一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗及其制備方法，該疫苗為FAT10多價(jià)表位肽與Tim-3基因重組表達(dá)載體的復(fù)合物；FAT10多價(jià)表位肽由表位FAT10154-162/FAT10155-163/FAT1049-57與穿膜序列HIV-Tat40-48、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列DELK和接頭序列組成，穿膜序列位于氨基端，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列位于羧基端，表位與穿膜序列或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列之間以接頭序列連接；該疫苗可成功進(jìn)入細(xì)胞并靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有效促進(jìn)表位FAT10154-162/FAT10155-163/FAT1049-57進(jìn)入MHC-I類抗原遞呈途徑激發(fā)特異性CTL應(yīng)答，同時(shí)Tim-3發(fā)揮抑制免疫逃逸作用，協(xié)助刺激T細(xì)胞活化，從而產(chǎn)生廣泛的免疫激活效應(yīng)，誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗腫瘤免疫。
【專利說(shuō)明】一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多價(jià)治療性疫苗，特別涉及一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)膠質(zhì)瘤是來(lái)源于神經(jīng)上皮的腫瘤，是顱內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占全部顱內(nèi)腫瘤的40%-50%，以發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、致死率高，成為腫瘤治療的難題。傳統(tǒng)治療方法主要是手術(shù)和放化療提高患者的生存質(zhì)量。但是位于重要功能區(qū)的膠質(zhì)瘤要很難做到全切除。放射治療幾乎是各型膠質(zhì)瘤的常規(guī)治療，但療效評(píng)價(jià)不一，除髓母細(xì)胞瘤對(duì)放療高度敏感，室管膜瘤中度敏感外，其他類型對(duì)放療均不敏感?；熕幬锵抻谘X屏障及藥物的毒副作用，療效尚不肯定。近年來(lái)免疫治療成為腦膠質(zhì)瘤繼手術(shù)、放化療后的有效治療手段。與其他方式聯(lián)合應(yīng)用具體有很強(qiáng)的互補(bǔ)作用，對(duì)患者受損的免疫系統(tǒng)能夠起到恢復(fù)與重建的獨(dú)特療效，從而進(jìn)一步防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
[0003]FATlO也稱為雙泛素，是一種由165個(gè)氨基酸組成的18KD的蛋白，屬于泛素樣調(diào)節(jié)子(UBL)蛋白家族，由兩個(gè)泛素樣部分前后融合而成。UBL蛋白家族通過(guò)與其他蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合而行使泛素樣修飾作用。最近的研究表明UBL蛋白家族參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞分裂、DNA修復(fù)、自噬、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及胚胎發(fā)育等。因此，UBL蛋白家族在許多人類疾病(尤其是腫瘤)的發(fā)生及發(fā)展中扮演了重要角色。研究發(fā)現(xiàn)FATlO在多種腫瘤中高表達(dá)，如肝癌、結(jié)直腸癌、 宮頸癌、卵巢癌等，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而其中FATlO與月父質(zhì)瘤的關(guān)系最為密切。
[0004]CTL是通過(guò)其T細(xì)胞受體(TCR)特異性識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞(APC)表面的主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類分子-肽復(fù)合物而得以活化，并最終殺死靶細(xì)胞。其中，與MHC-1類分子特異性結(jié)合的短肽即CTL表位在CTL活化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。但大多數(shù)MHC-1類分子只遞呈內(nèi)源性抗原。外源性抗原絕大多數(shù)進(jìn)入MHC-1I類抗原遞呈途徑以激活輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)，僅有少數(shù)可被MHC-1類分子遞呈，即交叉遞呈。因此，如何將外源性短肽有效投入APC內(nèi)MHC-1類抗原遞呈途徑是激發(fā)特異性CTL應(yīng)答的關(guān)鍵，也是基于表位開(kāi)發(fā)疫苗的瓶頸問(wèn)題。
