氯化鋰作為Hedgehog信號(hào)通路抑制劑在制備抗胰腺癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了氯化鋰在胰腺癌靶向治療中的新用途。揭示了胰腺癌高表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子Gli1和E3泛素連接酶ITCH的相互調(diào)節(jié)機(jī)制，Gli1可以作為胰腺癌治療的藥物靶點(diǎn)，ITCH對(duì)其的調(diào)節(jié)機(jī)制在抗胰腺癌藥物開發(fā)中起作用。
【專利說明】氯化裡作為Hedgehog信號(hào)通路抑制劑在制備抗胰腺癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種經(jīng)典的情緒穩(wěn)定劑氯化鋰的醫(yī)藥新用途一作為Glil信號(hào)抑制劑在制備抗胰腺癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,來源于胰腺組織中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，具有發(fā)病隱匿、惡性程度高、病程進(jìn)展快、高致死等特點(diǎn)。美國(guó)國(guó)家癌癥研究中心估計(jì)(http://www.seer, cancer, gov), 2012年全美有43，920人被診斷為胰腺癌,其中37，390人將死于此病。人群中的發(fā)病率是12.1/100，000/年，死亡率是10.8/100，000/年。該病總體患者的I年相對(duì)生存率小于25%，而5年相對(duì)生存率小于6%，其中原位癌的5年生存率約為20%，局部晚期和轉(zhuǎn)移性癌的中位生存期分別約是10個(gè)月和6個(gè)月。有些患者在確診時(shí)就已經(jīng)病入膏肓，只有數(shù)天或數(shù)周生存時(shí)間。在癌癥導(dǎo)致的相關(guān)死亡人數(shù)中，胰腺癌在美國(guó)名列第四，全球第八，并且在主要臨床癌癥中其死亡率是最高的。胰腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)包括年齡、吸煙、酗酒、糖尿病、肥胖、遺傳等因素。
[0003]氯化鋰是一種經(jīng)典的情緒穩(wěn)定劑，用于雙相情感障礙和其他精神疾病的臨床治療已有50年的歷史。而鋰治療精神疾病的靶點(diǎn)是鋰能通過多種途徑抑制GSK3 β。Gupta等認(rèn)為鋰的抗腫瘤效應(yīng)也主要是通過抑制GSK3 0而實(shí)現(xiàn)的。此外，鋰離子通過調(diào)節(jié)許多癌癥相關(guān)基因或信號(hào)的生物活性，例如，STAT3[139]、^-catenin/WNT[128, 129]、P53 [140]、TNF[132, 141]、FASL[141]和TRAIL[142]，抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和致瘤性。
[0004]Gli蛋白家族是鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。在脊椎動(dòng)物中鑒定出的成員有Glil、Glil2和Glil3。其中Glil主要起轉(zhuǎn)錄激活作用，它既是Hedgehog(Hh)通路下游的效應(yīng)分子，也是該通路調(diào)節(jié)的靶蛋白，其表達(dá)也是Hh/Gl i I信號(hào)通路激活的標(biāo)志。
[0005]Hh/Glil信號(hào)通路在多細(xì)胞動(dòng)物胚胎形態(tài)發(fā)生、組織分化、干細(xì)胞維持過程中發(fā)揮著重要的作用。在人的胰腺癌組織和細(xì)胞系中，Hh信號(hào)通路中的成員均過度表達(dá)并且在胰腺癌形成的早期和后期都扮演著非常重要的媒介作用，Hh信號(hào)通路的異?；钴S會(huì)促進(jìn)了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移、侵染及進(jìn)一步的癌變。
[0006]泛素-蛋白酶體途徑是真核細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng)，蛋白質(zhì)的泛素化修飾涉及到泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3的一系列反應(yīng)，其中E3連接酶具有底物特異性。Glil降解調(diào)節(jié)途徑主要是HECT型-E3連接酶依賴性途徑:其中ITCH是屬于E3連接酶HECT家族的成員，其含有保守的兩個(gè)色氨酸殘基和C末端HECT連接酶結(jié)構(gòu)域。ITCH能夠與Gli I結(jié)合并促進(jìn)其多聚泛素化，隨后Gli I則通過蛋白水解酶體被降解，下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)的水平。LiCl可以上調(diào)ITCH的表達(dá)，從而促進(jìn)Glil的降解，這是本發(fā)明人首先發(fā)現(xiàn)的，這對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的抗胰腺癌藥物具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種情緒穩(wěn)定劑氯化鋰的醫(yī)藥新用途——氯化鋰作為Hedgehog信號(hào)通路抑制劑在制備抗胰腺癌藥物中的應(yīng)用。
