一種水蛭素磷脂復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種水蛭素磷脂復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用，所述水蛭素磷脂復(fù)合物由水蛭素和磷脂組成，所述水蛭素和磷脂的摩爾比為1:1（以平均分子量計），制備方法為（1）將水蛭素溶于乙醇中，得到第一溶液；（2）將磷脂以非質(zhì)子溶劑溶解，得到第二溶液：（3）攪拌條件下將第一溶液與第二溶液充分混合，除去有機(jī)溶劑，加入甘露醇水溶液，溶解，過濾，冷凍干燥即得；所述水蛭素磷脂復(fù)合物的親脂性和穩(wěn)定性大大提高，在腎組織中的生物利用度明顯提高，可用于治療早期糖尿病腎病。
【專利說明】一種水蛭素磷脂復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用，尤其是一種水蛭素復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水蛭素是從水蛭頭部提取的一種單鏈環(huán)肽化合物，分子量為7000道爾頓，由65個氨基酸殘基組成。水蛭素是水蛭中含有的一種重要有效成分，具有很強(qiáng)的抗凝血和抗血栓活性。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，與天然水蛭素結(jié)構(gòu)和藥理活性基本相同的重組水蛭素已經(jīng)被成功合成，推動了水蛭素的臨床應(yīng)用。例如，在治療糖尿病及并發(fā)癥方面，水蛭素有改善2型糖尿病胰島素抵抗的作用(浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005年第29卷第4期)，水蛭素可降低尿中微量白蛋白、改善高凝狀況，對糖尿病腎病和高血壓腎病患者的腎臟有較好的保護(hù)作用(臨床合理用藥，2010年第3卷第22期)。
[0003]水蛭素為水溶性生物大分子，脂溶性差，進(jìn)入體內(nèi)后主要分布于細(xì)胞外液，不易透過血腦屏障，易降解，不與血漿蛋白結(jié)合(中草藥，2003年第34卷第8期)。這些特性使水蛭素較難通過胃腸黏膜有效吸收，因此其給藥途徑主要為注射給藥。但水蛭素在血漿中的消除半衰期不到1小時，這對需要長期抗凝的患者帶來很大不便。采用脂質(zhì)體包封水蛭素是一種改善水蛭素生物利用度的有效手段(中國中藥雜志，2007年第32卷第9期)，但由于包封率、粒徑等問題，目前水蛭素脂質(zhì)體多用于黏膜給藥途徑。因此，研發(fā)一種確有療效、可注射給藥、藥效持久的水蛭素藥物組合物成為本領(lǐng)域技術(shù)人員不懈追求的目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種水蛭素磷脂復(fù)合物。
[0005]本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供上述水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法。
[0006]本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供上述水蛭素磷脂復(fù)合物的應(yīng)用。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0008]一種水蛭素磷脂復(fù)合物，由水蛭素和磷脂組成，所述水蛭素和磷脂的摩爾比為1:1(以平均分子量計)，所述水蛭素磷脂復(fù)合物是由下述方法制備得到的:
[0009](1)將水蛭素溶于乙醇中，得到第一溶液，其中，所述水蛭素和乙醇的用量比為1:5-30 (g/mL)；
