一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法，包括：溫和還原法制備PEI包覆的超順磁氧化鐵納米顆粒(USPIO-PEI)；USPIO-PEI納米顆粒表面修飾葉酸復(fù)合物(COOH-PEG-FA)和異硫氰酸熒光素(FI)；以及納米顆粒表面的乙?；揎?。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，易于操作；制備的超順磁氧化鐵納米顆粒粒徑較小、弛豫率超高，并且具有良好的膠體穩(wěn)定性、生物相容性和特定的腫瘤靶向性，在體內(nèi)腫瘤靶向成像診斷領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于核磁共振造影劑的制備領(lǐng)域，特別涉及一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]核磁共振成像技術(shù)日趨成熟，掃描時(shí)間明顯縮短，分辨率逐漸提高，檢測(cè)的準(zhǔn)確度也越來越高，使得核磁共振成像技術(shù)在疾病檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。為了提高M(jìn)RI成像診斷的靈敏度和特異性，選擇合適的MRI造影劑尤為重要。超順磁性四氧化三鐵納米顆粒近年來在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著越來越廣泛的應(yīng)用，特別是用作核磁共振成像(MRI)的造影劑。這主要是由于其具有獨(dú)特的磁學(xué)性質(zhì)以及信號(hào)強(qiáng)、使用劑量低和生物相容性好等特點(diǎn)，因而使其成為核磁共振成像造影劑的很好的選擇。不足的是，超順磁性Fe3O4納米顆粒作為常規(guī)的MRI造影劑之一，往往弛豫率較低，不能滿足對(duì)疫病靈敏檢測(cè)的目的。本課題組在前期的工作中，通過簡(jiǎn)易的水熱合成法制備了兩種不同性質(zhì)和尺寸規(guī)格的四氧化三鐵納米顆粒，并探索了其在MR成像診斷中應(yīng)用的可行性(沈明武，蔡紅東，史向陽(yáng)。一種APTS修飾的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法。中國(guó)發(fā)明專利，專利號(hào):ZL201110104443.1 ；Cai etal.，ACS App1.Mater.1nterfaces2013, 5 (5), 1722 - 1731 ;史向陽(yáng)，蔡紅東，沈明武。一種HPEI包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法。中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?201210277624.9)。盡管合成得到的四氧化三鐵納米顆粒具有相對(duì)高的弛豫率，探索合適的方法來合成具有更高弛豫率的四氧化三鐵納米顆粒仍然值得人們深入探索。
[0003]通過對(duì)不同合成方法的嘗試，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)溫和還原法制備的超順磁氧化鐵納米顆粒(USPIO)尺寸較小，并且表現(xiàn)出很高的弛豫率。但是這些還原法制備的裸露USPIO同樣面臨一些普遍的問題，即由于磁性顆粒本身具有的磁學(xué)特性導(dǎo)致USPIO很容易出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，從而限制了其在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域的應(yīng)用。為了解決這一難題，我們嘗試采用類似“一步”簡(jiǎn)易水熱合成法的方案在還原法制備納米顆粒的過程中，在反應(yīng)溶液中加入聚乙烯亞胺(PEI)，從而通過簡(jiǎn)易“一步”還原法制備了 PEI包覆的USPIO(USPIO-PEI)。表征數(shù)據(jù)表明，制備的USP10-PEI不僅具有良好的水溶性和膠體穩(wěn)定性，而且同時(shí)表現(xiàn)出T1和T2加權(quán)的成像效果，R2的弛豫率高達(dá)ATOmr1S4左右，如此高的弛豫率在目前的研究文章中實(shí)屬罕見。為了使制備的該種USP10-PEI能有效地應(yīng)用到生物體內(nèi)特定腫瘤部位的成像檢測(cè)，我們進(jìn)一步在其表面修飾聚乙二醇-葉酸復(fù)合物(Polyethylene glycol-Folicacid, PEG-FA)，有效地提高了 USPIO納米顆粒的水溶性、穩(wěn)定性、生物相容性和靶向性，再在其表面接上異硫氰酸熒光素(FI)用于納米顆粒的示蹤和熒光成像。以高葉酸受體表達(dá)的HeLa細(xì)胞(一種人宮頸瘤癌細(xì)胞)為模型細(xì)胞和腫瘤模型對(duì)制備的多功能納米探針的性質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究制備的USPIO納米顆粒具備的良好特性，特別是超聞的R2她豫率，有望實(shí)現(xiàn)不同疾病系統(tǒng)的準(zhǔn)確和靈敏診斷。
