一種能共傳輸藥物和基因的納米囊泡、制造方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種能共傳輸藥物和基因的納米囊泡、制造方法及其應(yīng)用，該納米囊泡的成分為聚乙烯亞胺-b-聚天冬氨酸（二異丙基乙二胺/半胱胺酸），其制備方法是先用正丁胺引發(fā)天冬氨酸芐酯-N-羧基內(nèi)酸酐開環(huán)聚合得聚天冬氨酸芐酯，將末端氨基羧基化后再經(jīng)二異丙基乙二胺和半胱胺酸混合氨解得到末端羧基化的聚天冬氨酸（二異丙基乙二胺/半胱胺酸），最后通過酰胺化反應(yīng)得到聚乙烯亞胺-b-聚天冬氨酸（二異丙基乙二胺/半胱胺酸）。本發(fā)明的納米囊泡可作為親水性藥物與基因的共輸送載體，囊泡的疏水層具有酸敏響應(yīng)性，同時用于囊泡疏水層捆綁交聯(lián)的二硫鍵兼具還原敏感性，納米囊泡外層的聚乙烯亞胺層具有質(zhì)子緩沖效應(yīng)，因此有智能釋放基因和藥物的特點。
【專利說明】一種能共傳輸藥物和基因的納米囊泡、制造方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于高分子化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體是涉及一種可作為傳輸新型藥物和基因的雙載體材料的納米囊泡和其制造方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤嚴重威脅著人類的生存健康，對于癌癥的治療是目前最具有挑戰(zhàn)性的課題之一。目前臨床上多采用外科手術(shù)進行治療，但這通常適用于腫瘤還沒有開始向全身擴散的情況。放療和化療的應(yīng)用顯著提高了惡性腫瘤的治療效果。其中化療對于各種血液惡性腫瘤、胚細胞瘤等具有相當大的治療潛力，但是化療藥物對正常組織和器官的毒副作用是困擾腫瘤化療的主要問題。此外，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是人類基因庫的建立和人類疾病相關(guān)基因的闡明，癌癥的基因療法也應(yīng)運而生。目前多采用裸DNA注射法，即將質(zhì)粒DNA或RNA直接注入靶組織的方法，但由于體內(nèi)核酸酶等對DNA的降解作用，基因表達的時間很短，嚴重影響治療效果。研究表明，將基因治療與藥物治療這兩種手段結(jié)合起來，可以起到相互促進、相互結(jié)合的效果。例如，目前新興的“自殺”基因療法，即將無毒的抗腫瘤前藥與相應(yīng)的“自殺”基因結(jié)合起來，待基因成功轉(zhuǎn)染進入腫瘤細胞后，表達的酶可以將抗腫瘤前藥轉(zhuǎn)化為高毒性的化療藥物，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的選擇性殺傷，避免了對正常細胞的損害。要解決目前臨床上化療及基因治療面臨的問題并實現(xiàn)藥物與基因協(xié)同治療，關(guān)鍵在于構(gòu)建行之有效的藥物/基因共輸送載體。該載體要能夠?qū)①|(zhì)粒DNA安全輸送到腫瘤細胞的胞漿中，避免體內(nèi)核酸酶的降解；同時將化療藥物或前藥安全有效地遞送至腫瘤部位使其發(fā)揮作用。
[0003]腫瘤組織與正常組織存在生理性差異，如腫瘤血管內(nèi)皮細胞間隙大及腫瘤部位淋巴循環(huán)受限，導(dǎo)致納米粒子在腫瘤部位的增強滲透存在滯留(Enhanced permeability andretention)效應(yīng)(EPR效應(yīng))。因此,納米藥物載體可以通過EPR效應(yīng)被動祀向富集于腫瘤部位。此外，納米藥物載體還具有很多傳統(tǒng)藥物載體不具備的其他優(yōu)點:能形成納米顆粒包裹、濃縮、保護基因/藥物，使其免遭生物酶的降解；比表面積大，具有生物親和性，易于在其表面進行修飾，偶聯(lián)靶向分子，實現(xiàn)對腫瘤的主動靶向識別；在循環(huán)系統(tǒng)中的循環(huán)時間明顯延長且不易被巨噬細胞清除；能夠?qū)崿F(xiàn)藥物/基因的控制釋放，提高基因/藥物的生物利用度；代謝產(chǎn)物少、副作用小，無免疫排斥反應(yīng)等。因此，多功能納米藥物載體的研發(fā)，被認為是解決目前化療和基因治療面臨問題的有效途徑，也是目前癌癥治療方面的一個重要研究領(lǐng)域。納米載體的理化性能，如表面修飾、粒徑和形貌、化學(xué)組成、表面電位等參數(shù)是影響納米粒子的EPR效應(yīng)(被動靶向性能)和主動靶向性能的關(guān)鍵因素，而聚合物納米藥物載體可以實現(xiàn)對以上參數(shù)的有效調(diào)控因此受到研究者的親睞。
