結(jié)合的RANK-FC用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體檢測(cè)。
[0041]5)破骨細(xì)胞形成抑制分析
[0042]根據(jù)已建立的PTHrP刺激破骨細(xì)胞細(xì)胞生成系統(tǒng)和M-CSF+RANKL刺激破骨細(xì)胞生成系統(tǒng)，在破骨細(xì)胞形成分析的基礎(chǔ)之上加入免疫小鼠抗血清，觀察小鼠抗血清對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制效應(yīng)。
[0043]①PTHrP刺激法。取C57BL/6小鼠股骨和脛骨，用a MEM沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞，在含10%胎牛血清和45ng/mlPTHrP+100100y I免疫小鼠血清的a MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)6-8天(3天更換新鮮培養(yǎng)液以及所有上述添加蛋白)固定細(xì)胞，用TRAP染色試劑盒(Sigma診斷試劑盒)檢測(cè)酒石酸抗性酸性磷酸酶(破骨細(xì)胞標(biāo)志)，顯微鏡下計(jì)破骨細(xì)胞數(shù)。以O(shè)PG作為陽(yáng)性對(duì)照，不加免疫小鼠血清的PTHrP組為陰性對(duì)照。
[0044]②M-CSF+RANKL刺激法。取C57BL/6小鼠股骨和脛骨，用a MEM沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞，在含10%胎牛血清和100ng/ml M-CSF的a MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)3天。0.02% EDTA消化收集懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，在10%胎牛血清的a MEM培養(yǎng)液中，每孔7.5 X 105細(xì)胞密度，加入30ng/ml M-CSF+1 μ g/ml商品化RANKL蛋白+100 μ I免疫小鼠血清，在48孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)6-8天(3天更換新鮮培養(yǎng)液以及所有上述添加蛋白)。固定細(xì)胞，用TRAP染色試劑盒(Sigma診斷試劑盒)檢測(cè)酒石酸抗性酸性磷酸酶(破骨細(xì)胞標(biāo)志)，顯微鏡下計(jì)破骨細(xì)胞數(shù)。以O(shè)PG作為陽(yáng)性對(duì)照，不加免疫小鼠血清的商品化RANKL組為陰性對(duì)照。
[0045]實(shí)施例3 =RANKL重組疫苗安全性的觀察
[0046]主要觀察P-硝基化苯丙氨酸-RANKL重組疫苗對(duì)免疫系統(tǒng)和體溫調(diào)節(jié)功能的影響
[0047]1)全血細(xì)胞的組成:血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)紅、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板的數(shù)量/比例；流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析淋巴細(xì)胞的組成(B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞(⑶4+和⑶8+)有無(wú)改變)。
[0048]2)淋巴結(jié)和脾組織切片:從每個(gè)分組小鼠中抽樣選取3個(gè)小鼠的腸系膜淋巴結(jié)和脾臟以10%福爾馬林固定，石蠟包被，切成5μπι的組織切片。脫石蠟，分別進(jìn)行HE染色和用抗⑶3抗體作免疫組化染色，觀察P-硝基化苯丙氨酸-RANKL重組疫苗免疫小鼠主要淋巴組織結(jié)構(gòu)有無(wú)異常改變。
[0049]3)免疫功能分析:天然免疫和抗原特異性免疫反應(yīng)功能的完整性(脂多糖LPS刺激，檢測(cè)TNF- a，IL- 6，IL_1，和IFN- α反映天然免疫的功能；乙肝表面抗原疫苗，檢測(cè)特異性抗體產(chǎn)生反映抗原特異性免疫反應(yīng)功能。)[0050]4)測(cè)定免疫小鼠的基礎(chǔ)體溫，以及脂多糖刺激后體溫(炎癥引起的發(fā)熱反應(yīng))，采用微型紅外測(cè)溫儀測(cè)定耳廓溫度。
[0051]5) 停止免疫后I，3，6個(gè)月，分別用ELISA檢測(cè)抗體的滴度變化。
[0052]6)其它:骨和腎組織切片，通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)有無(wú)抗原抗體
[0053]對(duì)骨質(zhì)疏松具有良好防治效果、安全性好的p-硝基苯丙氨酸-RANKL重組蛋白即為所需的骨質(zhì)疏松疫苗。
[0054]最后應(yīng)說(shuō)明的是:以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種基于P-硝基苯丙氨酸插入法構(gòu)建的骨質(zhì)疏松疫苗，其特征在于通過(guò)如下步驟制備:I) RANKL重組表達(dá)載體的構(gòu)建；2)非天然氨基酸P-硝基化苯丙氨酸編碼序列的定點(diǎn)插入/置換；3) P-硝基化苯丙氨酸-RANKL蛋白的重組表達(dá)與純化；4)動(dòng)物免疫與篩選；5)基于血清中和檢測(cè)及破骨細(xì)胞形成分析后的篩選；6)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，確定所需疫苗。
2.如權(quán)利要求1所述的基于P-硝基苯丙氨酸插入法構(gòu)建的骨質(zhì)疏松疫苗，其特征在于:從骨髓基質(zhì)細(xì)胞中提取RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增RANKL基因編碼區(qū)，將胞外段克隆入表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體。
3.如權(quán)利要求1所述的基于P-硝基苯丙氨酸插入法構(gòu)建的骨質(zhì)疏松疫苗，其特征在于:所述定點(diǎn)插入/置換是通過(guò)基于PCR的體外突變技術(shù)定點(diǎn)將RANKL基因編碼酪氨酸或苯丙氨酸的密碼子置換成能被非天然氨基酸P-硝基化苯丙氨酸反密碼子特異識(shí)別的琥珀突變密碼子TAG。
4.如權(quán)利要求1所述的基于P-硝基苯丙氨酸插入法構(gòu)建的骨質(zhì)疏松疫苗，其特征在于:在共轉(zhuǎn)化表達(dá)琥珀突變抑制子tRNA(mutRNACUA)和p_硝基苯丙氨酸_tRNA合成酶的大腸桿菌內(nèi)表達(dá)插入P-硝基化苯丙氨酸RANKL突變體，純化重組蛋白。
【文檔編號(hào)】A61P19/10GK103961694SQ201410155986
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】陶惠人, 李鋒 申請(qǐng)人:陶惠人, 李鋒