青蒿素在制備防治神經(jīng)性疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了青蒿素及其衍生物在制備防治神經(jīng)性疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明以大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12神經(jīng)細(xì)胞株、視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞株RGC-5和原代皮質(zhì)神經(jīng)元為代表作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以硝普鈉、雙氧水摸擬誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等細(xì)胞損傷，研究發(fā)現(xiàn)青蒿素在硝普鈉、雙氧水誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中具有保護(hù)作用，并初步探討了青蒿素及其衍生物的保護(hù)作用機(jī)制，結(jié)果說(shuō)明青蒿素及其衍生物可作為神經(jīng)保護(hù)藥用于預(yù)防和治療各種神經(jīng)性疾病，如各種神經(jīng)退行性疾病、急慢性神經(jīng)變性疾病、神經(jīng)性眼病等，這些主要與氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡有關(guān)的神經(jīng)性疾病。本發(fā)明為神經(jīng)性疾病的治療和預(yù)防帶來(lái)了新方向。
【專(zhuān)利說(shuō)明】青蒿素在制備防治神經(jīng)性疾病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本 發(fā)明涉及青蒿素在制備防治神經(jīng)性疾病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]青蒿素(artemisinin)是從菊科植物艾屬黃花蒿中提取的一種化合物，已被廣泛用于各型瘧疾的治療，青蒿素對(duì)瘧原蟲(chóng)的殺滅作用主要作用于紅細(xì)胞內(nèi)期，對(duì)于紅細(xì)胞外期以及紅細(xì)胞前期則效果很弱。除了具有突出的抗瘧作用外，青蒿素還有顯著的抗菌、抗病毒作用，其抗菌譜包括表皮葡萄球菌、卡他球菌、炭疽桿菌、白喉?xiàng)U菌，同時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、痢疾桿菌、結(jié)核桿菌等也有一定的抑制作用。青蒿中提取得到的谷留醇和豆甾醇亦有抗病毒作用。另，青蒿素還具有免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)體液免疫有明顯的抑制作用，對(duì)細(xì)胞免疫則有一定的促進(jìn)作用。青蒿素類(lèi)物資在臨床應(yīng)用時(shí)，毒性較低，使用安全，一般無(wú)明顯不良反應(yīng)。關(guān)于青蒿素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用，目前的研究還很少，有研究顯示二氫青蒿素對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a的細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，提示青蒿素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤可能有一定的抑制作用。有關(guān)青蒿素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其作為神經(jīng)保護(hù)劑治療神經(jīng)退行性疾病及視神經(jīng)病變還未見(jiàn)有報(bào)道。
[0003]NO是一種較小的生物活性分子，在較低濃度下，能參與腦內(nèi)許多生理功能的調(diào)節(jié)，盡管其化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，卻能以相對(duì)特異的方式控制神經(jīng)元的功能或生理功能；而在較高濃度下，NO對(duì)人皮層神經(jīng)元和神經(jīng)細(xì)胞具有毒性作用。作為外源性NO供體，硝普鈉(SNP)制備的神經(jīng)元損傷模型是相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的理想體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> [0004]當(dāng)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步延長(zhǎng)了人類(lèi)的生命，而由此導(dǎo)致老年急慢性神經(jīng)性疾病的上升，例如阿耳茨海默氏癥、中風(fēng)、帕金森癥等。這些神經(jīng)性疾病以疾病進(jìn)程中特定神經(jīng)元變性的不斷發(fā)展為特征。由于成熟神經(jīng)元細(xì)胞在其死亡后不能再生，在上述神經(jīng)性疾病中神經(jīng)元的死亡可能導(dǎo)致大腦基本功能(包括識(shí)別、感覺(jué)和行動(dòng)功能)的不能治愈的損傷以及由此產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的過(guò)重負(fù)擔(dān)。