[0004]檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，尚沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于用還原法制備具有超高弛豫率的USPIO納米顆粒及其用于體內(nèi)腫瘤模型靶向MRI研究的相關(guān)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法，該方法工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，易于操作，成本較低。制備的USPIO磁性納米顆粒能夠長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定分散于水溶液中，不會(huì)出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象。所用的修飾劑PEI為廉價(jià)和環(huán)境友好材料，具有產(chǎn)業(yè)化實(shí)施的前景。
[0006]本發(fā)明的一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法，包括:
[0007](I)將三價(jià)鐵鹽溶解于超純水中，攪拌，鼓吹氮?dú)猓缓蠹尤雭喠蛩徕c溶液后，攪拌反應(yīng)20-30min，再加入超支化聚乙烯亞胺PEI水溶液和NH3.Η20，60-70°C條件下，攪拌反應(yīng)20-30min，然后室溫條件下反應(yīng)0.5-1.5h，分離洗滌，得到PEI包裹的超順磁氧化鐵納米顆粒USP10-PEI ;然后將USP10-PEI洗滌，分散于溶劑中；其中三價(jià)鐵鹽、超純水、NH3.H2O的配比為1.2~1.4g:20~25mL:2~3mL，三價(jià)鐵鹽、亞硫酸鈉、超支化聚乙烯亞胺PEI質(zhì)量比為 1.2 ~1.4:0.21 ~0.25:0.51 ~0.53 ;
[0008](2)將葉酸FA溶解于溶劑中，用EDC和NHS活化2_4h，滴加到氨基-聚乙二醇-羧基NH2-PEg-COOH溶液中，攪拌反應(yīng)2-4天，透析，然后真空冷凍干燥，即得C00H-PEG-FA ;其中 FA 和 NH2-PEg-COOH 的摩爾比為 1.8-2:1 ;
[0009](3)將上述C00H-PEG-FA、EDC和NHS溶解于溶劑中，攪拌活化2_4h，得到活化后的C00H- PEG-FA，然后加入步驟(1)中，攪拌反應(yīng)2_4d，分離洗滌，分散，得到USPIO-PE1-PEG-FA納米顆粒；其中活化后的C00H-PEG-FA與USP10-PEI納米顆粒表面氨基的摩爾比為1:23~25。
[0010](4)將異硫氰酸熒光素FI溶液加入步驟(3)中，攪拌反應(yīng)0.5-ld，分離，洗滌，分散，得到USPIO-PE1-F1-PEG-FA納米顆粒溶液；然后加入三乙胺，攪拌反應(yīng)20_40min，再加入乙酸酐，攪拌反應(yīng)20-30h，離心洗滌，分散，得到葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA ;其中 FI 與 USP10-PEI 表面氨基的摩爾比為 1:39-40。
[0011]所述步驟(1)中三價(jià)鐵鹽為FeCl3.6H20 ；NH3.H2O質(zhì)量百分比濃度為25-28%。
[0012]所述步驟⑴中鼓吹氮?dú)獾臅r(shí)間為10_15min。
[0013]所述步驟(1)中超支化聚乙烯亞胺PEI的相對(duì)分子量為25000。
[0014]所述步驟(2)中FA、EDC和NHS的摩爾比為1: 0.8-1:0.8-1。
[0015]所述步驟(2)中NH2-PEg-COOH的相對(duì)分子量為2000。
[0016]所述步驟(3)中C00H-PEG-FA 與 EDC、NHS 的摩爾比為 1:8-10:8-10。
[0017]所述步驟(4)中三乙胺、乙酸酐與USPIO納米顆粒表面的PEI上伯氨基摩爾比為8-10:10-12:1。
[0018]所述步驟(1)-(3)中溶劑均為二甲基亞砜DMSO ;分散為分散于二甲基亞砜DMSO中。
[0019]所述步驟(4)中FI溶液的溶劑為二甲基亞砜DMS0，分散為均分散于水中。
[0020]本發(fā)明先利用還原法合成PEI包裹的USPIO磁性納米顆粒，然后將PEG-FA和FI先后修飾在納米顆粒的表面，最后對(duì)納米顆粒的剩余表面氨基進(jìn)行乙酰化修飾。