[0010](2)將磷脂以非質(zhì)子溶劑溶解，得到第二溶液，其中，所述磷脂和非質(zhì)子溶劑的用量比為1:10-200 (g/mL)，所述非質(zhì)子溶劑為四氫呋喃、三氯甲烷、甲醇、乙醚或二氧六環(huán)中任一種、或幾種的任意濃度的任意組合:
[0011](3)攪拌條件下將第一溶液與第二溶液充分混合，除去有機(jī)溶劑，加入甘露醇水溶液，溶解，過濾，冷凍干燥即得。
[0012]上述水蛭素磷脂復(fù)合物，所述水蛭素可以是以各種方法分離提取得到的天然水蛭素，也可以是以生物技術(shù)合成的重組水蛭素。[0013]上述水蛭素磷脂復(fù)合物，所述磷脂可以是供注射用的大豆磷脂，也可以是供注射用的蛋黃卵磷脂。
[0014]優(yōu)選的，上述水蛭素磷脂復(fù)合物，所述乙醇為體積濃度70-90% (v/v)的乙醇水溶液。
[0015]一種水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，具體步驟如下:
[0016](I)將水蛭素溶于乙醇中，得到第一溶液，其中，所述水蛭素和乙醇的用量比為1:5-30 (g/mL)；
[0017](2)將磷脂以非質(zhì)子溶劑溶解，得到第二溶液，其中，所述磷脂和非質(zhì)子溶劑的用量比為1:10-200 (g/mL)，所述非質(zhì)子溶劑為四氫呋喃、三氯甲烷、甲醇、乙醚或二氧六環(huán)中任一種、或幾種的任意濃度的任意組合:
[0018](3)攪拌條件下將第一溶液與第二溶液充分混合，其中，所述水蛭素和磷脂的摩爾比為1:1 (以平均分子量計)，除去有機(jī)溶劑，加入甘露醇水溶液，溶解，過濾，冷凍干燥即得。
[0019]優(yōu)選的，上述水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，所述步驟(1)中乙醇的體積濃度為70-90% (v/v)。
[0020]優(yōu)選的，上述水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，所述步驟(3)中第一溶液與第二溶液充分混合的反應(yīng)溫度為室溫至水蛭素溶液和磷脂溶液的混合液的沸騰溫度，以實(shí)現(xiàn)加熱回流。
[0021]優(yōu)選的，上述水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，所述步驟(3)中第一溶液與第二溶液充分混合的反應(yīng)時間為5min-2h。
[0022]優(yōu)選的，上述水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，所述步驟(3)中除去有機(jī)溶劑的方法為減壓蒸餾法或常壓蒸餾法。
[0023]優(yōu)選的，上述水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，所述步驟(3)中甘露醇水溶液的用量(以HiL計)為水蛭素和磷脂質(zhì)量總和(以g計)值的5倍-20倍。
[0024]優(yōu)選的，上述水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，所述步驟(3)中甘露醇水溶液中甘露醇的濃度為1-20% (g/mL)。
[0025]優(yōu)選的，上述水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，所述步驟(3)中過濾為過濾精度為
0.22 μ m以上的除菌過濾。
[0026]優(yōu)選的，上述水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，所述步驟(3)中冷凍干燥為以除水為目的的冷凍干燥。
[0027]優(yōu)選的，上述水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，具體步驟如下:
[0028](I)將水蛭素溶于80% (v/v)乙醇中，得到第一溶液，其中，所述水蛭素和乙醇的用量比為 1:15 (g/mL)；