[0005]氧化應(yīng)激(oxidativestress)和細(xì)胞凋亡(apoptosis)被認(rèn)為是神經(jīng)元死亡的主要途徑，氧化應(yīng)激(oxidativestress)和多種神經(jīng)性疾病(如各種神經(jīng)退行性疾病及神經(jīng)性眼病)有關(guān)。
[0006]目前，對(duì)青蒿素類(lèi)藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用了解不多，同時(shí)，青蒿素在神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡中是否具有保護(hù)作用仍不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明以大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12神經(jīng)細(xì)胞株、視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞株RGC-5和原代皮質(zhì)神經(jīng)元為代表，作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以硝普鈉(SNP)、雙氧水(H2O2)來(lái)摸擬誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物在硝普鈉、雙氧水誘導(dǎo)的相應(yīng)細(xì)胞損傷中具有保護(hù)作用，并初步探討了青蒿素及其衍生物保護(hù)作用的機(jī)制，說(shuō)明青蒿素及其衍生物可作為神經(jīng)保護(hù)藥用于預(yù)防和治療各種神經(jīng)性疾病，如各種神經(jīng)退行性疾病、急慢性神經(jīng)變性疾病、神經(jīng)性眼病等，這些主要與氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡有關(guān)的神經(jīng)性疾病。
[0008]本發(fā)明的目的在于提供青蒿素及其衍生物在制備防治神經(jīng)性疾病藥物中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
青蒿素及其衍生物在制備防治神經(jīng)性疾病藥物中的應(yīng)用。
[0010]進(jìn)一步的，上述的神經(jīng)性疾病包括急慢性神經(jīng)變性疾病、神經(jīng)性眼科疾病。
[0011]進(jìn)一步的，上述的神經(jīng)性疾病為與氧化應(yīng)激損傷相關(guān)的神經(jīng)性疾病。
[0012]進(jìn)一步的，上述的青蒿素衍生物為以青蒿素為母核的化合物或其藥物可接受的鹽。
[0013]進(jìn)一步的，上述的以青蒿素為母核的化合物選自青蒿素甲醚、青蒿琥酯、二氫青蒿素、去氧青蒿素。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
O本發(fā)明證明了青蒿素及其衍生物在SNP、H2O2引發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中具有一定的保護(hù)作用，且初步探索了青蒿素及其衍生物的作用機(jī)制，其可能是通過(guò)激活或者部分激活MAPK/Erk信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)在SNP損傷神經(jīng)細(xì)胞中的保護(hù)作用，由于青蒿素類(lèi)藥物已經(jīng)用于臨床，研究這些藥物的神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)于尋找其可能靶點(diǎn)、新的藥理作用，對(duì)該類(lèi)藥物的安全使用具有重要的意 義。
[0015]2)本發(fā)明說(shuō)明了青蒿素及其衍生物可作為神經(jīng)保護(hù)藥用于預(yù)防和治療各種神經(jīng)性疾病，如各種神經(jīng)退行性疾病、急慢性神經(jīng)變性疾病、神經(jīng)性眼病等，為神經(jīng)性疾病的治療和預(yù)防帶來(lái)了新方向。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為PC12細(xì)胞在不同濃度的SNP處理的細(xì)胞活力情況，#表示Ρ〈0.05，##Ρ〈0.01 ；
圖2為不同濃度的青蒿素在SNP損傷PC12細(xì)胞中的保護(hù)作用，#表示尸<0.05,##表示 7X0.01 ；
圖3為Hochest染色檢測(cè)青蒿素在SNP誘發(fā)PC12細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用；
圖4是對(duì)圖3中細(xì)胞凋亡數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分析，#/Χ0.01，##表示/X0.01 ；
圖5為在抑制劑PD98059存在下青蒿素在SNP損傷PC12細(xì)胞中的保護(hù)情況，A為青蒿素，LY 為 LY294002, PD 為 PD98059, 林/X0.01, ## 表示/X0.01 ；
圖6為青蒿素可能通過(guò)MAPK/Erk信號(hào)通路在SNP損傷PC12細(xì)胞中的起保護(hù)作用；
圖7為SNP對(duì)RGC-5細(xì)胞的損傷作用，*/X0.01 ；
圖8為不同濃度的青蒿素在SNP損傷RGC-5細(xì)胞中的保護(hù)作用(**表示P〈0.01)；