[0008]下面通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來說明氯化鋰對(duì)Hedgehog信號(hào)通路的抑制作用及對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Glil的促泛素化降解作用。
[0009]儀器:Thermo酶標(biāo)儀，Biorad蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，ABi Stepone plus突光定量PCR分析儀。
[0010]試劑:RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo公司；DMEM(高糖)及胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；各種抗體購(gòu)自Cell Singaling Technology公司，用于突光定量PCR的Cyber Green購(gòu)自Roche ;總RNA提取試劑購(gòu)自捷瑞公司；MTT購(gòu)自上海生工。
[0011]方法及結(jié)果:
Uffestern-Blot檢測(cè)氯化鋰對(duì)Hedgehog信號(hào)活性的抑制
將相同數(shù)量的PDA細(xì)胞(PANC-l/BxPC-3/AsPC-l)接種于6孔板至80~90%，更換新鮮培養(yǎng)基，加入20mM氯化鋰處理18h，加入相同濃度氯化鈉處理相同時(shí)間作為對(duì)照，提取總蛋白，結(jié)果見圖1和圖2。圖1的結(jié)果表明，使用氯化鋰處理PDA細(xì)胞18h后，能夠有效抑制PDA細(xì)胞中H edgehog信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子Glil的水平，圖2的結(jié)果表明，氯化鋰對(duì)于Hedgehog信號(hào)通路中其他蛋白的抑制作用。
[0012]2、氯化鋰對(duì)Hedgehog信號(hào)持續(xù)活化細(xì)胞的抑制增殖作用
將相同數(shù)量的PDA細(xì)胞(PANC-l/BxPC-3/AsPC-l)接種于96孔板至25%，加入氯化鋰(lmM-40mM 處理 24h、20mM 處理 0_72h)處理，加入 20 μ 15mg/ml MTT 母液，37°C 孵育 4h 測(cè)定吸光值。檢測(cè)結(jié)果見圖3。圖3顯示，用氯化鋰處理PDA細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)氯化鋰能夠有效抑制PDA細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。
[0013]3、氯化鋰對(duì)Hedgehog信號(hào)持續(xù)活化細(xì)胞的抑制遷移作用
將相同數(shù)量的PDA細(xì)胞(PANC-l/BxPC-3/AsPC-l)接種于6孔板至80~90%，垂直細(xì)胞劃痕，PBS清理后加入含有相應(yīng)濃度氯化鋰的DMEM全血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，結(jié)果見圖4。圖4顯示，用氯化鋰處理后的PDA細(xì)胞遷移能力下降，氯化鋰能夠抑制PDA細(xì)胞的遷移。
[0014]用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將100 μ I無血清細(xì)胞懸液加入transwell上室，500 μ I全血清細(xì)胞培養(yǎng)液加入下室及不同濃度的氯化鋰，然后細(xì)胞培養(yǎng)12~24小時(shí)后，取出小室，用棉簽將上室中的細(xì)胞擦除，4%多聚甲醛固定20min，下室細(xì)胞用結(jié)晶紫染色20min后，用PBS將未與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)晶紫洗去，測(cè)吸光值，結(jié)果見圖5。圖5顯示，氯化鋰能夠顯著抑制PDA細(xì)胞的遷移。
[0015]4、熒光定量PCR檢測(cè)氯化鋰對(duì)Glil所調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄活性