[0004]目前，單獨遞送藥物或基因的納米載體方面的研究較多，而同時輸送藥物/基因的納米載體還鮮見報道。藥物載體目前面臨的最大問題是血液循環(huán)時結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定及到達腫瘤部位后釋藥緩慢，前者影響納米粒子在腫瘤部位的有效富集并造成藥物丟失，進而削弱抑瘤效果且增加毒副作用；后者降低了藥物的生物利用度并可能誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥，影響后期治療。一方面，可以采用還原敏感的二硫鍵對納米載體進行交聯(lián)捆綁，這是提高納米粒子血液穩(wěn)定性的有效手段，且二硫鍵在腫瘤細胞溶酶體內(nèi)高的谷胱甘肽濃度下會快速斷裂，有助于納米粒子在腫瘤細胞內(nèi)解體；另一方面，可以采用具有刺激響應(yīng)功能的聚合物構(gòu)建納米載體，賦予納米載體在腫瘤內(nèi)環(huán)境的刺激響應(yīng)下快速釋藥。目前，研究者多采用陽離子聚合物傳輸基因，陽離子聚合物鏈通過靜電作用與基因的磷酸鹽骨架復(fù)合后形成納米粒子，然而這樣形成的納米粒子的粒徑難以控制，粒徑分散寬，且容易聚集沉淀，不利于體內(nèi)應(yīng)用。而將聚合物組裝成納米膠束或囊泡后再進行基因的負載就可以有效地解決上述問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對上述存在問題和不足，提供一種可作為傳輸藥物和基因的雙載體材料，能實現(xiàn)基因的有效轉(zhuǎn)染及瘤內(nèi)暴釋藥物，且二硫鍵交聯(lián)捆綁穩(wěn)定的酸敏響應(yīng)型的納米囊泡及其制造方法。
[0006]在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明進一步的目的是提供一種納米囊泡作為藥物和基因雙載體材料中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的:
本發(fā)明所述的能共傳輸藥物和基因的納米囊泡，其特點是該納米囊泡為由表層的聚乙烯亞胺和中間層的聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)構(gòu)成且中間層帶有可交聯(lián)巰基的聚乙烯亞胺_b-聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)納米囊泡，該納米囊泡的中間層為疏水層，該疏水層具有酸敏響應(yīng)性，能發(fā)生PH值敏感的親-疏水性的轉(zhuǎn)換；同時，用于中間層交聯(lián)捆綁的巰基(二硫鍵)具有還原敏感性；此外，該納米囊泡外層的聚乙烯亞胺層具有質(zhì)子緩沖效應(yīng)，能用于基因的傳輸，實現(xiàn)基因的溶酶體逃逸。
[0008]其中，上述聚乙烯亞胺為支化型，其數(shù)均分子量為600 Da，上述聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)的數(shù)均分子量為I~10 KDa0
[0009]本發(fā)明所述的能共傳輸藥物和基因的納米囊泡的制造方法，其特點是包括如下步驟:
A、用正丁胺為引發(fā)劑，引發(fā)β-天門冬氨酸芐酯N-羧酸酐聚合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液沉淀、抽濾和洗滌后，真空干燥得到聚合物聚天冬氨酸芐酯；
B、采用馬來酸酐對聚天冬氨酸芐酯末端的氨基進行羧基化反應(yīng)，并將反應(yīng)得到的產(chǎn)物冷凍干燥后，得到白色粉末狀的羧基化聚天冬氨酸芐酯；
C、將羧基化聚天冬氨酸芐酯經(jīng)二異丙基乙二胺和半胱胺酸混合氨解反應(yīng)后，將反應(yīng)物透析、旋干，得到羧基化聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸);
D、在催化劑的催化下，將羧基化聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)進行酰胺化反應(yīng)，并將反應(yīng)液透析、濃縮和抽干后，得到聚合物聚乙烯亞胺-b_聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸);
E、將聚乙烯亞胺 -b-聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)溶于有機溶劑中，并在超聲作用下將溶液滴至PH值為9的緩沖溶液中，通氧氣2 h后，在pH值為7.4的緩沖溶液中透析三天，得到含有聚乙烯亞胺_b-聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)納米囊泡的溶液。其中，上述催化劑為1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。
[0010]其中，上述有機溶劑為二甲基亞砜(DMSO)或二甲基酰胺(DMF)或甲醇。
[0011]本發(fā)明所述的納米囊泡在傳輸藥物和基因中的應(yīng)用，其特點是應(yīng)用方法如下: 首先將聚乙烯亞胺_b-聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)納米囊泡作為載體與
親水性抗腫瘤前藥按一定的比例混合共同形成為原料，然后將原料溶于有機溶劑中配制成溶液，在超聲作用下將制得的溶液滴加至PH值為9的緩沖溶液中，通氧氣，再經(jīng)過透析除去未包裹的藥物及有機溶劑，最后將溶液的PH值調(diào)至7.4，即得到載藥納米囊泡；將載藥納米囊泡與質(zhì)粒DNA按照聚合物中氨基與質(zhì)粒DNA中磷酸根的一定摩爾比(即N/P比)混合均勻后振蕩15秒，于室溫靜置后得到載藥-基因納米囊泡。