圖9為青蒿素對(duì)SNP誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，A為Hoechst染色實(shí)驗(yàn)，B是對(duì)A中各組細(xì)胞中凋亡比例的統(tǒng)計(jì)分析，ART:青蒿素(Artemisnin), mP<0.01, **7X0.01 ；圖10為SNP對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷作用，*/X0.01 ；
圖11為不同濃度的青蒿素在SNP損傷皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞中的保護(hù)作用(#^0.05，
林/X0.01)；
圖12為H2O2對(duì)RGC-5細(xì)胞的損傷作用，*/X0.01 ；圖13為不同濃度的青蒿素在H2O2損傷RGC-5細(xì)胞中的保護(hù)作用(#表示P〈0.01)。【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0018]實(shí)施例1青蒿素在SNP損傷PC12神經(jīng)細(xì)胞中的保護(hù)作用 一、材料與方法
(I)材料與主要試劑
青蒿素購(gòu)于大連美侖生物科技有限公司；硝普鈉(SNP)購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和馬血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；噻唑藍(lán)(MTT )、二甲亞砜(DMS0)、購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司;LY294002、PD98059 購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich 公司!Western blot相關(guān)試劑購(gòu)自廣州碧云天生物技術(shù)研究所；Western所用抗體Ant1-phospho_Akt (Ser473)antibody和Ant1-phospho_p44/42 MAPK (Erkl/2) (Thr202/Tyr204) antibody 購(gòu)自 CellSignaling Technology (Woburn, USA);辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(IgG)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。
[0019](2)主要儀器雙人單面凈化超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；Model 2323 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)SHELLA公司)；LX71熒光倒置相差顯微鏡，S8F-3顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)！western blot垂直電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。
[0020](3)方法 I)細(xì)胞培養(yǎng)
高分化PC12細(xì)胞株由加拿大Mcgill university道格拉斯研究中心Remi Quirion饋贈(zèng)，依據(jù)鄭文華等建立的方法進(jìn)行培養(yǎng):使用體積分?jǐn)?shù)分別為5%胎牛血清和5%馬血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml的DMEM培養(yǎng)基，置于37 °C，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2氣體的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔兩天用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化傳代備用。
[0021]2)原代神經(jīng)元培養(yǎng)
a.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:將實(shí)驗(yàn)所用的手術(shù)器械浸泡在75 %的酒精中，需浸泡30 min以上，預(yù)先準(zhǔn)備好分離皮質(zhì)所需的小培養(yǎng)皿、離心管等器材，配好I XHBSS，消化終止液及培養(yǎng)基。
[0022]b.Poly-D-Lysine包被:6孔板每孔加1.5 mL Poly-D-Lysine,其他孔板按此類(lèi)推，10-30 min后用IXPBS洗兩次。
[0023]c.原代神經(jīng)元培養(yǎng)所用的孕鼠來(lái)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，選取孕18天的昆明孕小鼠，鼠腹部噴75%的酒精，脫臼處死，沿腹中線(xiàn)切開(kāi)腹部，找到子宮，快速取出，置于預(yù)先準(zhǔn)備的培養(yǎng)皿內(nèi)，迅速轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)。
[0024]d.剪開(kāi)子宮，取出孕鼠，斷頭，分離頭骨，取出全腦，置于盛有IXHBSS的培養(yǎng)皿內(nèi)。
[0025]e.超凈工作臺(tái)內(nèi)，用眼科手術(shù)鑷、手術(shù)剪，小心分離海馬及皮質(zhì)，置于IXHBSS中漂洗。
[0026]f.用眼科手術(shù)鑷仔細(xì)去除皮質(zhì)及海馬組織表面的腦膜及血絲，在培養(yǎng)皿內(nèi)用鑷子盡量撕碎腦組織，將撕碎的組織轉(zhuǎn)移至10 mL EP管中。