[0021]本發(fā)明操作簡(jiǎn)便易行，原材料成本低。制備的納米顆粒具有良好的水溶性、膠體穩(wěn)定性和生物相容性。與葉酸阻斷的對(duì)照組相比，葉酸修飾的USPIO納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞或腫瘤部位具有更高的靶向性。該方法制備的葉酸靶向性USPIO納米顆粒在MRI分子影像診斷領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明使用X-射線衍射(XRD)、傅氏轉(zhuǎn)換紅外光譜分析(FTIR)、紫外可見吸收光譜(UV-Vis)、熱重分析(TGA)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-OES)、Zeta電勢(shì)及動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和透射電子顯微鏡(TEM)等方法表征制備的磁性納米顆粒，并通過磁共振成像儀測(cè)定納米顆粒的T1和T2弛豫性能，然后利用MTT法評(píng)價(jià)納米顆粒的細(xì)胞毒性，再利用流式細(xì)胞儀、共聚焦顯微成像以及體外和體內(nèi)核磁共振成像實(shí)驗(yàn)檢測(cè)葉酸修飾的納米材料對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性和診斷效果。具體測(cè)試結(jié)果如下:
[0023](I) X-射線衍射(XRD)測(cè)試結(jié)果
[0024]通過對(duì)比和分析X-射線衍射圖譜，還原法合成的裸的USPIO (如圖1a)和USP10-PEI (如圖1b)納米顆粒與Fe3O4圖譜(ICSD20-596) 一致，表明PEI修飾的USPIO晶體結(jié)構(gòu)為四氧化三鐵。由于PEI的修飾，使得USP10-PEI納米顆粒的X-射線衍射圖譜在22.5°左右出現(xiàn)的較寬的峰。
[0025](2)傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析(FTIR)的測(cè)試結(jié)果
[0026]通過對(duì)比USPIO (圖2a)、USPIO-PEI (圖2b)的紅外譜圖，發(fā)現(xiàn)USP10-PEI在1630,2850,2930和3450CHT1處有較強(qiáng)的吸收峰，由此可知PEI成功包裹在USPIO上；比較USP10-PEI (圖 2b)和 USPIO-PE1-PEG-FA (圖 2c)，發(fā)現(xiàn) USPIO-PE1-PEG-FA 在 1405CHT1 處有較強(qiáng)的吸收峰，結(jié)合FA(圖2d)的紅外譜圖可知PEG-FA成功接到USP10-PEI上。
[0027](3)熱重分析(TGA)測(cè)試結(jié)果
[0028]為了檢測(cè)PEG-FA在USPIO納米顆粒表面的上載量，我們對(duì)修飾前后的納米顆粒進(jìn)行了 TGA測(cè)試。由圖3可以看出，USP10-PEI在溫度升至700°C時(shí)，重量為原來的88.53%，經(jīng)過計(jì)算，PEI上載率為11.47% (圖3a);修飾后，USPIO-PE1-PEG-FA的失重分別是23.92%(圖4b)，經(jīng)過計(jì)算，C00H-PEG-FA上載率12.45%,由此表明PEG-FA已成功連接到USPIO納米顆粒的表面。
[0029](4)紫外吸收(UV-Vis)測(cè)試結(jié)果
[0030]圖 4 所示為 USPIO-PE1-PEG-FA(圖 4a)和 USPIO-PE1-F1-PEG-FA(圖 3b)在 200到800nm的紫外吸收?qǐng)D譜。從圖中我們可以看出，USPIO-PE1-PEG-FA在400到600nm處沒有明顯的紫外吸收峰，而USPIO-PE1-F1-PEG-FA在505nm處有一個(gè)明顯的紫外吸收峰，從而說明FI成功修飾到USPIO-PE1-PEG-FA納米顆粒表面。
[0031](5)電勢(shì)和水動(dòng)力粒徑測(cè)試結(jié)果
[0032]電勢(shì)結(jié)果顯示乙?；蠹{米顆粒的表面電勢(shì)是+24.2mV，而其分散于水、PBS和細(xì)胞培養(yǎng)基中后的水動(dòng)力粒徑分別是310.1,315.6和217.3nm(表1)。
[0033](6)透射電子顯微鏡(TEM)測(cè)試結(jié)果
[0034]通過TEM觀察本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的形態(tài)和尺寸(如圖5所示)。TEM測(cè)試結(jié)果顯示USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的形貌均是球形或準(zhǔn)球形。通過分別隨機(jī)測(cè)量300個(gè)納米顆粒的直徑計(jì)算得到制備的USPIO-PE1-F1-PEG-FA納米顆粒的直徑是8.9 ±2.lnm。
[0035](7)弛豫率測(cè)量結(jié)果