熒光定量PCR中PDA細(xì)胞與6孔板中生長(zhǎng)至80~90%，加入含有20mM氯化鋰的DMEM全血清培養(yǎng)基，處理24h后，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，做熒光定量PCR分析。結(jié)果見圖6，圖6的結(jié)果表明，氯化鋰處理后，PDA細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路的成員(SHH、SM0和Glil)以及Hh信號(hào)通路的下游靶基因(HHIP、CCND1和PTCH1)的mRNA水平都有顯著的降低，證明氯化鋰可以抑制Glil調(diào)控的下游靶基因的轉(zhuǎn)錄水平。
[0016]5、動(dòng)物裸鼠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氯化鋰對(duì)胰腺癌移植瘤的抑制作用
BALB/c裸鼠皮下注射PANC-1和BxPC_3細(xì)胞，造胰腺癌荷瘤小鼠，然后通過口服給氯化鋰的給藥途徑，在第7天，所有裸鼠均出現(xiàn)肉眼可見、綠豆大小且均一的BxPC-3細(xì)胞移植瘤，即全部裸鼠接種成功，但裸鼠的PANC-1細(xì)胞移植瘤形成緩慢，且成瘤率僅為60%。在第7天，將BxPC-3細(xì)胞荷瘤鼠隨機(jī)分3組，即陰性對(duì)照組、鋰實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組(尾靜脈注射吉西他濱)，每組7只小鼠。氯化鋰實(shí)驗(yàn)組裸鼠通過飲用水口服給鋰，陽性對(duì)照組由尾靜脈注射吉西他濱及飲用正常水，陰性對(duì)照組只飲用正常水。各組裸鼠每3~4天(一周二次)記錄體重和測(cè)量腫瘤體積。結(jié)果見圖8，圖8結(jié)果說明，氯化鋰可以抑制瘤體積的增長(zhǎng)。
[0017]6、RT-qPCR和Western-Blot檢測(cè)氯化鋰促Glil泛素化降解作用
熒光定量PCR中PDA細(xì)胞與6孔板中生長(zhǎng)至80~90%，liposome2000轉(zhuǎn)染ITCH進(jìn)入PDA細(xì)胞，加入含有IOmM氯化鋰的DMEM全血清培養(yǎng)基處理24h后，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，做熒光定量PCR分析。結(jié)果見圖9。圖9結(jié)果表明，氯化鋰處理后，ITCH可以顯著促進(jìn)Glil的降解。
[0018]將相同數(shù)量的PDA細(xì)胞接種于6孔板至80~90 %，更換新鮮培養(yǎng)基，liposome2000轉(zhuǎn)染ITCH進(jìn)入PDA細(xì)胞，再加入IOmM氯化鋰處理24h，提取總蛋白，結(jié)果見圖8。圖8結(jié)果表明，氯化鋰通過ITCH處理Glil的泛素化降解。
[0019]綜上所述，結(jié)合對(duì)Glil的激活與降解途徑的綜合分析，本發(fā)明首次公開提出LiCl對(duì)胰腺癌細(xì)胞中Hh/Gl i I的下調(diào)模式為“LiCl處理促進(jìn)了 HECT型-E3連接酶依賴性的Gli I的泛素化降解途徑”。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是氯化鋰抑制Hedgehog信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子的水平。
[0021]圖2是氯化鋰抑制Hedgehog信號(hào)活性。
[0022]圖3是MTT檢測(cè)氯化鋰抑制PDA細(xì)胞存活率。
[0023]圖4是細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖
[0024]圖5是transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證氯化鋰抑制PDA細(xì)胞的遷移。
[0025]圖6利用Western-blot和RT-qPCR對(duì)PDA細(xì)胞中Hh通路的成員如SHH、SMO和Glil以及Hh信號(hào)通路的下游靶基因HHIP、CCND1和PTCHl等的mRNA水平和蛋白水平的分析。
[0026]圖7是裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)給藥方式的確定。
[0027]圖8 口服給氯化鋰后，荷瘤裸鼠胰腺癌移植瘤變化檢測(cè)。
[0028]圖9ITCH調(diào)控Glil表達(dá)的蛋白水平和mRNA水平分析。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述:
實(shí)施例一:氯化鋰抑制胰腺癌細(xì)胞增殖
1、材料
LiCl購(gòu)自MERCK公司，并溶于三蒸水中配置成IM的儲(chǔ)液，0.22 μ m的濾器過濾除菌，用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成lmM、3mM、5mM、10mM、20mM和40mM不同濃度的溶液備用。