[0012]其中，上述聚乙烯亞胺_b-聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)納米囊泡可用于癌癥自殺基因療法如5-氟胞嘧啶(5-FC)和胞嘧啶脫氨酶(CD)基因的輸送。在自組裝過程中，PAsp (DIP/MEA)段自發(fā)地形成囊泡的疏水中間層，在通氧條件下囊泡被二硫鍵交聯(lián)捆綁穩(wěn)定，⑶基因被壓縮包裹于囊泡外表面的PEI層，囊泡親水腔內(nèi)含有抗腫瘤前藥(5-氟胞嘧啶，可簡寫為5-FC)。
[0013]上述聚乙烯亞胺-b-聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)納米囊泡與親水性抗腫瘤前藥的重量份數(shù)比為(10~1000):1，優(yōu)選的重量份數(shù)比為(10~20):1。
[0014]上述載藥納米囊泡與質(zhì)粒DNA按照聚合物中氨基與質(zhì)粒DNA中磷酸根的摩爾比為(0.1~40):1，優(yōu)選的摩爾比為(4~10):1。
[0015]上述有機溶劑為D MSO或二甲基酰胺(DMF)或甲醇，其體積為原料重量的5~1000倍。
[0016]上述緩沖溶液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
(O該納米囊泡由聚天冬氨酸類化合物制成，因此具有良好的生物相容性；
(2)該納米囊泡的疏水層由可逆的二硫鍵交聯(lián)捆綁，使得該囊泡在復(fù)雜的血液環(huán)境中具有良好的穩(wěn)定性；交聯(lián)的巰基(二硫鍵)能通過還原劑谷胱甘肽(GSH)打開，即該納米膠束具有還原敏感響應(yīng)性，且組成囊泡的聚天冬氨酸二異丙基乙二胺段具有酸敏響應(yīng)性，因此可以實現(xiàn)腫瘤細胞溶酶體內(nèi)的刺激響應(yīng)釋藥；
(3)該囊泡表面的PEI層的質(zhì)子緩沖效應(yīng)有利于所負載的基因內(nèi)吞進入細胞后進行溶酶體逃逸，避免了酶對基因的降解作用；
(4)該載藥/基因納米囊泡的平均粒徑為113nm，可以實現(xiàn)腫瘤部位的被動靶向聚集；
(5)表面電位為弱的正電性,有利于細胞內(nèi)吞。
[0018]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明實施例1中空白納米囊泡的透射電鏡圖。
[0020]圖2為本發(fā)明實施例1中空白納米囊泡的粒徑分布圖。
[0021 ] 圖3為本發(fā)明實施例1中pH 7.4加GSH打開二硫鍵后納米囊泡解體后的透射電鏡圖。
[0022]圖4為本發(fā)明實施例1中pH 7.4加GSH打開二硫鍵后納米囊泡解體后的粒徑分布圖。
[0023]圖5為本發(fā)明實施例2中載藥/基因納米囊泡的透射電鏡圖(N/P=10)。
[0024]圖6為本發(fā)明實施例2中載藥/基因納米囊泡的粒徑分布圖(N/P=10)。
[0025]圖7為本發(fā)明實施例4中載基因納米囊泡的Zeta電位及粒徑隨N/P比的變化圖。
[0026]圖8為本發(fā)明實施例4中載基因納米囊泡的凝膠阻滯電泳圖。
[0027]圖9為本發(fā)明實施例5中納米囊泡的拉曼光譜圖。
[0028]圖10為本發(fā)明實施例6中載藥/基因納米囊泡的藥物體外釋放曲線。
[0029]圖11為本發(fā)明實施例7中載藥/基因納米囊泡轉(zhuǎn)染后的倒置熒光顯微鏡圖。
[0030]圖12為本發(fā)明實施例7中載藥/基因納米囊泡基因轉(zhuǎn)染率的流式細胞儀檢測圖。
[0031]圖13為本發(fā)明實施例8中基因表達隨載基因納米囊泡濃度的變化圖。
[0032]圖14為本發(fā)明實施例8中載基因納米囊泡及載藥/基因納米囊泡的基因表達水平圖。
[0033]圖15為本發(fā)明實施例9中空納米囊泡、單獨載藥或基因的納米囊泡的細胞毒性圖。
[0034]圖16為本發(fā)明實施例9中載藥/基因納米囊泡的細胞毒性圖。
[0035]其中，BLA-NCA為β -天門冬氨酸芐酯N-羧酸酐、PBLA為聚天冬氨酸芐酯、PBLA-C00H為羧基化聚天冬氨酸芐酯、PAsp (DIP/MEA)-COOH為羧基化聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)、PE1-PAsp (DIP/MEA)為聚乙烯亞胺_b_聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺 / 半胱胺酸)、PPDM/pCMVCD 為負載 pCMVCD 的 PE1-PAsp (DIP/MEA)納米囊泡、PPDM/pEGFP為負載pEGFP的PE1-PAsp (DIP/MEA)納米囊泡、PPDM/5-FC為負載5-FC的納米囊泡。
【具體實施方式】
[0036]以下通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，實施例中除特殊說明外均為本領(lǐng)域常規(guī)步驟。