[0036]USPIO納米材料可以用作核磁共振成像的陰性造影劑，隨著Fe濃度的增加，MRI信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱。弛豫率(^或!^)反映USPIO納米粒子作為MRI造影劑的效率，為單位摩爾濃度鐵的橫向弛豫時(shí)間，可通過不同濃度下的弛豫時(shí)間化或^的倒數(shù)擬合計(jì)算得到。圖6為本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的T1或T2弛豫時(shí)間倒數(shù)與Fe濃度的線性擬合圖，可以看出這種USPIO納米材料的弛豫時(shí)間倒數(shù)隨著鐵濃度的增加(在0.0025-0.04mM濃度范圍內(nèi))具有很好的線性關(guān)系。并且通過計(jì)算可得本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA 的 T1 弛豫率為 35.69ι?Μ?，r2 弛豫率高達(dá) 475.92ι?Μ?，rjr2比率為13.33。因此，本發(fā)明所制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA可作為MRI分子影像學(xué)診斷中的優(yōu)良T2信號(hào)衰減造影劑。
[0037](8)MTT細(xì)胞活力測(cè)試結(jié)果
[0038]通過MTT比色法測(cè)定HeLa細(xì)胞的活力來檢測(cè)本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的細(xì)胞相容性(如圖7)。HeLa細(xì)胞與USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA 納米顆粒(Fe 濃度為 0.2,0.4,0.6,0.8、1.0、1.5 和 2.0mM)在37°C下共培養(yǎng)24小時(shí)。然后，經(jīng)MTT處理后在570nm處測(cè)量吸光值，并根據(jù)此值計(jì)算細(xì)胞的活力。不同濃度的材料對(duì)細(xì)胞增殖的影響以緩沖液PBS處理的細(xì)胞為對(duì)照進(jìn)行比較。與PBS對(duì)照組相比，USPI O-PE1-Ac-F1-PEG-FA在Fe的實(shí)驗(yàn)濃度為O到1.5mM范圍內(nèi)對(duì)HeLa細(xì)胞的存活率的影響沒有顯著性差異，細(xì)胞存活率均在87%以上，即使Fe的實(shí)驗(yàn)濃度高達(dá)
2.0mM，僅有25.4%的細(xì)胞死亡。這充分說明USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA具有良好的細(xì)胞相容性，可以應(yīng)用到生物體內(nèi)MRI成像診斷。
[0039](9)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果
[0040]通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)HeLa細(xì)胞對(duì)本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒在不同濃度下的吞噬量和處理后細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(如圖8)來檢測(cè)葉酸靶向性效果。在本研究中，正常的HeLa細(xì)胞被定義為高FA受體的HeLa細(xì)胞，而被FA(2.0mM)阻斷2小時(shí)的HeLa細(xì)胞被定義為低FA受體的HeLa細(xì)胞。兩組不同的細(xì)胞與USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe 濃度為 0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8 和 1.0mM)在 37°C下共培養(yǎng)4小時(shí)，然后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。在圖8中，在濃度0.05-0.6mM范圍內(nèi)，高FA受體的HeLa細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度明顯高于低FA受體的HeLa細(xì)胞。而在濃度為0.8和1.0mM時(shí)，高FA受體的HeLa細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度也高于低FA受體的HeLa細(xì)胞，只是不明顯，這可能是因?yàn)樵诟邼舛葧r(shí)細(xì)胞吞噬起到了主導(dǎo)作用。這些結(jié)果說明葉酸的修飾賦予了納米顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞的特異靶向能力。
[0041](10)共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果
[0042]葉酸的靶向性同樣通過共聚焦顯微鏡來驗(yàn)證，如圖9所示，高FA受體的HeLa細(xì)胞和低FA受體的HeLa細(xì)胞分別與PBS、本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒(Fe濃度為0.4mM)在37°C下共培養(yǎng)4小時(shí)，然后在油鏡下觀察細(xì)胞吞噬納米顆粒后的熒光信號(hào)。在圖9中，經(jīng)過PBS處理的細(xì)胞內(nèi)沒有熒光；納米材料處理后的低FA受體的HeLa細(xì)胞內(nèi)顯示出比較微弱的熒光信號(hào)；而處理后高FA受體的HeLa細(xì)胞內(nèi)顯示出很強(qiáng)的熒光信號(hào)，這進(jìn)一步說明葉酸修飾的納米顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞有更好的祀向性,從而為該材料成功高效地應(yīng)用到體內(nèi)MRI成像提供了可靠的依據(jù)。