[0005]由于細(xì)胞膜的屏障作用，生物大分子不能自由進(jìn)入細(xì)胞。近年來(lái)，一些具有細(xì)胞膜穿透能力的小分子多肽(其長(zhǎng)度一般不超過(guò)30個(gè)氨基酸)相繼被發(fā)現(xiàn)，其可有效攜帶外源性大分子進(jìn)入細(xì)胞，并對(duì)宿主細(xì)胞沒(méi)有顯著毒副作用。這些具有細(xì)胞穿透能力的多肽被命名為細(xì)胞穿膜肽(CPP)。研究最早的CPP為人類免疫缺陷病毒(HIV)-1的反式激活蛋白Tat。1988年，Green和Frankel證實(shí)Tat能跨膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。1997年，Vives等發(fā)現(xiàn)Tat中一個(gè)富含堿性氨基酸、帶正電荷的多肽片段與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能密切相關(guān)，稱之為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，由Tat中的40-48位氨基酸殘基組成的序列(Arg-Arg-ArgArg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln7RRRRKKRRQ)即可完全行使蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能,這是Tat既有穿膜特性又無(wú)細(xì)胞毒性的最小片段。[0006]腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境有著密切關(guān)系。腫瘤微環(huán)境(tumormicroenviroment)是腫瘤在其發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中所處的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞本身、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、組織液及一些浸潤(rùn)細(xì)胞(如樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞)共同組成。腫瘤細(xì)胞可通過(guò)修飾自身表面抗原、表達(dá)負(fù)性調(diào)控分子或分泌抑制因子來(lái)逃避免疫細(xì)胞的識(shí)別與攻擊，獲得免疫逃逸，從而得以發(fā)生和發(fā)展。CTL細(xì)胞是抗腫瘤免疫的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞，細(xì)胞的活化有賴于特異性抗原信號(hào)和共刺激分子信號(hào)雙重信號(hào)的共同作用。共刺激分子B7家族對(duì)激活和抑制CTL細(xì)胞免疫起著非常關(guān)鍵的作用。CTL細(xì)胞免疫反應(yīng)受抑是腫瘤獲得免疫逃逸重要途徑。大量研究顯示，人類腫瘤表達(dá)的B7-H1是負(fù)性調(diào)控分子，有利于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Tim-3 (T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子3)是在激活的T、B細(xì)胞上表達(dá)的B7-H1和B7-DC分子的受體，具有抑制CTL細(xì)胞的活化和誘導(dǎo)活化CTL細(xì)胞凋亡的作用。國(guó)外多項(xiàng)研究表明，腫瘤微環(huán)境的刺激可上調(diào)B7-H1分子在腫瘤細(xì)胞和激活的APC表面表達(dá)上的表達(dá)，并進(jìn)一步與活化T細(xì)胞上Tim-3的結(jié)合，抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃避。因此，如果能阻斷B7-H1分子對(duì)免疫細(xì)胞的抑制，將在一定程度上抑制腫瘤免疫逃逸機(jī)制，并提高免疫治療效果。
[0007]本發(fā)明擬應(yīng)用復(fù)合疫苗載體，將陽(yáng)離子穿膜肽Tat與FATlO表位肽偶連，并通過(guò)正負(fù)電荷的吸引作用，包裹負(fù)電荷的表達(dá)Tim-3的表達(dá)載體，形成納米樣結(jié)果的復(fù)合顆粒。疫苗免疫機(jī)體后，被抗原遞呈細(xì)胞吞噬，F(xiàn)ATlO表位肽被處理后遞呈到細(xì)胞表面，誘導(dǎo)體內(nèi)的FATlO特異性的CTL免疫應(yīng)答。同時(shí)疫苗中的載體表達(dá)分泌Tim-3蛋白，通過(guò)阻斷封閉Tim-3與其配體的結(jié)合作用，減弱Tim-3的負(fù)反饋抑制作用，從而協(xié)同增強(qiáng)FATlO表位肽誘導(dǎo)CTL的抗腫瘤效應(yīng)，達(dá)到增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答和抑制腫瘤逃逸的“雙向調(diào)節(jié)”的治療作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗，目的之二在于提供所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗的制備方法。
[0009]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗，該疫苗為fatio154_162表位肽、fatio155_163表位肽、FAT1049_57表位肽與Tim-3基因重組表達(dá)載體的復(fù)合物；