2、腫瘤細(xì)胞AsPC-1細(xì)胞、PANC-1細(xì)胞、BxPC-3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。
3、其他試劑及儀器
DMEM高糖購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自Hyclone公司；C02培養(yǎng)箱(Thermo)；酶標(biāo)儀(Thermo) ;CCK_8檢測(cè)試劑(日本同仁化學(xué))。
4、方法
取5000個(gè)/孔細(xì)胞于96孔板中，將培養(yǎng)板在37°C，5% C02及飽和濕度的培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)過夜，然后向96孔板加入不同濃度的Li+，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育相應(yīng)的時(shí)間，再去除每孔中的培養(yǎng)基，加入含10% CCK8的新鮮培養(yǎng)基(注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù))，放回培養(yǎng)箱內(nèi)孵育I~4小后，取出培養(yǎng)板并冷卻到室溫后，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μ 10.1M的HCl溶液或者I %w/v SDS溶液，并在室溫條件下遮蓋培養(yǎng)板避光保存。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光值不會(huì)發(fā)生變化。每孔樣品的吸光值需扣除培養(yǎng)基的空白吸收值。活力計(jì)算:細(xì)胞活力*(%) = [A(加藥)-A(空白/A(不加藥)-A(空白)X 100% )
A (加藥):具有細(xì)胞、CCK8溶液和藥物溶液的孔的吸光度 A(空白):具有 培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度 A(不加藥):具有細(xì)胞、CCK8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度 *細(xì)胞活力:細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力
5、結(jié)果
結(jié)果見圖1，由圖1可知，LiCl處理后，以劑量和時(shí)間依賴性的方式降低了胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-l、PANC-l和BxPC-3細(xì)胞的活力。結(jié)果顯示20mM和40mMLi+處理24h后對(duì)PANC-1細(xì)胞抑制率達(dá)到75%和68%，而20mM和40mMLi+處理24h后對(duì)BxPC-3細(xì)胞抑制率達(dá)到70%和 65%。
[0030]實(shí)施例二:氯化鋰抑制PDA細(xì)胞遷移
1、材料
LiCl購(gòu)自MERCK公司，并溶于三蒸水中配置成IM的儲(chǔ)液，0.22 μ m的濾器過濾除菌，用含有10 %胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成ImM、3mM、5mM、10mM、20mM和40mM不同濃度的溶液備用。
2、腫瘤細(xì)胞
AsPC-1細(xì)胞、PANC-1細(xì)胞、BxPC-3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。
3、其他試劑及儀器
DMEM高糖購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自Hyclone公司
4、方法
(1)在6孔板中加入約5X105個(gè)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)90%~100%，用20 μ I槍頭比著直尺，盡量垂直于細(xì)胞中劃痕。然后用PBS洗細(xì)胞3次，去處劃下的細(xì)胞，加入含相應(yīng)藥物濃度的培養(yǎng)基。再放入37°C ,5% C02及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按時(shí)取樣拍照。
(2)消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗I~2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至5X106cells/ml然后向transwell上室加入100 μ I無血清細(xì)胞懸液，向其下室加入500 μ I全血清細(xì)胞培養(yǎng)液及不同濃度的鋰。將細(xì)胞培養(yǎng)12~24小時(shí)后，取出小室，用棉簽將上室中的細(xì)胞擦除，4%多聚甲醛固定20min。下室細(xì)胞用結(jié)晶紫染色20min后，用PBS將未與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)晶紫洗去，放到正置顯微鏡下拍照。