[0043](11)體外細(xì)胞MRI成像結(jié)果
[0044]在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之前，我們?cè)u(píng)價(jià)了本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的細(xì)胞MRI成像效果(如圖10所示)，高FA受體的HeLa細(xì)胞和低FA受體的HeLa細(xì)胞與 USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA 納米顆粒(Fe 濃度為 0.1、0.2、0.3 和 0.4mM)在 37 °C 下共培養(yǎng)4小時(shí)，并且以PBS處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。在圖1Oa中，隨著Fe濃度的增加，USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒處理后的細(xì)胞均表現(xiàn)出MRI信號(hào)衰減的趨勢(shì)，說明隨著Fe濃度的增加，細(xì)胞對(duì)納米顆粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在相同的Fe濃度下，USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒處理后的高FA受體的HeLa細(xì)胞比低FA受體的HeLa細(xì)胞的MRI信號(hào)降低更明顯，說明高FA受體的HeLa細(xì)胞對(duì)USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的吞噬量要大大高于低FA受體的HeLa細(xì)胞。圖1Ob是細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的納米顆粒處理后的MRI成像信號(hào)值，從圖中明顯看出，隨著Fe濃度的增加，細(xì)胞的MRI信號(hào)值均逐漸減少，而且在相同的Fe濃度下，USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒處理后高FA受體的HeLa細(xì)胞的MRI信號(hào)值要明顯低于低FA受體的HeLa細(xì)胞的MRI信號(hào)值。這些結(jié)果不僅說明制備的納米顆粒具有很好的細(xì)胞MRI成像效果，而且證明了 USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞的特異靶向性。 [0045](12)體內(nèi)腫瘤MRI成像結(jié)果
[0046]裸鼠I直接采用尾靜脈注射本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒PBS溶液，裸鼠2和3分別是通過尾靜脈和瘤內(nèi)注射葉酸PBS溶液(20mM，0.1mL) 30分鐘后，再尾靜脈注射本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒PBS溶液，以此來評(píng)價(jià)腫瘤部位的MRI成像效果(如圖11所示)。與注射前的對(duì)照組相比較，在注射后I小時(shí)內(nèi)，裸鼠2和裸鼠3在尾靜脈注射USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe的濃度為80mM，0.1mL)后腫瘤部位稍微變暗，而只注射USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe的濃度為80mM，0.1mL)的裸鼠I腫瘤明顯變暗，展示出葉酸修飾的納米顆粒具有明顯的MRI腫瘤診斷效果。在注射后2小時(shí)，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的裸鼠腫瘤部位明暗程度都逐漸恢復(fù)，說明此時(shí)納米材料隨著血液循環(huán)已經(jīng)從腫瘤部位逐漸代謝出去(圖11a)。圖1lb是相應(yīng)注射時(shí)間的腫瘤MRI信號(hào)值變化，在注射后I小時(shí)，裸鼠2和裸鼠3的腫瘤MRI信號(hào)值變化不明顯，裸鼠I的腫瘤MRI信號(hào)值明顯降低，在注射后2小時(shí)，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的裸鼠腫瘤部位MRI信號(hào)值均有所增加，這與圖1la的結(jié)果一致。這些結(jié)果說明本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒具有很好的腫瘤靶向能力，能成功應(yīng)用于體內(nèi)靶向MRI腫瘤成像診斷的造影劑。