所述FATlO154.表位肽由表位FAT10154_162、穿膜序列HIV-Tat40-48、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列DELK和接頭序列組成；
所述FAT10155_163表位肽由表位FAT10155_163、穿膜序列HIV-Tat40-48、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列DELK和接頭序列組成；
所述FAT1049_57表位肽由表位FAT1049_57、穿膜序列HIV_Tat40_48、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列DELK和接頭序列組成；
在所述FAT10154_162表位肽、FATlO155^163表位肽和FAT1049_57表位肽中，穿膜序列均位于氨基端，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列均位于羧基端，表位與穿膜序列或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列之間均以接頭序列連接。
[0010]進(jìn)一步，所述接頭序列為YAA ；
進(jìn)一步，所述FATKW162表位肽、FAT10155_163表位肽和FAT1049_57表位肽的摩爾比為1:1:1。
[0011]進(jìn)一步,所述Tim-3基因重組表達(dá)載體是在真核表達(dá)載體PC1-neo中插入Tim_3cDNA全長(zhǎng)序列而得到。
[0012]2、所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗的制備方法，在攪拌條件下，向溶解有Tim-3基因重組表達(dá)載體的磷酸鹽緩沖液中滴加溶解有FAT10154_162表位肽、FAT10155_163表位肽和FAT1049_57表位肽的水溶液，滴加完畢后繼續(xù)攪拌60分鐘，再靜置60分鐘，即得。
[0013]進(jìn)一步，所述？4110154_162表位肽、FAT10155_163表位肽和FAT1049_57表位肽摩爾比為1:1:1。
[0014]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明疫苗可通過(guò)穿膜序列進(jìn)入細(xì)胞，再通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列靶向并滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有效促進(jìn)膠質(zhì)瘤蛋白抗原表位fatio154_162/ fatio155_163/FAT1049_57進(jìn)入MHC-1類抗原遞呈途徑激發(fā)特異性CTL應(yīng)答，同時(shí)疫苗中的載體表達(dá)分泌Tim-3蛋白，通過(guò)阻斷封閉Tim-3與其配體的結(jié)合作用，減弱Tim_3的負(fù)反饋抑制作用，從而協(xié)同增強(qiáng)FATlO表位肽誘導(dǎo)CTL的抗腫瘤效應(yīng)。達(dá)到增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答和抑制腫瘤逃逸的“雙向調(diào)節(jié)”的治療作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明疫苗能夠激發(fā)CTL分泌干擾素-Y (IFN- Y );能夠激發(fā)CTL產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)，殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞，提高荷瘤小鼠的平均生存率。本發(fā)明疫苗制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療領(lǐng)域有著較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為FATlO154.表位肽、FATlO155.表位肽、FATlO49^57表位肽一級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為T(mén)im-3基因的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；
圖3為本發(fā)明疫苗的透射電鏡圖；
圖4為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)法檢測(cè)本發(fā)明疫苗激發(fā)CTL分泌IFN- Y的能力；
圖5為51Cr法檢測(cè)本發(fā)明疫苗激發(fā)CTL殺傷靶細(xì)胞的能力檢測(cè)結(jié)果；
圖6為給予本發(fā)明疫苗免疫后荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)結(jié)果；
圖7為給予本發(fā)明疫苗免疫后荷瘤小鼠的平均生存期結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J-薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0017]一、神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗的制備