[0029](2)將蛋黃卵磷脂以三氯甲烷溶解，得到第二溶液，其中，所述蛋黃卵磷脂和三氯甲烷的用量比為1:50 (g/mL)，所述非質(zhì)子溶劑為四氫呋喃、三氯甲烷、甲醇、乙醚或二氧六環(huán)中任一種、或幾種的任意濃度的任意組合:
[0030] (3)攪拌條件下，將第二溶液滴加至第一溶液中，加熱回流，反應(yīng)30min，水浴加熱揮散溶劑，加入2%甘露醇溶液復(fù)溶，其中，甘露醇水溶液的用量(以mL計)為水蛭素和磷脂質(zhì)量總和(以g計)的5倍，0.22 μ m微孔濾膜過濾，濾液冷凍干燥，得淺黃色水蛭素磷脂復(fù)合物。[0031 ] 上述水蛭素磷脂復(fù)合物在制備用于治療早期糖尿病腎病的藥物方面的應(yīng)用。
[0032]上述水蛭素磷脂復(fù)合物以注射用水復(fù)溶，配成一定濃度，即可用于治療早期糖尿病腎病。
[0033]本發(fā)明的有益效果是:
[0034]上述水蛭素磷脂復(fù)合物，是通過特定的方法制備而成，磷脂是細(xì)胞膜的基本組成物質(zhì)，與細(xì)胞膜的親和力強(qiáng)，當(dāng)水蛭素與卵磷脂以特定用量及特定復(fù)合方式形成磷脂復(fù)合物后，通過分子間力形成的生物大分子，使水蛭素的親脂性和穩(wěn)定性大大提高，磷脂作為藥物載體能促進(jìn)水蛭素更好地從血液轉(zhuǎn)移至各器官組織，進(jìn)入細(xì)胞，在靜脈注射給藥后，水蛭素在腎組織中的生物利用度明顯提高，對改善早期糖尿病腎病病人的腎功能，具有重要的臨床應(yīng)用價值；其制備方法簡單，適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)的需要。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1是水蛭素的紅外光譜圖；
[0036]圖2是大豆磷脂的紅外光譜圖；
[0037]圖3是水蛭素大豆磷脂復(fù)合物的紅外光譜圖；
[0038]圖4是水蛭素和水蛭素磷脂復(fù)合物大鼠尾靜脈注射給藥腎組織透析液中水蛭素藥時曲線；
[0039]圖5是糖尿病腎病大鼠腎組織病理切片；
[0040]圖6是糖尿病腎病大鼠腎組織TGF- β免疫組化切片；
[0041 ] 圖7是糖尿病腎病大鼠腎組織VEGF免疫組化切片。
【具體實(shí)施方式】
[0042]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。
[0043]實(shí)施例1
[0044]稱取0.7g水蛭素,溶于3.5mL90%乙醇。另取0.08g大豆磷脂,溶于16mL甲醇。攪拌下，將水蛭素的乙醇溶液滴加至大豆磷脂的甲醇溶液中，加熱回流，反應(yīng)2h，減壓除去溶劑，加入4mL20%甘露醇水溶液復(fù)溶，0.22 μ m微孔濾膜過濾，濾液冷凍干燥，得類白色水蛭素磷脂復(fù)合物1.02g,收率64%。
[0045]實(shí)施例2
[0046]稱取2g水蛭素，溶于60mL70%乙醇。另取0.23g大豆磷脂，溶于2.3mL四氫呋喃。攪拌下，將大豆磷脂的四氫呋喃溶液滴加至水蛭素的乙醇溶液中，加熱回流，反應(yīng)5min，減壓除去溶劑，加入44.6mLl%甘露醇溶液復(fù)溶，0.22 μ m微孔濾膜過濾，濾液冷凍干燥，得淺黃色水蛭素磷脂復(fù)合物2.42g，收率90%。
[0047]實(shí)施例3
[0048]稱取1.2g水蛭素，溶于18mL80%乙醇。另取0.14g蛋黃卵磷脂，溶于7mL三氯甲烷。攪拌下，將蛋黃卵磷脂的三氯甲烷溶液滴加至水蛭素的乙醇溶液中，加熱回流，反應(yīng)30min，水浴加熱揮散溶劑，加入6.7mL2%甘露醇溶液復(fù)溶，0.22 um微孔濾膜過濾，濾液冷凍干燥，得淺黃色水蛭素磷脂復(fù)合物1.37g，收率93%。