[0037] 本發(fā)明基于兩親性共聚物PE1-PAsp (DIP/MEA)的納米囊泡被用于抗腫瘤前藥/“自殺”基因一 5-FC/pCMVCD的共傳輸，所得納米囊泡的大小、形狀等基本性能分別采用動態(tài)光散射、透射電子顯微鏡等來測定，其對抗腫瘤前藥5-FC的包負能力及pCMVCD基因的復(fù)合性能則分別采用紫外可見分光光度計和凝膠阻滯電泳進行測定，并通過倒置熒光顯微鏡及流式細胞技術(shù)儀測定C6腦膠質(zhì)瘤細胞中納米囊泡對pCMVCD基因的轉(zhuǎn)染性能，通過熒光定量PCR測定pCMVCD基因轉(zhuǎn)染后在mRNA水平上的表達情況，最后空納米囊泡的細胞毒性及載藥/基因的納米囊泡對腫瘤細胞的殺傷效果均采用經(jīng)典的四唑鹽(MTT)法進行分析。
[0038]以下實施例中，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)實驗試劑和操作步驟。實施例中緩沖溶液以PH值表示，如pH 5.0的緩沖液是指磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH 7.4的緩沖液為磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH 9的緩沖液指碳酸鹽緩沖液。其中，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 5.0)配制方法為:將濃度為0.2 mo I/L磷酸氫二鈉水溶液103 mL和濃度為0.1 mo I/L檸檬酸溶液97 mL混合，即得。磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)的配制方法為:稱取氯化鈉80 g，氯化鉀2 g，十二水合磷酸氫二鈉23.13 g，磷酸二氫鉀2 g于1000 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至1000 mL，搖均，將所得溶液稀釋10倍后使用。碳酸鹽緩沖液(pH 9)配制方法為:稱取無水碳酸鈉10.6 g及碳酸氫鈉75.6 g溶于蒸懼水中稀釋至1000 mL。[0039]實施例1 PE1-PAsp (DIP/MEA)納米囊泡的制備
1.聚合物PBLA的制備:
該聚合物以正丁胺為引發(fā)劑，通過BLA-NCA的開環(huán)聚合反應(yīng)得到。取2.49 gBLA-NCA (0.01 mol)加至100 mL反應(yīng)瓶中，加入6 mL DMF進行溶解，然后再加入60 mL無水CH2Cl2，充分搖勻。之后加入20 μ L正丁胺(0.0002 mol)，充分搖勻后密封，于35° C攪拌反應(yīng)72 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液滴入過量的冷乙醚(如500 mL)中沉淀，經(jīng)抽濾和無水乙醚的反復(fù)洗滌，真空干燥得到最終產(chǎn)物；
2.聚合物PBLA-C00H的制備:
稱取2.06 g Ba-PBLA (0.2 mmol)加于100 mL三口瓶中，于80 ° C真空干燥5 h,加入20mL新蒸的氯仿(CHCl3),待其溶解后再加入0.2 g 丁二酸酐(2 mmol，~10 eq.)，70 ° C攪拌回流反應(yīng)48 h。反應(yīng)完畢后，往反應(yīng)瓶加入20 mL高純水，再繼續(xù)40 ° C攪拌回流反應(yīng)0.5h，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，把水倒掉，再重復(fù)一次。這樣，利用熱水法將未反應(yīng)的丁二酸酐水解成丁二酸而溶于水，聚合物不溶于水，達到去除丁二酸酐的目的。產(chǎn)品冷凍干燥后得到白色粉末狀固體；
3.聚合物PAsp (DIP/MEA) -COOH 的制備:
稱取1.56 g PBLA-C00H(0.15 mmol)于10 mL反應(yīng)管，加入5 mL DMSO進行溶解。加入
1.04 mL N, N-二異丙基乙二胺(6 mmol,~40 eq),充分搖勻,密封后置于40 ° C油浴攪拌加熱12 ho然后再加入半胱胺鹽酸鹽0.51 g(4.5 mmol,~30 eq.)和0.65 mL三乙胺(4.5mmol,~30eq.)。于35 °C下充分攪拌反應(yīng)12 h。反應(yīng)完畢，將反應(yīng)物在甲醇中透析、旋干，得到終產(chǎn)物；
4.聚合物PE1-PAsp (DIP/MEA)的制備:
稱取 1.31 g PAsp (DIP/MEA)-C00H (0.12 mmol)于 10 mL 反應(yīng)瓶中，加入 4 mL DMSO 和 4mL CHCl3 進行溶解，然后加入 0.034 g EDC.HCl (0.18 mmol,~1.5 eq)和 0.021 g NHS (0.18mmol,~1.5 eq)，充分搖均溶解，反應(yīng) 30 min 后加入 0.079 g PEI (0.13 mmol,~1.1 eq)，搖均。密封反應(yīng)瓶，室溫反應(yīng)48 h。然后將反應(yīng)液裝在1000 Da在無水甲醇中透析。透析完畢，經(jīng)濃縮、抽干得到最終產(chǎn)物；