[0027]g.加IXHBSS沖洗數(shù)次，發(fā)現(xiàn)有懸浮的血絲，立即去除，加胰酶，置37°C CO2培養(yǎng)箱消化8 min。[0028]h.加含10 % FBS的培養(yǎng)基終止消化，輕彈離心管，持續(xù)1.5-2 min。
[0029]1.吸去FBS，加IXHBSS I mL，巴斯德吸管反復(fù)吹打直至呈單細(xì)胞并分散均勻，如見(jiàn)有組織塊或結(jié)締組織，則吸起棄去。
[0030]j.吹打均勻后，取10 μ L細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，800 rpm XlO min離心。
[0031]k.吸去上清，加預(yù)先準(zhǔn)備好的細(xì)胞培養(yǎng)基，制成單細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)量種板，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。種板時(shí)所用培養(yǎng)基為:DMEM+10% FBS+0.2 % PSA, 6 h后貼壁后換液，換為Neurobasal + 2 % B27 +0.2 % PSA，定期觀察細(xì)胞。
[0032]3) MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將PC12細(xì)胞以IXlO4個(gè)/孔密度接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，加入青蒿素(3~100 μ M)、SNP ( 500 μ Μ)，于給藥后在37 V、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2氣體的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，加入MTT液(0.5mg/ml)，在37°C孵育4h后棄去上清，每孔加入100 μ L DMSO振蕩，待結(jié)晶完全溶解后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度(A49tl )，檢測(cè)細(xì)胞活力。
[0033]4)免疫印跡法檢測(cè)下游信號(hào)通路蛋白磷酸化水平
將上述培養(yǎng)的PC12細(xì)胞消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基接種到用多聚賴(lài)氨酸包被的12孔板中。細(xì)胞貼壁后，用LY294002、PD98059處理后，洗去細(xì)胞培養(yǎng)液，用冰冷的PSB輕輕沖洗，收獲細(xì)胞后獲取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量后將蛋白濃度調(diào)至等濃度。以30yg/Well的蛋白樣品經(jīng)8%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，再轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉轉(zhuǎn)印膜1.5h，加入各種抗體(Ant1-phospho-Akt(Ser473)antibody, Ant1-phospho_p44/42 MAPK (Erkl/2) (Thr202/Tyr204) antibody)室溫孵育過(guò)夜。洗膜后,再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育lh。ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)蛋白信號(hào)。
[0034]5)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，劑量資料多組間比較采用單因素方差分析(One-wayAN0VN)，各組均數(shù)的多重比較采用最小顯著插值法(LSD)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0035]二、結(jié)果 (1)3咿能誘導(dǎo)？(:12細(xì)胞損傷
PC12細(xì)胞剝奪血清后，使用不同濃度的SNP (200~1000 μ M)處理PCl2細(xì)胞，另設(shè)置含1% FBS (v/v)以及不含血清(CTL)的DMEM培養(yǎng)基處理PC12細(xì)胞作為對(duì)照，培養(yǎng)24h后通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，從中可以看出隨著SNP濃度的增加，PC12細(xì)胞的活力逐漸降低，當(dāng)SNP濃度達(dá)到800 μ M及以上時(shí)，對(duì)PC12細(xì)胞活力的損傷具有極顯著差異(Ρ〈0.01)。
[0036]上述結(jié)果說(shuō)明SNP對(duì)PC12細(xì)胞的損傷具有劑量依賴(lài)性，800 μ M的SNP即可用于誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)。
[0037](2 )青蒿素在SNP損傷PC12細(xì)胞活力中的保護(hù)作用