1、FATlO154.表位肽、FATlO155^163表位肽、FATlO49^57表位肽的設(shè)計(jì)與合成本發(fā)明設(shè)計(jì)的FAT10154_162表位肽、FATlO155^163表位肽、FATlO49^57表位肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)如圖1所示，各表位與穿膜序列或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列之間以接頭序列連接，以便于各表位保持獨(dú)立性和能夠有效遞呈。在本實(shí)施例中，接頭序列為丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸(Tyr-Ala-Ala, YAA);表位 FAT10154_162 的氨基酸序列為 NLLFLACYC，表位 FATlO155.的氨基酸序列為L(zhǎng)LFLACYCI，表位FAT1049_5』^氨基酸序列為VLLLGSKIL ;同時(shí)，以卵清蛋白(OVA)表位肽作為對(duì)照肽(由表位0VA257-264、穿膜序列HIV-Tat40_48、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列DELK和接頭序列組成)(表位0VA257-264的氨基酸序列為SIINFEKL)。
[0018]多肽的合成在ABI 431A型固相多肽合成儀(美國(guó)PE公司)上進(jìn)行。方法采用標(biāo)準(zhǔn)芴甲氧羰基(Fmoc)方案，精氨酸采用兩次偶聯(lián)。起始選用0.125mmol對(duì)羥甲基苯氧甲基聚苯乙烯樹(shù)脂(HMP樹(shù)脂)，按照多肽序列使肽鏈從羧基端逐個(gè)向氨基端延伸，每種氨基酸的用量為0.5mmol,與樹(shù)脂的摩爾比為4:1。各種氨基酸的α -氨基為Fmoc保護(hù),其余側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)分別為:Lys (Boc)、Ser (tBu)、Glu (OtBu)、Arg (Pmc)、His (Trt)、Thr (tBu)和 Tyr (tBu)。第一個(gè)氨基酸連接到樹(shù)脂上用4-二甲氨基吡啶(DMAP)，氨基酸的活化用1-羥基苯并三唑(HOBt)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，偶聯(lián)后用體積分?jǐn)?shù)為20%的哌啶水溶液去除Fmoc保護(hù)基。多肽合成后，將樹(shù)脂-粗肽產(chǎn)品在冰浴條件下混合于IOmL切割液A(由結(jié)晶苯酚0.75g、
I,2-乙二硫醇即EDT 0.25mL、苯甲硫醚0.5mL、去離子水0.25mL和三氟乙酸即TFA IOmL組成)中，待切割液溫度上升至室溫后，攪拌反應(yīng)2小時(shí)，使肽鏈從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，同時(shí)去除多種保護(hù)基團(tuán)。將反應(yīng)混合液經(jīng)G4玻砂漏斗過(guò)濾以去除樹(shù)脂，先后用ImL TFA、5~IOmL 二氯甲烷反復(fù)沖洗反應(yīng)瓶 、樹(shù)脂和漏斗。將濾液在常溫低壓下蒸發(fā)至I~2mL，加入50mL預(yù)冷乙醚沉淀多肽，4°C放置過(guò)夜，G6玻砂漏斗過(guò)濾，真空抽干，即得多肽粗品，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0019]將多肽粗品用二甲基亞砜(DMSO)溶解制成濃度為20mg/mL的溶液，經(jīng)孔徑為
0.45 μ m的微孔濾膜過(guò)濾后，在AKTA explorer 100型中壓液相色譜儀(瑞典AmersshamBioscienc公司)上用SOURCE凝膠柱進(jìn)行純化。流動(dòng)相A由體積百分含量為10%的乙醇和體積百分含量為0.1%的TFA組成，流動(dòng)相B由體積百分含量為90%的乙醇和體積百分含量為0.1%的TFA組成；洗脫梯度為:先用流動(dòng)相A 1.5個(gè)柱體積洗脫，再用流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的混合液(流動(dòng)相B占混合液的體積分?jǐn)?shù)在8個(gè)柱體積內(nèi)由0%逐漸增加至80%)洗脫，再用流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的混合液(流動(dòng)相B占混合液的體積分?jǐn)?shù)在0.5個(gè)柱體積內(nèi)由80%逐漸增加至100%)洗脫，在主峰處收集多肽溶液，冷凍干燥，即得多肽純品，用DMSO溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0020]將多肽純品用Delta 600型高壓液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)鑒定純度，采用Symmetry Shield? C18柱，流動(dòng)相由體積百分含量為10%~60%的乙腈和體積百分含量為
0.1%的TFA組成，梯度洗脫，流速為lmL/min。結(jié)果顯示，合成多肽的純度均達(dá)到90%以上。同時(shí)，將多肽純品用API 2000 LC/MS型電噴霧離子化質(zhì)譜儀測(cè)定分子量。結(jié)果顯示，合成多肽的分子量均與理論值相符。