5.PE1-PAsp (DIP/MEA)納米囊泡的制備
將 10 mg 聚合物 PE1-PAsp (DIP/MEA) (11525 g/mol)溶于 ImL DMSO 中，在超聲下滴至 10mL PBS (pH 9)中，將該溶液通氧氣2 h后，在PBS (pH 7.4)中透析三天，得到PE1-PAsp (DIP/MEA)納米囊泡溶液。
[0040]所得PE1-PAsp (DIP/MEA)納米囊泡的形態(tài)通過透射電子顯微鏡來觀察，粒徑大小則采用動態(tài)光散射系統(tǒng)進行測量，測試結(jié)果分別見圖1和圖2。從透射電子顯微鏡圖片可以明顯地看出嵌段聚合物在水溶液中自組裝成“空心球”；從動態(tài)光散射圖可以看出，空白納米囊泡的粒徑為60~130 nm,平均粒徑為93 nm。
[0041]如果將膠束PBS (pH 7.4)溶液的pH值用HCl溶液調(diào)至5.0后，再加入10 mM的谷胱甘肽(GSH)，囊泡會發(fā)生解體，其形態(tài)則通過透射電子顯微鏡來觀察，結(jié)果見圖3。囊泡的解體從動態(tài)光散射圖中也可印證(如圖4所示)，粒徑變?yōu)? nm左右的聚集體。
[0042]實施例2載藥物-基因納米囊泡的制備
將I mg 5-FC和10 mg PE1-PAsp (DIP/MEA)溶于I mL DMSO中，冰浴超聲作用下滴入10mL pH 7.4的鹽酸緩沖溶液中，通氧交聯(lián)兩個小時后，將所制得的囊泡溶液在pH 7.4的水中透析三天除去DMSO，采用450 nm的濾膜過濾除去其中大的聚集體，采用截留分子量10 KDa的超濾管超濾除去殘留的少量5-FC，得到載5-FC的納米囊泡；
按照聚合物中氨基與質(zhì)粒DNA中磷酸根的摩爾比(即N/P比)為10:1，將CD基因與負載5-FC的PE1-PAsp (DIP/MEA)囊泡溶液混合均勻后振蕩15 S后于室溫靜置30 min，從而得到同時負載5-FC和⑶的納米囊泡。
[0043]所得載藥物-基因納米囊泡的形貌通過透射電子顯微鏡觀察，結(jié)果見圖5。納米囊泡負載藥物和基因后對形貌幾乎沒有影響，仍呈結(jié)構(gòu)規(guī)整的圓球狀。載藥物/基因納米囊泡的粒徑大小采用動態(tài)光散射系統(tǒng)進行測量，結(jié)果見圖6。從動態(tài)光散射圖可以看出，載藥物/基因納米囊泡的平均粒徑為113 nm,比空囊泡略大。
[0044]實施例3納米囊泡的載藥率和包封率的測定
通過測量一系列已知濃度的5-FC溶液的紫外光譜圖計算出吸光度對濃度的標準曲線(Y=0.000149+0.04347X, R=0.99994)，將凍干的負載樣品溶解在pH值為5的PBS緩沖液中，采用紫外可見分光光度計測定該樣品溶液在275nm處的吸光度。將吸光度值代入標準曲線方程計算得到5-FC濃度，由此得出樣品中5-FC的含量，根據(jù)凍干樣品容器和凍干后樣品的總質(zhì)量得到干品質(zhì)量，從而算出載藥率與包封率，計算公式如下:
載藥量=囊泡中5-FC的含量/囊泡的質(zhì)量X 100%
包封率=囊泡中5-FC的含量/5-FC的投料量X 100% 按照實例2的方法制備交聯(lián)載藥納米膠束，測得載藥納米膠束的載藥量為4.14%，包封率為41.4%ο
[0045]實施例4納米囊泡的基因負載行為測定
采用動態(tài)光散射及Zeta電位儀對按照實例2的方法制備的載CD基因納米囊泡的粒徑及表面電位進行表征，見圖7。隨著N/P比逐漸增大，當N/P比從1/10逐漸增大到2時，復(fù)合物的粒徑迅速減小，從386 nm變?yōu)?33 nm,當N/P > 2時，隨著N/P的增高，復(fù)合物的粒徑逐漸變小最終趨向于與空囊泡的粒徑一致；另一方面，當N/P比逐漸增大，Zeta電位由負值變?yōu)檎岛?，呈現(xiàn)逐漸增大趨勢，并趨向于與空囊泡的表面電位一致，結(jié)合粒徑和電位的變化規(guī)律得出結(jié)論，復(fù)合物在N/P比為2時載體和pDNA基本完全復(fù)合。一方面，表面帶正電的納米粒子能與細胞表面帶負電的蛋白聚糖通過靜電作用相互結(jié)合而易于被細胞內(nèi)吞，然而較高的表面電位也會增加細胞毒性，另一方面，粒徑在100 nm~200 nm的粒子易被細胞內(nèi)吞，因此選擇N/P比10的PPDM/pCMV⑶進行下述的細胞實驗，N/P比為10時復(fù)合物的粒徑為113 nm左右，且表面帶弱的正電(8.47 mV)。
[0046]凝膠阻滯實驗用來進一步驗證納米囊泡負載⑶基因的能力(圖8)。裸DNA在電泳中跑出一如一后兩條條帶，跑在如邊的売度聞的條帶代表活性聞的超螺旋SC構(gòu)型，跑在后邊的亮度很弱的條帶代表無活性或低活性的松弛開環(huán)構(gòu)型OC構(gòu)型。當N/P=4時，載基因囊泡和載藥物/基因的囊泡在凝膠電泳中均已看不到條帶，表明此條件下CD基因已經(jīng)完全被聚合物復(fù)合。而且載基因囊泡和載藥物/基因的囊泡這兩者完全復(fù)合的N/P比基本相同也表明負載5-FC后對囊泡負載基因的能力沒有影響。
[0047]實施例5納米囊泡的交聯(lián)度測定
采用拉曼光譜對囊泡中的二硫鍵進行定性表征，圖9為氧化交聯(lián)后的聚合物囊泡的拉曼光譜，圖中可以清楚的看到位于510 CnT1處的二硫鍵的峰。