[0047]有益.效果
[0048](I)本發(fā)明采用簡(jiǎn)單的還原法制備水溶性良好的PEI包覆的USPIO納米顆粒，然后在納米顆粒表面先后連接C00H-PEG-FA和FI分子，最后對(duì)納米顆粒的表面氨基進(jìn)行乙酰化修飾得到用于MRI造影劑的USPIO納米顆粒；此法操作工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，易于操作分離，所用均為廉價(jià)的和環(huán)境友好的材料，具有實(shí)施商業(yè)化的前景；
[0049](2)本發(fā)明制備的USPIO納米顆粒能夠長(zhǎng)時(shí)間地穩(wěn)定分散于水溶液中，沒有出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象；PEI的包覆增加了 USPIO納米顆粒的穩(wěn)定性，C00H-PEG-FA的表面修飾不僅增加了 USPIO納米顆粒的生物相容性和親水性，而且賦予納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞或者腫瘤部位的靶向特異性；這些優(yōu)點(diǎn)使制備的葉酸靶向性USPIO納米顆?？梢杂行У赜米黧w內(nèi)MRI成像的陰性造影劑。
【專利附圖】

【附圖說明】[0050]圖1是本發(fā)明制備的USPIO(a)和USPIO-PEI (b)納米顆粒的X-射線衍射圖；
[0051]圖2 是 USPIO (a) ,USPIO-PEI (b),USPIO-PE1-PEG-FA (c)和 FA (d)的傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜譜圖；
[0052]圖3是本發(fā)明制備的USPIO-PEI (a)、USPIO-PE1-PEG-FA (b)的熱重分析圖；
[0053]圖4 是本發(fā)明制備的 USPIO-PE1-PEG-FA(a)和 USPIO-PE1-F1-PEG-FA(b)的紫外吸收?qǐng)D譜；圖5是本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA的透射電鏡圖片(a)和尺寸分布直方圖(b);圖6是本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的T1和T2弛豫時(shí)間倒數(shù)與Fe濃度的線性關(guān)系圖；
[0054]圖7是MTT法測(cè)試的HeLa細(xì)胞經(jīng)過PBS緩沖液(對(duì)照)和本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒(Fe的濃度范圍在0.2-2.0mM)處理24小時(shí)后的細(xì)胞活力；
[0055]圖8是高FA受體的HeLa細(xì)胞和低FA受體的HeLa細(xì)胞與本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 納米顆粒的 PBS 溶液(Fe 的濃度為 0,0.05,0.1,0.2,0.4,0.6、
0.8、1.0mM)共培養(yǎng)4小時(shí)后的細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度；
[0056]圖9是高FA受體的HeLa細(xì)胞經(jīng)過PBS緩沖液(對(duì)照，a)、本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒(b) (Fe濃度為0.4mM)和低FA受體的HeLa細(xì)胞經(jīng)過本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒(c) (Fe濃度為0.4mM)處理4小時(shí)后細(xì)胞的共聚焦顯微成像圖片；
[0057]圖10是高FA受體的HeLa細(xì)胞和低FA受體的HeLa細(xì)胞與本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒(Fe濃度范圍在0.1-0.4mM)處理4小時(shí)后的細(xì)胞T2MRI成像圖片(a)和相應(yīng)的MRI信號(hào)值變化(b)；
[0058]圖11是裸鼠1、2和3分別尾靜脈注射本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒PBS溶液(Fe:80mM,0.1mL)后不同時(shí)間點(diǎn)裸鼠腫瘤的T2MRI成像圖片(a)和相應(yīng)的MRI信號(hào)值變化(b);裸鼠I直接采用尾靜脈注射本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒PBS溶液，而裸鼠2和3分別通過尾靜脈和瘤內(nèi)注射葉酸PBS溶液(20mM，0.1mL) 30分鐘后，再尾靜脈注射本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒PBS溶液。
【具體實(shí)施方式】
[0059]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0060]實(shí)施例1
[0061]將1.30g FeCl3.6H20溶解于20mL超純水中，移入250mL三口瓶中攪拌；氮?dú)夤拇?0~15分鐘后，將0.2g亞硫酸鈉溶于IOmL超純水后加入到三口瓶中，持續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘；然后依次將0.5g超支化聚乙烯亞胺PEI的水溶液和2mL的NH3.H2O也加入到三口瓶中，60~70°C下恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)30分鐘；接著在室溫下反應(yīng)1.5小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將所得到的黑色沉淀USP10-PEI磁分離除去上清液，再加適量超純水超聲分散，再磁分離，如此重復(fù)超純水洗滌三次，以除去雜質(zhì)，然后重新分散于20mL超純水中，即得PEI包覆的USPIO納米顆粒(USPIO-PEI)。同時(shí)用相同的方法在缺少PEI的情況下制備裸露的USPIO作為對(duì)照。取3mL納米顆粒溶液，真空冷凍干燥用于X-射線衍射檢測(cè)。XRD結(jié)果顯示了 USPIO和USP10-PEI納米顆粒的晶體結(jié)構(gòu)為四氧化三鐵(見附圖1)。通過對(duì)比USPIO(見附圖2a)、USPIO-PEI (見附圖 2b)的紅外譜圖，發(fā)現(xiàn) USP10-PEI 在 1630,2850,2930 和 3450cm-1 處有較強(qiáng)的吸收峰，由此可知PEI成功包裹在USPIO上；取凍干的USPIO-PEI進(jìn)行熱重分析(見附圖3)。TG測(cè)試結(jié)果表明，USPIO-PEI在溫度升至700°C時(shí)，重量為原來的88.53%，(見附圖3a)，經(jīng)過計(jì)算，PEI上載率為11.47%，由此表明PEI已成功包裹在USPIO上。
[0062]實(shí)施例2
[0063]取38.46mg C00H-PEG_FA、31.6mg EDC 和 19.0mg NHS 分別溶于 2mL DMSO,并將溶液混合后攪拌活化3h。然后將活化的C00H-PEG-FA溶液(6mL)逐滴加入到IlOmg實(shí)施例I制備的USPIO-PEI的DMSO溶液中，攪拌反應(yīng)三天，再用超純水磁分離洗滌3次，產(chǎn)物USPIO-PE1-PEG-FA重新分散于IlmL DMSO中。并取ImL用水洗滌后重新分散于水中，冷凍干燥，用于紅外光譜分析。通過比較USP10-PEI(見附圖2b)和USPIO-PE1-PEG-FA (見附圖2c)，發(fā)現(xiàn)USPIO-PE1-PEG-FA在1045cm-1處有較強(qiáng)的吸收峰，結(jié)合FA(見附圖2d)的紅外譜圖可知PEG-FA成功接到USPIO-PEI上。另外，USPIO-PE1-PEG-FA納米顆粒失重被測(cè)為
23.92% (見附圖3b)，減去USPIO-PEI的失重量，可計(jì)算得C00H-PEG-FA上載率12.45%,由此表明C00H-PEG-FA已成功連接到USPIO納米顆粒的表面，與上述結(jié)果一致。
[0064]實(shí)施例3
[0065]將2mL DMSO溶解的FI溶液加入到實(shí)例2中制備的USPIO-PE1-PEG-FA的DMSO溶液中，攪拌反應(yīng)I~3天后，產(chǎn)物USPIO-PE1-F1-PEG-FA分離洗滌3次，磁分離除去上清液，再加適量超純水超聲分散，再磁分離，如此重復(fù)純水洗滌3次，以除去雜質(zhì)，然后重新分散于 IOmL 水中，即得到產(chǎn)物 USPIO-PE1-F1-PEG-FA。分別取 25 μ L USPIO-PE1-PEG-FA (實(shí)施例2) ,USPIO-PE1-F1-PEG-FA(實(shí)施例3)的水溶液于2mL離心管中，再向其中加700 μ L超純水，超聲均勻，測(cè)紫外吸收(見附圖4)。紫外可見光譜測(cè)試結(jié)果表明，USPIO-PE1-PEG-FA在400到600nm處沒有明顯的紫外吸收峰，而USPIO-PE1-F1-PEG-FA在505nm處有一個(gè)明顯的紫外吸收峰，從而說明FI成功修飾到USPIO-PE1-PEG-FA納米顆粒表面。
[0066]實(shí)施例4
[0067]向?qū)嵤├?制備的USPIO-PE1-F1-PEG-FA納米顆粒水溶液(IOmL)中加入493 μ L三乙胺(密度為0.726~0.729g/mL，濃度為99.0% )，并攪拌30分鐘。然后向上述溶液中逐滴加入402yL乙酸酐(密度為1.08g/mL，濃度為98.5 %)(三乙胺、乙酸酐與USPIO-PE1-F1-PEG-FA的表面氨基摩爾比=10:10:1)，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24小時(shí)。產(chǎn)物用超純水磁分離洗滌3次，并重新分散到5mL超純水中，即制得乙?；腢SPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒。取本發(fā)明制備的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA(實(shí)施例4)用超純水分別配制成
