一種用于基因治療的基因載體系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于基因治療的基因載體系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用。所述基因載體系統(tǒng)包括金納米顆粒和與所述金納米顆粒相連的三螺旋形成寡核苷酸，所述金納米顆粒的粒徑為1-6nm，所述三螺旋形成寡核苷酸能夠與靶基因上的序列結(jié)合而沉默所述靶基因。本發(fā)明的基因載體系統(tǒng)中，金納米顆粒對(duì)三螺旋形成寡核苷酸具有保護(hù)作用，能夠保護(hù)其免于DNA酶降解，因此是一種能夠用于基因治療的良好的基因載體系統(tǒng)，可應(yīng)用于臨床基因治療。本發(fā)明還提供所述基因載體系統(tǒng)的制備方法和應(yīng)用，其制備方法簡(jiǎn)單易行，不涉及復(fù)雜的操作和苛刻條件，并且成本較低。
【專利說(shuō)明】一種用于基因治療的基因載體系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因治療【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用于基因治療的基因載體系統(tǒng)及其 制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 從廣義說(shuō)，基因治療包括從DNA水平采取的治療某些疾病的措施和新技術(shù)。其中， 將特定的反義核酸（反義RNA、反義DNA)和核酶導(dǎo)入細(xì)胞，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷某些基因 的異常表達(dá)，而實(shí)現(xiàn)治療的目的方法，可稱為基因沉默。
[0003] 基因治療都需要將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，其轉(zhuǎn)移方法較多，常用的要有下列幾類： 1)化學(xué)法：將正?；?DNA(及其拷貝）與帶電荷物質(zhì)和磷酸鈣、DEAE-葡萄糖或與若干脂 類混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，直接傾入培養(yǎng)基中與細(xì)胞接觸，由于鈣離子有促進(jìn)DNA 透過(guò)細(xì)胞的作用，某些化合物可擾亂細(xì)胞膜，故可將DNA輸入細(xì)胞內(nèi)，并整合于受體細(xì)胞的 基因組中，在適當(dāng)?shù)臈l件下，整合基因得以表達(dá)，細(xì)胞亦可傳代。這種方法簡(jiǎn)單，但效率極 低，一般1000-100000個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞可結(jié)合導(dǎo)入的外源基因。要達(dá)到治療目的，就 需要從病人獲得大量所需的受體細(xì)胞。2)物理法：包括電穿孔法和直接顯微注射法。①電 穿孔法：電穿孔法（electroporotion)是將細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中，通過(guò)電擊使細(xì)胞產(chǎn) 生可逆性的穿孔，周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，但有時(shí)也會(huì)使細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。②顯微 注射法：顯微注射（microinjection)是在顯微鏡直視下，向細(xì)胞核內(nèi)直接注射外源基因， 這種方法應(yīng)是有效的。但一次只能注射一個(gè)細(xì)胞，工作耗力費(fèi)時(shí)。此法用于生殖細(xì)胞時(shí)，有 效率可達(dá)10%。直接用于體細(xì)胞卻很困難。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用這種方法將目的基因注入 生殖細(xì)胞，使之表達(dá)而傳代，這樣的動(dòng)物就稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如今成功使用得較多的是轉(zhuǎn)基 因小鼠 （transgenic mice)，它可作為繁殖大量后代的疾病動(dòng)物模型。③脂質(zhì)體法：脂質(zhì)體 (liposome)法是應(yīng)用人工脂質(zhì)體包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，或直接注入病灶組織，使 之表達(dá)。3)同源重組法：同源重組（homologous recombination)是將外源基因定位導(dǎo)入受 體細(xì)胞的染色體上，在外源基因?qū)?yīng)的染色體座位上，因有同源序列，通過(guò)單一或雙交換， 新基因片段替換有缺陷的片段，達(dá)到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁組裝Neo基 因，則在同源重組后，因有Neo基因，可在含有新霉素（neomycin)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，從而使 未插入新基因片段的細(xì)胞死亡。