[0048]采用Ellman’ s試劑對囊泡中的二硫鍵進行定量測定，測量巰基含量的具體操作方法如下:氮氣保護下配制濃度分別為0、2.5、5、10、20 μ g/mL L-半胱氨酸的PBS (pH 7.4)溶液，向上述各溶液中加入0.6 mL(0.5 mg/mL)的5，5’- 二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB，即Ellman’ s試劑)后室溫反應(yīng)15 min,采用紫外分光光度計測量生成物5-巰基-2-硝基苯甲酸(TNB)在412 nm波長處的吸光度，并對應(yīng)不同L-半胱胺酸的濃度建立標準曲線(Y=0.079X-0.0117，R=0.999，Y-吸光度，X-TNB濃度)。之后，我們對待測囊泡的巰基含量進行測量，測得待測樣品與DTNB反應(yīng)后的紫外吸收度為0.2574，通過已知的標準曲線計算得到樣品中L-半胱氨酸的含量為3.4 μ g/mL (0.0281 μ mol/mL)，即樣品中巰基的含量為
0.0281 μ mol/mL,理論上每個高聚物鏈上含有8個巰基，樣品中含有0.1465 μ mol/mL巰基，經(jīng)計算得到聚合物囊泡中的巰基有80.82%交聯(lián)形成二硫鍵。
[0049]實施例6載藥物/基因納米囊泡的藥物體外釋放
采用透析的方法研究載藥物/基因納米囊泡中5-FC的體外釋放。取實施例2制備的載5-FC/pCMVCD的納米囊泡(lmg/mL) 3 mL轉(zhuǎn)移至透析袋(截留分子量:14000 Da)中，分別裝入含30 mL PBS (pH7.4)緩沖溶液或含30 mL GSH (10 mM)的醋酸鹽緩沖溶液(pH 5.0)廣口瓶中。37 °C恒溫水浴搖床搖動，并間隔一定時間采集透析袋外面的2mL溶液并補充相同體積的緩沖液，275 nm波長處測定5-FC的紫外吸收度，根據(jù)5-FC標準曲線計算囊泡中5-FC的含量。在分析5-FC釋放行為中，以時間對5-FC累積釋放量作圖進行分析研究。其中，所得結(jié)果為三組平行測試實驗的平均值，實驗結(jié)果見圖10。
[0050]選用PBS (pH 7.4)緩沖溶液和含有10 mM谷胱甘肽的醋酸鹽緩沖溶液(pH 5.0)進行實驗是為了模擬載體在血液循環(huán)過程中的生理環(huán)境和載體經(jīng)腫瘤細胞內(nèi)化后溶酶體的酸性還原性環(huán)境。在PH值為7.4緩沖溶液中，5-FC的釋放非常緩慢，24小時的累計釋放量僅為8.6 wt %，說明在pH值為7.4時實施例2制備的納米囊泡是穩(wěn)定的致密的載藥體系。在含有10 mM谷胱甘肽的醋酸鹽緩沖溶液(pH 5.0)中，5-FC顯示出暴釋行為，3小時的累積釋放量已達到70 wt %, 24小時的累計釋放量達到98.34 wt %,這是由于納米囊泡在此條件下發(fā)生解體，所以藥物快速釋放。該實施例說明，交聯(lián)納米囊泡在血液循環(huán)過程中能保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，避免了藥物在輸送過程中泄漏，而納米囊泡到達腫瘤細胞中的酸性溶酶體后發(fā)生解體，快速的釋放藥物，進而提高了藥物利用率及治療效果。
[0051]實施例7載藥/基因納米囊泡的基因轉(zhuǎn)染
首先進行基因轉(zhuǎn)染實驗，選取生長良好的C6細胞和293T細胞細胞種植于24孔培養(yǎng)板中(IXlO4個細胞/孔)，待細胞密度達到70~80%時可進行載體對⑶基因(pCMV⑶)的轉(zhuǎn)染實驗，另轉(zhuǎn)PEGFP作對比。吸出培養(yǎng)基并用PBS將細胞表面清洗干凈，將適量PBS稀釋的PPDM/pCMVCD (載 pCMVCD 的納米囊泡)及 PPDM/EGFP (載 EGFP 的納米囊泡)(含 2 μ g pDNA)后加入到培養(yǎng)孔中，于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4h。吸出培養(yǎng)基并用PBS將細胞表面清洗干凈后，每孔加入400 μ L新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。用倒置熒光顯微鏡觀察基因在細胞內(nèi)的表達情況，轉(zhuǎn)染率采用流式細胞儀測定通過倒置熒光顯微鏡可以直接觀察到細胞所表達的增強型綠色熒光蛋白的熒光強度(圖11)，說明聚合物載體負載PDNA的轉(zhuǎn)染效果良好；通過流式細胞儀定量檢測基因的轉(zhuǎn)染效率，如圖12。在293T細胞中，PPDM/pEGFP組的轉(zhuǎn)染率高達85.7%，PPDM/pCMVCD組的轉(zhuǎn)染率也達到了 73.5%。在C6細胞中，PPDM/pEGFP組的轉(zhuǎn)染率達到了 45.9%，PPDM/pCMV⑶組的轉(zhuǎn)染率也達到了 34.7%。該實驗結(jié)果說明納米囊泡可以有效的轉(zhuǎn)染基因。
[0052]實施例8載藥/基因納米囊泡轉(zhuǎn)染后基因表達量的RT-PCR檢測