PC12細(xì)胞剝奪血清后，加入不同濃度的青蒿素(0、3.125,6.25,12.5、25、50、100 μ Μ，用DMEM培養(yǎng)基配制)預(yù)處理lh，隨即再加入800 μ M SNP(用DMEM培養(yǎng)基配)，處理24h后，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，另外設(shè)立對(duì)照組CTL (加入相同體積的DMEM培養(yǎng)基)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，從中可以看出在800 μ M SNP的處理下，隨著青蒿素(Artemisnin)濃度的增加，PC12細(xì)胞活力被損傷的程度逐漸降低，當(dāng)青蒿素濃度達(dá)到25 μ M及以上時(shí)，降低SNP對(duì)PC12細(xì)胞活力的損傷作用具有顯著差異Ρ〈0.01。
[0038]上述結(jié)果說(shuō)明，青蒿素在SNP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中具有保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用具有劑量依賴(lài)性，當(dāng)青蒿素濃度達(dá)到25 μ M及以上時(shí)幾乎可阻斷SNP對(duì)PC12的毒性損傷作用。
[0039] (3)青蒿素在SNP誘發(fā)PC12細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用
上述MTT結(jié)果表明青蒿素可以保護(hù)SNP所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,接下來(lái)進(jìn)一步采用Hoechst染色法來(lái)觀察青蒿素抑制SNP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
[0040]PC12細(xì)胞剝奪血清后，加入25 μ M的青蒿素預(yù)處理lh，隨即再加入800 μ M SNP處理24h后，相關(guān)對(duì)照組的設(shè)置如圖3和圖4所示，處理后進(jìn)行Hochest33258染色，檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。
[0041]Hoechst染色結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組細(xì)胞胞核圓潤(rùn)飽滿(mǎn)，著色均勻；給予SNP處理后，在正常的PC12細(xì)胞核之間散在分布一些出現(xiàn)凋亡特征的細(xì)胞核，如細(xì)胞核體積變小皺縮，可見(jiàn)到核碎裂成小葉狀或呈現(xiàn)濃染致密的顆粒塊狀，呈現(xiàn)高強(qiáng)度的藍(lán)色熒光(如圖中箭頭所示);然而在給予25 μ mol/L青蒿素(Artemisinin)干預(yù)下,細(xì)胞核皺縮數(shù)減少且核碎裂的現(xiàn)象有所緩解。這表明青蒿素在SNP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡中有一定的保護(hù)作用。
[0042]細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)結(jié)果如圖4所示:與正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞相比，SNP處理后，PC12細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著高于正常組(/X0.01)，而給予藥物青蒿素干預(yù)后，可以一定程度上逆轉(zhuǎn)SNP的毒性作用，其凋亡壞死的細(xì)胞數(shù)顯著減少，且其保護(hù)效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(/X0.01)。
[0043]上述結(jié)果說(shuō)明青蒿素在SNP誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)PC12的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等細(xì)胞損傷(PC12細(xì)胞的SNP損傷模型)中具有保護(hù)作用。
[0044](5)青蒿素可能通過(guò)MAPK/Erk信號(hào)通路在SNP損傷PC12細(xì)胞中的起保護(hù)作用 已有研究報(bào)道青蒿素類(lèi)藥物可能通過(guò)MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效作用，為了進(jìn)
一步探索青蒿素是通過(guò)怎樣的信號(hào)途經(jīng)起到保護(hù)PC12細(xì)胞的作用，本發(fā)明選取PI3K/Ak和MAPK/Erk信號(hào)通路進(jìn)行探索。
[0045]PC12細(xì)胞剝奪血清后，分別使用PI3K/Akt信號(hào)通路的特異性抑制劑LY294002(25 μ Μ),MAPK/Erk信號(hào)通路的特異性抑制劑PD98059 (50 μ Μ)預(yù)處理PC12細(xì)胞30min后，加入25 μ M青蒿素處理lh，隨即加入SNP處理24h后，通過(guò)MTT法檢測(cè)處理組和相應(yīng)的對(duì)照組的細(xì)胞活力，如圖5所示。從圖5中可以看出，抑制劑LY294002和TO98059本身并不會(huì)明顯降低PC12細(xì)胞活力，且在青蒿素和SNP同時(shí)存在時(shí)PC12細(xì)胞活力幾乎也不受影響，但當(dāng)在青蒿素、SNP和抑制劑TO98059同時(shí)存在時(shí)，PC12細(xì)胞活力明顯降低，這說(shuō)明當(dāng)有抑制劑PD98059存在時(shí)青蒿素在SNP損傷PC12細(xì)胞中的保護(hù)作用喪失，推測(cè)青蒿素可能通過(guò)MAPK/Erk信號(hào)通路在SNP損傷PC12細(xì)胞中的起保護(hù)作用。