[0021]2、TIM-3基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建
收集人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用重組白介素4(rIL-4)和重組粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rGM-CSF)誘導(dǎo)分化成未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，用RNA抽提試劑盒抽提未成熟DC細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測(cè)定濃度和純度后，_70°C保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank登錄號(hào)為NM_032782.3的Tim_3基因的完整開(kāi)放閱讀框0RF，設(shè)計(jì)如下PCR引物:上游引物:5'-TCCCTACACAGAGCTGTC-3'，下游引物:5' - CAGAAATGAAGGCGAGC-3'，上下游引物兩端未加限制性酶切位點(diǎn)。PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。
[0022]將未成熟DC細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以該cDNA為模板，采用上述上下游引物PCR擴(kuò)增Tim cDNA全長(zhǎng)，PCR體系總體積為100 μ L，PCR循環(huán)條件參數(shù)為:94°C預(yù)變性2分鐘；再94°C變性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸I分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。將PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定(結(jié)果如圖2所示，M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I泳道為PCR產(chǎn)物，可見(jiàn)PCR產(chǎn)物在分子量約900bp處有唯一條帶，與預(yù)期分子量相符)后，切膠回收純化，再與T載體pGEM-T Easy在T4 DNA連接酶作用下于16°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)菌，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性克隆單菌落，用含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Pst I進(jìn)行雙酶切鑒定，并委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，正確插入了 Tim-3 cDNA全長(zhǎng)序列的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為T(mén)im-3-pGEM-T Easy。
[0023]用EcoR I從Tim-3-pGEM-T Easy中酶切出Tim_3 cDNA全長(zhǎng)，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切膠回收純化，紫外分光光度法測(cè)定濃度；同時(shí)，用EcoR I使真核表達(dá)載體PC1-neo線性化，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切膠回收純化，紫外分光光度法測(cè)定濃度；再將Tim-3 cDNA全長(zhǎng)與線性化載體pC1-neo在T4 DNA連接酶作用下于16°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性克隆單菌落，用含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用EcoR I和Kpn I進(jìn)行雙酶切鑒定，所得陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為T(mén)im-3-pC1-neo。
[0024]3、FATlO154^162/ FATlO155^163/ FATlO49^57 表位肽與 Tim_3 基因重組表達(dá)載體的復(fù)合物的制備
將Tim-3-pC1-neo用濃度為0.lmol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解制成濃度為500 μ g/mL的溶液，取該溶液100 μ L，在混旋狀態(tài)下以5 μ L/min的速度滴加總濃度為1000 μ g/mL 的多肽溶液(由摩爾比為 1:1:1 的 FAT10154_162/ FATlO155./ FATlO49^57 表位肽組成)100 μ L，滴加 完畢后繼續(xù)混旋60分鐘，再靜置60分鐘，即得FATlO154./ FATlO155^163/FATlO49^57表位肽與Tim-3基因重組表達(dá)載體的復(fù)合物，也即本發(fā)明所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗。