按照實施例7，待基因轉(zhuǎn)染完成后進行RNA抽提:(a)倒去培養(yǎng)基后用PBS沖洗幾遍，每孔中加入I mL TRIzoI混勻后靜置10 min。(b)轉(zhuǎn)入離心管中，每管加200 yL氯仿劇烈震蕩后靜置5 min,離心15 min (4 ° C，12000 r/min),樣品出現(xiàn)分層,其中最上層含RNA樣品。(c)將含RNA層移至另一離心管中，并加入600 μ L異丙醇混勻后靜置10 min,離心15 min (4 0C,12000 r/min)。(d)棄去上清后離心管中的沉淀用500 μ L 75 %乙醇洗滌后離心收集。(e)待乙醇揮發(fā)干，加入35 μ L超純水于-80 °C保存。RNA反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄的樣品-80 °C保存。取2 μ L RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，目的基因pCMV⑶及內(nèi)參GAPDH上下游引物各0.04μ L，按照試劑盒說明書操作ο 95 0C變性5 min，95 °C/15 S，60 ° C/15 S，60 °C/15 S，共40個循環(huán)。
[0053]Real-time PCR被用來檢測在mRNA水平⑶基因表達的效果。N/P比10的情況下，用不同濃度的PPDM/pCMVCD處理C6腦膠質(zhì)瘤細胞，結(jié)果圖13所示，隨著CD基因濃度的增加，⑶基因表達量有增加趨勢。2.6 μ g/mL的⑶基因表達效果顯著好于0.6 yg/mL，而且與2.6 μ g/mL⑶基因相比，更高劑量的⑶基因的表達能力并沒有顯著提高。此外，PPDM(空囊泡)和PPDM/5-FC (載藥囊泡)復(fù)合⑶基因后處理的細胞⑶基因在mRNA水平上都有明顯表達(6.6045 VS 0.0004，6.4011 VS 0.0004)，見圖 14。
[0054]實施例9載藥/基因納米囊泡的腫瘤細胞毒性分析
實驗對象為實施例2制備的載藥/基因納米囊泡，并以空囊泡及單獨載藥或基因的納米囊泡做對比。細胞增長的抑制率即細胞毒性通過經(jīng)典的MTT進行分析。腦膠質(zhì)瘤細胞C6細胞在每孔0.3X IO4數(shù)量級的96孔板中進行種植培養(yǎng)。在對數(shù)級增長階段進行收割，并最終用含有10% FBS的RPM1-1640培養(yǎng)基調(diào)整成170 μ L。24 h之后，在每孔板中加入設(shè)定濃度的空囊泡、載藥納米囊泡、載基因納米囊泡、載藥/基因納米囊泡。在經(jīng)過72 h培養(yǎng)后，在每孔板中加入10 μ L濃度為5 mg/mL的MTT鹽溶液(0.9%氯化鈉)繼續(xù)在37 ° C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h以允許活性細胞經(jīng)過還原反應(yīng)把黃色MTT轉(zhuǎn)化為深蘭色甲瓚晶體，然后這種晶體溶解于100 μ LDMSO中，通過酶標儀在540 nm及655 nm對每個板孔進行檢測。
[0055]各實驗組的細胞毒性分析見圖15、16。由圖15可見，空囊泡及單獨載藥或基因的納米囊泡毒性均很低。囊泡未負載5-FC和CD基因時，當空囊泡濃度為40 Pg/mL時，細胞活性90%以上。當濃度增大為100 Pg/mL，細胞活性依然高于80%。所以說明:單獨載藥或基因的納米囊泡的毒性相比與空囊泡變化不大。
[0056]5-FC在CD基因表達的胞嘧啶脫氨酶的作用下轉(zhuǎn)化為化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)才能殺死腫瘤細胞。實施例2中的納米囊泡聯(lián)合傳輸CD基因和5-FC作用于C6細胞所產(chǎn)生的細胞毒性見圖16。從圖中可以看出，陰性對照組(pEGFP)組隨著5-FC濃度的增加，細胞毒性基本不變。即便5-FC濃度達到120Pg/mL，細胞活性依然高于80%。而載藥/基因納米囊泡，隨著5-FC濃度的增加，細胞毒性急劇增加。5-FC濃度達60 Pg/mL，細胞活性已為35.98%。說明聯(lián)合治療組(PPDM/5-FC/pCMVCD)實現(xiàn)了 5-FC和pCMVCD的協(xié)同治療，明顯抑制腫瘤細胞的活性。
[0057]本發(fā)明是通過實施例來描述的，但并不對本發(fā)明構(gòu)成限制，參照本發(fā)明的描述，所公開的實施例的其他變化，如對于本領(lǐng)域的專業(yè)人士是容易想到的，這樣的變化應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求限定 的范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種能共傳輸藥物和基因的納米囊泡，其特征在于該納米囊泡為由表層的聚乙烯亞胺和中間層的聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)構(gòu)成且中間層帶有可交聯(lián)巰基的聚乙烯亞胺-b-聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)納米囊泡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述能共傳輸藥物和基因的納米囊泡，其特征在于上述聚乙烯亞胺為支化型，其數(shù)均分子量為600 Da,上述聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)的數(shù)均分子量為I~10 KDa0