[0049] 實(shí)施例4[0050]稱取1.4g重組水蛭素，溶于14mL85%乙醇。另取0.16g蛋黃卵磷脂，溶于16mL乙醚。攪拌下，將重組水蛭素的乙醇溶液滴加至蛋黃卵磷脂的乙醚溶液中，室溫反應(yīng)lh，水浴加熱揮散溶劑，加入15.6mL4%甘露醇溶液復(fù)溶，0.22 μ m微孔濾膜過濾，濾液冷凍干燥，得類白色重組水蛭素磷脂復(fù)合物2.13g，收率84%。
[0051]實(shí)施例5
[0052]稱取4.2g重組水蛭素，溶于80mL75%乙醇。另取0.48g蛋黃卵磷脂，溶于25mL 二氧六環(huán)。攪拌下，將蛋黃卵磷脂的二氧六環(huán)溶液滴加至重組水蛭素的乙醇溶液中，室溫反應(yīng)1.5h，減壓蒸除溶劑，加入70mL10%甘露醇溶液復(fù)溶，0.22 μ m微孔濾膜過濾，濾液冷凍干燥，得類白色重組水蛭素磷脂復(fù)合物7.58g,收率65%。
[0053]實(shí)施例6
[0054]分別取0.1g水蛭素、0.1大豆磷脂和相當(dāng)于0.1g水蛭素的實(shí)施例3所述水蛭素磷脂復(fù)合物，與適量溴化鉀混合壓片，置于紅外光譜儀中，于400-4000(3!^1掃描。如圖1、圖2和圖3所示，對比水蛭素與水蛭素磷脂復(fù)合物的紅外光譜圖可知，1439cm-1的碳氮伸縮振動峰在復(fù)合物中的峰強(qiáng)明顯強(qiáng)于水蛭素中的峰強(qiáng)，且峰變寬，可能由于磷脂中磷脂酰膽堿結(jié)構(gòu)中的季銨氮的強(qiáng)吸電誘導(dǎo)效應(yīng)致使原來C-N鍵上的共軛電子數(shù)增加，從而導(dǎo)致C-N鍵的吸收增強(qiáng)，并引起C-N鍵的吸收峰藍(lán)移(3CHT1)，由此說明，水蛭素磷脂酰膽堿復(fù)合物已形成，同時，由于水蛭素蛋白中的酰胺I帶(1629(3!^1)和酰胺II帶(1558(3!^1)在復(fù)合前后的峰強(qiáng)和峰位均未發(fā)生變化，表明水蛭素蛋白的一級α -螺旋結(jié)構(gòu)及維持和穩(wěn)定空間構(gòu)象的二硫鍵、氫鍵均未被破壞，表明水蛭素的活性在復(fù)合之后應(yīng)該未受影響。
[0055]實(shí)施例7
[0056]分別稱取約IOmg水蛭素與實(shí)施例3所述相當(dāng)于IOmg水蛭素的水蛭素磷脂復(fù)合物，溶于ΡΗ6.86磷酸鹽緩沖液中，置于50、55、60、65°C恒溫水浴中，于60、120、180、240分鐘取樣，以異丙醇稀釋至約50 μ g/mL，依下述高效液相色譜條件測定不同溫度下溶液中水蛭素的濃度變化，根據(jù)經(jīng)典恒溫加速實(shí)驗(yàn)法阿倫尼烏斯方程計算得水蛭素的半衰期為0.96h，水蛭素磷脂復(fù)合物的半衰期為16.62小時。與磷脂復(fù)合后，水蛭素的半衰期增加了 17倍。
[0057]色譜條件:色譜柱KromasiI C18 (250 X 4.6mm，5 μ m)，流動相:乙腈-甲醇-水-甲酸(20:55:24:1),柱溫 300C，流速 lmL/min,檢測波長 276nm。
[0058]實(shí)施例8
[0059]健康雄性Wistar大鼠8只，隨機(jī)分成2組，每組4只。大鼠禁食12h后，水合氯醛麻醉，沿左側(cè)肋下縱切開腎前皮膚，切口約1cm，從背部向前擠壓，令左腎從切口處游離至皮外，以充滿肝素的線狀透析針(截留分子量10萬)在腎皮質(zhì)部位穿刺，保持針距腎表皮約1mm，透析液為超純水，流速為200yL/h。平衡Ih后，尾靜脈注射給藥:水蛭素組尾靜脈注射0.5mL水蛭素生理鹽水溶液(含水蛭素0.lmg/mL)，復(fù)合物組尾靜脈注射0.5mL實(shí)施例3所述水蛭素磷脂復(fù)合物生理鹽水溶液(以水蛭素計0.lmg/mL)。每0.5h收集的透析液以ELISA法測定水蛭素含量。將測得的腎臟組織透析液中的水蛭素含量以PK Solverf.0軟件處理，得藥時曲線如圖4所示,藥代動力學(xué)參數(shù)如表1所示。
[0060]表1水蛭素和水蛭素磷脂復(fù)合物大鼠尾靜脈注射給藥