[0025]透射電鏡分析:將新制復(fù)合物滴于200目銅網(wǎng)上，吸附3分鐘，用吸水紙吸干，晾干30秒，以質(zhì)量體積百分濃度為1%的醋酸鈾水溶液負(fù)染30秒，用吸水紙吸干，晾干30秒，SOkV透射電鏡觀察。結(jié)果如圖3所示，所得復(fù)合物呈大小均一的近圓形顆粒，絕大多數(shù)顆粒長(zhǎng)徑小于25nm。
[0026]二、神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗的抗腫瘤效應(yīng)研究
效應(yīng)細(xì)胞的制備:將30只6~8周齡雌性Babl/c小鼠隨機(jī)分為3組:實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組，每組10只；將治療性疫苗用濃度為0.lmol/L、pH為7.4的PBS溶解制成濃度為lmg/mL的溶液；實(shí)驗(yàn)組以濃度為lmg/mL的Tim_3基因溶液為免疫原，對(duì)照組以濃度為Img/mL的Tim-3基因溶液為免疫原，空白組以濃度為0.lmol/L、pH為7.4的PBS為免疫原；各組于小鼠背側(cè)尾根部皮下注射免疫原，每只100 μ L，之后每間隔I周，以同樣方法加強(qiáng)免疫I次，共免疫3次；末次免疫后I周，斷頸處死小鼠，在無(wú)菌條件下取脾臟，用100目篩網(wǎng)碾磨，收集細(xì)胞懸液，用聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心法分離脾淋巴細(xì)胞，用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為I X IO6個(gè)/mL，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的效應(yīng)細(xì)胞。
[0027]1、ELISP0T法檢測(cè)治療性疫苗激發(fā)T細(xì)胞分泌IFN- Y的能力
采用ELISP0T檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū):在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入體積百分濃度為70%的乙醇100 μ L，室溫放置10分鐘，PBS洗滌，加入IFN- Y捕獲抗體(稀釋度為1: 100) 100 μ L，溫度4°C孵育過(guò)夜，PBS洗滌，加入質(zhì)量百分濃度為2%的脫脂奶粉100 μ L，室溫封閉2小時(shí)，PBS洗滌，加入效應(yīng)細(xì)胞100 μ L，溫度37°C孵育48小時(shí)，PBST(即含有質(zhì)量百分濃度為0.1%的吐溫20的PBS)洗滌，加入生物素標(biāo)記的抗IFN-Y抗體(稀釋度為1: 100)100 μ L，溫度37°C孵育1.5小時(shí)，PBST洗滌，加入鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(稀釋度為1: 5000)100 μ L，溫度37°C孵育I小時(shí)，PBST洗滌，拍干培養(yǎng)板，加入即用型BCIP/NBT底物反應(yīng)液100 μ L，室溫避光顯色2~10分鐘至斑點(diǎn)形成，用蒸餾水終止反應(yīng)，干燥后檢測(cè)斑點(diǎn)數(shù)；同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組(不加入效應(yīng)細(xì)胞)，各組斑點(diǎn)數(shù)以3個(gè)復(fù)孔的均值表示。
[0028]結(jié)果見(jiàn)圖4，實(shí)驗(yàn)組的斑點(diǎn)數(shù)(226個(gè)/IO5細(xì)胞)明顯高于其它3組(空白組為14個(gè)/IO5細(xì)胞，陰性對(duì)照組為3個(gè)/IO5細(xì)胞)，表明本發(fā)明的治療性疫苗具有良好的免疫原性，能夠有效激發(fā)T細(xì)胞分泌IFN- Y。
[0029]2,51Cr釋放法檢測(cè)治療性疫苗激發(fā)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng) 靶細(xì)胞的制備:將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清的
RPMI 1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，收集細(xì)胞，離心洗滌2次后，用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為I X IO6個(gè)/mL，取ImL置IOmL血清瓶中，加入100 μ Ci Na51CrO4，溫度37°C孵育90分鐘，充分洗滌細(xì)胞除去未結(jié)合的51Cr,再用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為I X IO5個(gè)/mL，作為靶細(xì)胞；
在96孔U型板中，每孔分別按效靶比(E/T)為100: 1、50: I和25: I加入效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞，每種效靶比設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)最大釋放組(用濃度為2mol/L的鹽酸替代效應(yīng)細(xì)胞)和最小釋放組(用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基替代效應(yīng)細(xì)胞)；將96孔板500r/min離心30秒后，溫度37°C孵育4小時(shí)，1000r/min離心10分鐘，各孔取上清100 μ L，用Y計(jì)數(shù)器測(cè)定每分鐘放射活性(cpm值)，按下述公式計(jì)算殺傷率:殺傷率(%) = [(實(shí)驗(yàn)組cpm均值-最小釋放組cpm均值)/ (最大釋放組cpm均值-最小釋放組 cpm 均值)]X 100%ο