3.一種能共傳輸藥物和基因的納米囊泡的制造方法，該方法用于制造如前述任一權(quán)利要求所述的納米囊泡，其特征在于包括如下步驟: A、用正丁胺為引發(fā)劑，引發(fā)β-天門冬氨酸芐酯N-羧酸酐聚合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液沉淀、抽濾和洗滌后，真空干燥得到聚合物聚天冬氨酸芐酯； B、采用馬來酸酐對聚天冬氨酸芐酯末端的氨基進行羧基化反應(yīng)，并將反應(yīng)得到的產(chǎn)物冷凍干燥后，得到白色粉末狀的羧基化聚天冬氨酸芐酯； C、將羧基化聚天冬氨酸芐酯經(jīng)二異丙基乙二胺和半胱胺酸混合氨解反應(yīng)后，將反應(yīng)物透析、旋干，得到羧基化聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸); D、在催化劑的催化下，將羧基化聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)與聚乙烯亞胺進行酰胺化反應(yīng)，并將反應(yīng)液透析、濃縮和抽干后，得到聚合物聚乙烯亞胺-b_聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸); E、將聚乙烯亞胺- b-聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)溶于有機溶劑中，并在超聲作用下將溶液滴至PH值為9的緩沖溶液中，通氧氣2 h后，在pH值為7.4的緩沖溶液中透析三天，得到含有聚乙烯亞胺_b-聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)納米囊泡的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述納米囊泡于傳輸藥物和基因方面的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用方法如下: 首先將聚乙烯亞胺_b-聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)納米囊泡作為載體與親水性抗腫瘤前藥按一定的比例混合共同形成為原料，然后將原料溶于有機溶劑中配制成溶液，在超聲作用下將制得的溶液滴加至PH值為9的緩沖溶液中，然后通氧氣，再經(jīng)過透析除去未包裹的藥物及有機溶劑，最后將溶液的PH值調(diào)至7.4，即得到載藥納米囊泡；將載藥納米囊泡與質(zhì)粒DNA按照聚合物中氨基與質(zhì)粒DNA中磷酸根的一定摩爾比混合均勻后振蕩15秒，于室溫靜置后得到載藥/基因納米囊泡。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述納米囊泡于傳輸藥物和基因方面的應(yīng)用，其特征在于上述聚乙烯亞胺_b-聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)納米囊泡與親水性抗腫瘤前藥的重量份數(shù)比為(10~1000):1ο
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述納米囊泡于傳輸藥物和基因方面的應(yīng)用，其特征在于上述聚乙烯亞胺_b-聚天冬氨酸(二異丙基乙二胺/半胱胺酸)納米囊泡與親水性抗腫瘤前藥的重量份數(shù)比為(10~20):1。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述納米囊泡于傳輸藥物和基因方面的應(yīng)用，其特征在于上述載藥納米囊泡與質(zhì)粒DNA按照聚合物中氨基與質(zhì)粒DNA中磷酸根的摩爾比為(0.1~40):1。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述納米囊泡于傳輸藥物和基因方面的應(yīng)用，其特征在于上述載藥納米囊泡與質(zhì)粒DNA按照聚合物中氨基與質(zhì)粒DNA中磷酸根的摩爾比為(4~10):1。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述納米囊泡于傳輸藥物和基因方面的應(yīng)用，其特征在于上述有機溶劑體積為原料重量的5~1000倍。
10.根據(jù)權(quán)利 要求4所述納米囊泡于傳輸藥物和基因方面的應(yīng)用，其特征在于上述緩沖溶液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液。
【文檔編號】A61K48/00GK103990134SQ201410162617
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】蔣慶, 王露, 苑園園, 曹眾, 帥心濤 申請人:中山大學(xué)