[0046]為了進(jìn)一步探索上述推測(cè)是否正確,接下來(lái)通過(guò)western blot進(jìn)一步檢測(cè)MAPK/Erk信號(hào)通路中相關(guān)蛋白激酶在青蒿素作用下的磷酸化情況，細(xì)胞處理方法同上，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。
[0047]從圖6中可以看出當(dāng)SNP與青蒿素同時(shí)處理PC12細(xì)胞后，ρ-Erk水平顯著增高；加入PI3K/Akt的特異性抑制劑LY294002不能降低Erk的磷酸化水平，而加入MAPK/Erk的特異性抑制劑PD98059后，Erk磷酸化水平降到對(duì)照組水平。說(shuō)明青蒿素對(duì)SNP損傷PC12的保護(hù)作用可能是通過(guò)MAPK/Erk信號(hào)通路發(fā)揮作用。[0048]絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedprotein kinases, MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一，它能將細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)。該家族通過(guò)影響動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡等。目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一共發(fā)現(xiàn)了 4條并行的MAPK信號(hào)通路:MAPK家族的信號(hào)通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的蛋白激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK) /應(yīng)激激活的蛋白激酶(SAPK)、P38MAPK以及ERK5/BMK1四條途徑。其中，Ras-Raf-ERK途徑迄今研究得比較清楚的一條通路，該通路參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、分化等多種生理、病理過(guò)程。生長(zhǎng)因子與受體結(jié)合激活酪氨酸激酶，通過(guò)銜接蛋白將信號(hào)傳遞給Ras蛋白，Ras-GTP直接與Raf相結(jié)合，形成一個(gè)短暫的膜錨定信號(hào)?；罨腞af通過(guò)磷酸化促分裂原激活的蛋白激酶的激酶(MEK)環(huán)上的絲氨酸殘基而將其激活。MEK再將促分裂原激活的蛋白激酶(ERK)激活，進(jìn)而磷酸化許多與胞質(zhì)和胞膜相連的底物而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，PD98059能抑制青蒿素對(duì)SNP損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，即可說(shuō)明青蒿素保護(hù)SNP損傷的PC12細(xì)胞，可能是通過(guò)激活或者部分激活MAPK/Erk信號(hào)通路而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。而激活該通路的具體機(jī)制，則有待進(jìn)一步的研究。
[0049]綜上所述,本研究在PC12細(xì)胞中證明青蒿素對(duì)SNP損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，其作用可能是通過(guò)激活或者部分激活MAPK/Erk信號(hào)通路，但其具體的機(jī)制還有待更深入的研究。由于青蒿素類(lèi)藥物已經(jīng)用于臨床，研究這些藥物的神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)于尋找其可能靶點(diǎn)、新的藥理作用，對(duì)該類(lèi)藥物的安全使用具有重要的意義。
[0050]實(shí)施例2青蒿素在SNP損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞RGC-5中的保護(hù)作用 一、材料與方法
同實(shí)施例1。
[0051]二、結(jié)果
(I)SNP能誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞損傷
RGC-5細(xì)胞剝奪血清后，使用不同濃度的SNP (62.5~1000 μ M)處理RGC-5細(xì)胞以及DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RGC-5細(xì)胞作為對(duì)照(CTL)，培養(yǎng)24h后通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化，檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，從中可以看出低濃度的SNP促進(jìn)細(xì)胞增殖(I~250μΜ)，當(dāng)達(dá)到500 μ M時(shí)SNP出現(xiàn)毒性，在750 μ M細(xì)胞存活率降為59%左右，此濃度作為SNP細(xì)胞毒性模型。
[0052](2)青蒿素在SNP損傷RGC-5細(xì)胞活力中的保護(hù)作用