[0030]結(jié)果見(jiàn)圖5，實(shí)驗(yàn)組在各效靶比對(duì)U251細(xì)胞均有特異性殺傷作用，且隨著效靶比增大，特異性殺傷作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)E/T為100: I時(shí)，殺傷率為54.7%，而對(duì)照組殺和空白組對(duì)U251細(xì)胞無(wú)特異性殺傷作用，表明本發(fā)明的治療性疫苗能夠有效激發(fā)T細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)。
[0031]二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
將荷瘤小鼠隨機(jī)分為三組:實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組，空白組尾根部皮下注射生理鹽水；對(duì)照組尾根部皮下注射Tim-3基因溶液；實(shí)驗(yàn)組尾根部皮注射治療性疫苗；觀察60天內(nèi)各組小鼠的生存率和腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。
[0032]結(jié)果見(jiàn)圖6和7:與對(duì)照組和空白組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠生存率高，腫瘤生長(zhǎng)緩慢。表明本發(fā)明的治療性疫苗能夠有效抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和延長(zhǎng)荷瘤小鼠的平均生存期。
[0033]最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗，其特征在于:該疫苗為？八110154_162表位肽、FATlO155.表位肽、FAT1049_57表位肽與Tim-3基因重組表達(dá)載體的復(fù)合物； 所述FATlO154.表位肽由表位FAT10154_162、穿膜序列HIV-Tat40-48、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列DELK和接頭序列組成； 所述FAT10155_163表位肽由表位FAT10155_163、穿膜序列HIV-Tat40-48、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列DELK和接頭序列組成； 所述FAT1049_57表位肽由表位FAT1049_57、穿膜序列HIV_Tat40_48、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列DELK和接頭序列組成； 在所述FAT10154_162表位肽、FATlO155^163表位肽和FAT1049_57表位肽中，穿膜序列均位于氨基端，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列均位于羧基端，表位與穿膜序列或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列之間均以接頭序列連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗，其特征在于:所述接頭序列為AAY。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗，其特征在于:所述FATlO154^162表位肽、FATlO15H63表位肽和FATlO49^57表位肽的摩爾比為1:1:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗，其特征在于:所述Tim-3基因重組表達(dá)載體是在真核表達(dá)載體PC1-neo中插入Tim-3 cDNA全長(zhǎng)序列而得到。
5.權(quán)利要求1所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗的制備方法，其特征在于:在攪拌條件下，向溶解有Tim-3基因重組表達(dá)載體的磷酸鹽緩沖液中滴加溶解有FAT10154_162表位肽、FAT10155_163表位肽和FAT1049_57表位肽的水溶液，滴加完畢后繼續(xù)攪拌60分鐘，再靜置60分鐘，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于:所述FATlO154.表位肽、FATlO15H63表位肽和FATlO49^57表位肽摩爾比為1:1:1。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103933557SQ201410177222
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】袁邦清, 楊曌, 沈漢超, 吳賢群, 陳羽建, 林立 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院四七六醫(yī)院