5、結(jié)果
結(jié)果如圖3所示，Li+以時(shí)間和劑量依賴性方式降低了 PANC-1和BxPC-3細(xì)胞的遷移能力。Transwell migration assay同樣驗(yàn)證了 LiCl在24h以劑量依賴性方式顯著降低了BxPC-3和PANC-1細(xì)胞的遷移能力。
[0031]實(shí)施例三:PDA細(xì)胞中Hh通路的成員如SHH、SM0和Glil以及Hh信號(hào)通路的下游靶基因HHIP、CCNDl和PTCHl等的mRNA水平和蛋白水平的分析
1、材料
LiCl購(gòu)自MERCK公司，并溶于三蒸水中配置成IM的儲(chǔ)液，0.22 μ m的濾器過濾除菌，用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成lmM、3mM、5mM、10mM、20mM和40mM不同濃度的溶液備用。
2、細(xì)胞系
HEK293細(xì)胞、AsPC-1細(xì)胞、PANC-1細(xì)胞、BxPC-3細(xì)胞、B16F10細(xì)胞(中科院細(xì)胞典臧所)。
3、其他試劑和儀器
質(zhì)粒載體PCDNA3.1-Myc-Glil (2-1 IOOaa)為自己構(gòu)建；DMEM高糖和胰酶，Gibco ；Trizol,美國(guó) Invitrogen ；RNA 反轉(zhuǎn)錄酶、Oligo dT、Random primer、dNTP, TaKaRa 公司；2XSYBR Green PCR master mix,羅氏公司；焦碳酸二乙酯(DEPC), Invitrogen 公司；PCR擴(kuò)增MIX。天為時(shí)代公司；感受態(tài)細(xì)胞，TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒，TaKaRa公司；0.45 μ mPVDF 膜，Millipore 公司；預(yù)染蛋白質(zhì) Marker, Thermo 公司產(chǎn)品；Trypton 和Yeast Extraction, OXID公司產(chǎn)品；P1、Annexin V檢測(cè)試劑盒,南京凱基生物公司產(chǎn)品;Lipofectamine2000, Invitrogen 公司；0pti_MEM 培養(yǎng)基，Invitrogen 公司；
表 IReal-time PCR 引物 Name Forword primer (5-3')Reverse primer (5'-3!)
GlilCTCCCGAAGGACAGGTATGTAACCCCTACTCTTTAGGCACTAGAGTTG~
PTCHl TCGAGACCAACGTGGAGGAG CCGAGTCCAGGTGTTGTAGG HHIP TTCCATACCAAGGAGCAACCTCTTGCCACTGCTTTGTCAC
SHH CGGGAAGAGGAGGCACCCCA GTACTTGCTGCGGTCGCGGT CCNDl AGAAGGAGGTCCTGCCGTCC GGTCCAGGTAGTTCATGGCC FUACTCTGAGCAGACTTTGCGGAG CCATCCAAGACAACCTGCTGTG
SUFU AGAGTGCCGCCGCCTTTACCACGGGCTGCATCTGTGGGTC
SMO CAGGAGGAAGCGCACGGCAA TGCAGCGCAGGAAGTCAGGC GAPDH TGTGGGCATCAATGGATTTGG ACACCATGTATTCCGGGTCAAT
引物合成為南京思普金生物科技有限公司
表 2Western Blot 抗體
【權(quán)利要求】
1.氯化鋰作為Hedgehog信號(hào)通路抑制劑在制備抗胰腺癌藥物中的應(yīng)用。
2.如根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述腫瘤細(xì)胞為Hedgehog信號(hào)通路持續(xù)活化的的胰腺癌細(xì)胞。
3.如權(quán)利2要求所述，其特征在于:氯化鋰促進(jìn)了Hedgehog信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄因子Glil的泛素化降解， 下調(diào)其細(xì)胞內(nèi)水平。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103893206SQ201410166149
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】周偉, 陸美玲, 歐瑜 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)