在已建立的SNP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型的基礎(chǔ)之上，采用750 μ mol/L的SNP對(duì)RGC-5細(xì)胞進(jìn)行處理，MTT法檢測(cè)青蒿素是否對(duì)SNP誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，青蒿素的溶度分別選用6.25、12.5、25、50和100 μ mol/L,檢測(cè)結(jié)果如圖8所示，隨著青蒿素濃度的增加，SNP誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞損傷的作用逐漸減弱，細(xì)胞的存活率逐漸增加，當(dāng)青蒿素的濃度達(dá)到50 ymol/L時(shí)，其保護(hù)作用已經(jīng)具有顯著性差異(7X0.01)。這表明，低濃度的青蒿素對(duì)SNP誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，且呈劑量依賴(lài)性(O~50 μ mol/L)。
[0053](3)青蒿素在SNP誘發(fā)RGC-5細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用
上述MTT結(jié)果表明青蒿素可以保護(hù)SNP所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,接下來(lái)進(jìn)一步采用Hoechst染色法來(lái)觀察青蒿素抑制SNP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
[0054]Hoechst染色結(jié)果如圖9 A所示，對(duì)照組細(xì)胞胞核圓潤(rùn)飽滿(mǎn)，著色均勻；給予SNP處理后，在正常的RGC-5細(xì)胞核之間散在分布一些出現(xiàn)凋亡特征的細(xì)胞核，如細(xì)胞核體積變小皺縮，可見(jiàn)到核碎裂成小葉狀或呈現(xiàn)濃染致密的顆粒塊狀，呈現(xiàn)高強(qiáng)度的藍(lán)色熒光(如圖中箭頭所示);然而在給予25 μ mol/L青蒿素干預(yù)下，細(xì)胞核皺縮數(shù)減少且核碎裂的現(xiàn)象有所緩解。這表明青蒿素在SNP誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞凋亡中有一定的保護(hù)作用。
[0055]細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)結(jié)果如圖9 B所示:與正常培養(yǎng)的RGC-5細(xì)胞相比，SNP處理后，RGC-5細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著高于正常組(/X0.01)，而給予藥物青蒿素干預(yù)后，可以一定程度上逆轉(zhuǎn)SNP的毒性作用，其凋亡壞死的細(xì)胞數(shù)顯著減少，且其保護(hù)效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0°〈0.01)。
[0056] 上述結(jié)果說(shuō)明青蒿素在SNP誘導(dǎo)的RGC-5視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷中具有保護(hù)作用。
[0057]實(shí)施例3青蒿素在SNP損傷皮質(zhì)神經(jīng)元中的保護(hù)作用 一、材料與方法
同實(shí)施例1。
[0058]二、結(jié)果
(I) SNP能誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞損傷
皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞剝奪血清后，使用不同濃度的SNP (12.5~1000 μ Μ)處理皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞以及DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞作為對(duì)照(CTL)，培養(yǎng)24h后通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化，檢測(cè)結(jié)果如圖10所示，從中可以看出從12.5 ymol/L到100 ymol/L之間SNP可明顯降低神經(jīng)元的存活率，MTT的值呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性下降，50 μ mol/L的SNP即可顯著抑制神經(jīng)元的存活，后續(xù)神經(jīng)元損傷的SNP的劑量選擇為50 μ mol/L。
[0059](2)青蒿素在SNP損傷皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞活力中的保護(hù)作用