[0061] 腎組織透析液中水蛭素的藥代動力學(xué)參數(shù)
【權(quán)利要求】
1.一種水蛭素磷脂復(fù)合物，其特征在于:由水蛭素和磷脂組成，所述水蛭素和磷脂的摩爾比以平均分子量計為1:1，所述水蛭素磷脂復(fù)合物是由下述方法制備得到的: (1)將水蛭素溶于乙醇中，得到第一溶液，其中，所述水蛭素和乙醇的用量比按g/mL計為 1:5-30 ； (2)將磷脂以非質(zhì)子溶劑溶解，得到第二溶液，其中，所述磷脂和非質(zhì)子溶劑的用量比按g/mL計為1:10-200，所述非質(zhì)子溶劑為四氫呋喃、三氯甲烷、甲醇、乙醚或二氧六環(huán)中任一種、或幾種的任意濃度的任意組合； (3)攪拌條件下將第一溶液與第二溶液充分混合，除去有機(jī)溶劑，加入甘露醇水溶液，溶解，過濾，冷凍干燥即得。
2.權(quán)利要求1所述的水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，其特征在于:具體步驟如下: (1)將水蛭素溶于乙醇中，得到第一溶液，其中，所述水蛭素和乙醇的用量比按g/mL計為 1:5-30 ； (2)將磷脂以非質(zhì)子溶劑溶解，得到第二溶液，其中，所述磷脂和非質(zhì)子溶劑的用量比按g/mL計為1:10-200，所述非質(zhì)子溶劑為四氫呋喃、三氯甲烷、甲醇、乙醚或二氧六環(huán)中任一種、或幾種的任意濃度的任意組合: (3)攪拌條件下將第一溶液與第二溶液充分混合，其中，所述水蛭素和磷脂的摩爾比以平均分子量計為1:1，除去有機(jī)溶劑，加入甘露醇水溶液，溶解，過濾，冷凍干燥即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中乙醇的體積濃度為70-90% (v/v)0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中第一溶液與第二溶液充分混合的反應(yīng)時間為5min-2h。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中甘露醇水溶液的用量以毫升計為水蛭素和磷脂質(zhì)量總和值以克計的5-20倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中甘露醇水溶液中甘露醇的濃度按g/mL計為1-20%。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中過濾為過濾精度為0.22 μ m以上的除菌過濾。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水蛭素磷脂復(fù)合物的制備方法，其特征在于:具體步驟如下: (1)將水蛭素溶于80%(v/v)乙醇中，得到第一溶液，其中，所述水蛭素和乙醇的用量比按g/mL計為1:15 ; (2)將蛋黃卵磷脂以三氯甲烷溶解，得到第二溶液，其中，所述蛋黃卵磷脂和三氯甲烷的用量比按g/mL計為1:50 ； (3)攪拌條件下，將第二溶液滴加至第一溶液中，加熱回流，反應(yīng)30min，水浴加熱揮散溶劑，加入2%甘露醇溶液復(fù)溶，其中，甘露醇水溶液的用量以毫升計為水蛭素和磷脂質(zhì)量總和值以克計的5倍，0.22 μ m微孔濾膜過濾，濾液冷凍干燥，得淺黃色水蛭素磷脂復(fù)合物。
9.權(quán)利要求1所述的水蛭素磷脂復(fù)合物在制備用于治療早期糖尿病腎病的藥物方面的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P13/12GK103908678SQ201410157962
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】王洪武, 國大亮, 孟靜巖, 邊育紅, 王玉興, 楊錦惠, 鄭紡, 田露, 張賀翔 申請人:天津中醫(yī)藥大學(xué)