1.5mL的水溶液用于測(cè)表面電勢(shì)和水動(dòng)力直徑(如表1)。電勢(shì)結(jié)果顯示乙?；蠹{米顆粒的表面電勢(shì)是+24.2mV，而其分散于水、PBS和細(xì)胞培養(yǎng)基中后的水動(dòng)力粒徑分別是310.1、315.6 和 217.3nm (表 I)。
[0068]表1.USPIO-PE1-F1-PEG-FA納米顆粒分散于水中的電勢(shì)和在不同溶液中的水動(dòng)力粒徑。
[0069]
【權(quán)利要求】
1.一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法，包括: (1)將三價(jià)鐵鹽溶解于超純水中，攪拌，鼓吹氮?dú)?，然后加入亞硫酸鈉溶液后，攪拌反應(yīng)20-30min，再加入超支化聚乙烯亞胺PEI水溶液和NH3.H20,60-70°C條件下，攪拌反應(yīng)20-30min，然后室溫條件下反應(yīng)0.5-1.5h，分離洗滌，得到PEI包裹的超順磁氧化鐵納米顆粒USP10-PEI ;然后將USP10-PEI洗滌，分散于溶劑中；其中三價(jià)鐵鹽、超純水、NH3.H2O的配比為1.2~1.4g:20~25mL:2~3mL，三價(jià)鐵鹽、亞硫酸鈉、超支化聚乙烯亞胺PEI質(zhì)量比為 1.2 ~1.4:0.21 ~0.25:0.51 ~0.53 ; (2)將葉酸FA溶解于溶劑中，用EDC和NHS活化2_4h，滴加到NH2-PEG-C00H溶液中，攪拌反應(yīng)2-4天，透析，然后真空冷凍干燥，即得C00H-PEG-FA ;其中FA和NH2-PEG-C00H的摩爾比為1.8-2:1 ； (3)將上述C00H-PEG-FA、EDC和NHS溶解于溶劑中，攪拌活化2_4h，得到活化后的C00H-PEG-FA，然后加入步驟⑴中，攪拌反應(yīng)2_4d，分離洗滌，分散，得到USPIO-PE1-PEG-FA納米顆粒；其中活化后的C00H-PEG-FA與USP10-PEI納米顆粒表面氨基的摩爾比為1:23~25 ; (4)將異硫氰酸熒光素FI溶液加入步驟(3)中，攪拌反應(yīng)0.5-ld，分離，洗滌，分散，得到USPIO-PE1-F1-PEG-FA納米顆粒溶液；然后加入三乙胺，攪拌反應(yīng)20_40min，再加入乙酸酐，攪拌反應(yīng)20-30h，離心洗滌，分散，得到葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA ;其中 FI 與 USP10-PEI 表面氨基的摩爾比為 1:39-40。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中三價(jià)鐵鹽為FeCl3.6H20 ；NH3.H2O質(zhì)量百分比濃度為25-28%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中鼓吹氮?dú)獾臅r(shí)間為10-15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中超支化聚乙烯亞胺PEI的相對(duì)分子量為25000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟⑵中FA、EDC和NHS的摩爾比為1:0.8-1:0.8-1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中NH2-PEg-COOH的相對(duì)分子量為2000。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中C00H-PEG-FA與EDC, NHS的摩爾比為1:8-10:8-10。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中三乙胺、乙酸酐與USPIO納米顆粒表面的PEI上伯氨基摩爾比為8-10:10-12:1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)-(3)中溶劑均為二甲基亞砜DMSO ;分散為分散于二甲基亞砜DMSO中。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的超順磁氧化鐵納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中FI溶液的溶劑為二甲基亞砜DMS0，分散為均分散于水中。
【文檔編號(hào)】A61K49/12GK103933584SQ201410182821
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】沈明武, 李靜超, 胡勇, 孫文杰, 史向陽(yáng) 申請(qǐng)人:東華大學(xué)