在已建立的SNP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型的基礎(chǔ)之上，采用50 μ mol/L的SNP對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行處理，MTT法檢測(cè)青蒿素是否對(duì)SNP誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，青蒿素的溶度分別選用6.25、12.5、25、50和100 μ mol/L,檢測(cè)結(jié)果如圖11所示，隨著青蒿素濃度的增加，SNP誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的作用逐漸減弱，細(xì)胞的存活率逐漸增加，當(dāng)青蒿素的濃度達(dá)到25 μ mol/L時(shí)，其保護(hù)作用已經(jīng)具有顯著性差異(/X0.01 )。這表明，在25 -1OOymol內(nèi)，青蒿素對(duì)SNP誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有顯著的抑制作用，且呈明顯的劑量效應(yīng)。
[0060]上述結(jié)果說(shuō)明青蒿素在SNP誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷中具有保護(hù)作用。
[0061]實(shí)施例4青蒿素在H2O2損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞RGC-5中的保護(hù)作用 一、材料與方法
同實(shí)施例1。
[0062]二、結(jié)果
(I) H2O2能誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞損傷
RGC-5細(xì)胞剝奪血清后，使用不同濃度的H202( 10~100 μ Μ)處理RGC-5細(xì)胞以及DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RGC-5細(xì)胞作為對(duì)照(CTL)，培養(yǎng)24h后通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化，檢測(cè)結(jié)果如圖12所示，從中可以看出高濃度的H2O2濃度(60~100 μ M )依賴(lài)性地引起RGC-5細(xì)胞死亡，100 μ M H2O2可引起大約40~60%細(xì)胞死亡。
[0063](2)青蒿素在H2O2損傷RGC-5細(xì)胞活力中的保護(hù)作用在已建立的H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型的基礎(chǔ)之上，采用100 μ mol/L的H2O2對(duì)RGC-5細(xì)胞進(jìn)行處理，MTT法檢測(cè)青蒿素是否對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，青蒿素的溶度分別選用6.25、12.5、25、50和100 μ mol/L。檢測(cè)結(jié)果如圖8所示，隨著青蒿素濃度的增加，H2O2誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞損傷的作用逐漸減弱，細(xì)胞的存活率逐漸增加，當(dāng)青蒿素的濃度達(dá)到25 μ mol/L時(shí)，其保護(hù)作用已經(jīng)具有顯著性差異(/X0.05)。這表明，低濃度的青蒿素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，且呈劑量依賴(lài)性(O~100 μ mol/L)。
[0064]上述結(jié)果說(shuō)明青蒿素在H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞(PC12)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等細(xì)胞損傷中具有保護(hù)作用。
[0065]同樣,對(duì)青蒿素衍生物(如青蒿素甲醚Artemether、青蒿琥酯Artesunate、二氫青蒿素Dihydroartemisinin及去氧青蒿素Deoxyartemisinin等)或其藥物可接受的鹽進(jìn)行上述實(shí)施例中類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)其衍生物均有與青蒿素類(lèi)似的保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞抵抗損傷能力的作用，從而也可以說(shuō)明以青蒿素為母核的類(lèi)似物也具有類(lèi)似的作用。
[0066]上述相關(guān)青蒿素及其衍生物結(jié)構(gòu)式如下:
青蒿素 Artemisinin
【權(quán)利要求】
1.青蒿素及其衍生物在制備防治神經(jīng)性疾病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的神經(jīng)性疾病包括急慢性神經(jīng)性疾病、神經(jīng)性眼科疾病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的神經(jīng)性疾病為與氧化應(yīng)激損傷相關(guān)的神經(jīng)性疾病。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的青蒿素衍生物為以青蒿素為母核的化合物或其藥物可接受的鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的以 青蒿素為母核的化合物選自青蒿素甲醚、青蒿琥酯、二氫青蒿素、去氧青蒿素。
【文檔編號(hào)】A61P27/02GK103948585SQ201410156407
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】鄭文華, 周旋和, 孟茜, 王曰康, 汪海濤, 張浪, 閆鳳俠, 賴(lài)永長(zhǎng) 申請(qǐng)人:中山大學(xué)中山眼科中心