對(duì)于體細(xì)胞基因治療，體外培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，篩選 量大，故在臨床上應(yīng)用也受限制難以進(jìn)行。4)病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移：前述的化學(xué)和物理方法 都是通過(guò)轉(zhuǎn)染方式基因轉(zhuǎn)移。病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移（viral mediatedgene transfer)是通過(guò) 轉(zhuǎn)換方式完成基因轉(zhuǎn)移，即以病毒為載體（vector)，將外源目的基因通過(guò)基因重組技術(shù)，將 其組裝于病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細(xì)胞，這種病毒稱為病毒運(yùn)載體（viral vector)。然而，病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移在臨床上有風(fēng)險(xiǎn)。
[0004] 在研究基因轉(zhuǎn)移方法的同時(shí)，人們也關(guān)注用于基因沉默的核酸片段的研究。其中， 三螺旋形成寡核苷酸（triplex forming oligo-deoxynucleotides，TF0)通過(guò)與雙鏈 DNA 形成Hoogsteen氫鍵，插入到雙鏈DNA的大溝（major groove)中。Hoogsteen氫鍵的形成 遵循Hoogsteen堿基配對(duì)原則，因此可以設(shè)計(jì)具有特異性的三螺旋形成寡核苷酸，結(jié)合到 靶基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，阻止轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄起始，達(dá)到基因沉默的目的。然 而，三螺旋形成寡核苷酸極不穩(wěn)定，容易被DNA酶降解，因此限制了其應(yīng)用。研究人員曾利 用多種方式對(duì)三螺旋形成寡核苷酸進(jìn)行修飾以防止其被降解，此前也有報(bào)道稱13nm金納 米顆粒可以提高三螺旋形成寡核苷酸的穩(wěn)定性，但是效果都比較有限。至今仍沒有載體能 將三螺旋形成寡核苷酸直接帶入細(xì)胞核內(nèi)起作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 據(jù)報(bào)道，細(xì)胞核孔復(fù)合物孔徑大小一般在9nm左右，細(xì)胞核一般只允許尺寸在9nm 以下的某些物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞核。結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種用于基因治療的基因 載體系統(tǒng)，其不僅能對(duì)三螺旋形成寡核苷酸具有保護(hù)作用，能夠保護(hù)其免于DNA酶降解，而 且能將三螺旋形成寡核苷酸直接帶入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，大幅度提高效果。因此是一種能 夠用于基因治療的良好的基因載體系統(tǒng)，可應(yīng)用于臨床基因治療。本發(fā)明還提供所述基因 載體系統(tǒng)的制備方法和應(yīng)用，其制備方法簡(jiǎn)單易行，不涉及復(fù)雜的操作和苛刻條件，并且成 本較低。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0007] 在第一方面，本發(fā)明提供一種用于基因治療的基因載體系統(tǒng)，包括金納米顆粒和 與所述金納米顆粒相連的三螺旋形成寡核苷酸，所述金納米顆粒的粒徑為l-6nm，所述三螺 旋形成寡核苷酸能夠與靶基因上的序列結(jié)合而沉默所述靶基因。
[0008] 本發(fā)明的基因載體系統(tǒng)中，金納米顆粒和三螺旋形成寡核苷酸相連，能夠保護(hù)三 螺旋形成寡核苷酸免于DNA酶降解，提高基因沉默效率。
[0009] 金納米顆粒與三螺旋形成寡核苷酸的連接，可以用目前已有的金納米顆粒與核苷 酸連接的方法實(shí)現(xiàn)，只要能夠?qū)崿F(xiàn)二者的連接即可。當(dāng)然，未來(lái)開發(fā)出的技術(shù)也可能適用。 [0010] 作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述金納米顆粒和三螺旋形成寡核苷酸以N-(2-巰 基丙?；?甘氨酸為連接子互連，所述N- (2-巰基丙?；?甘氨酸的巰基與所述金納米 顆粒形成共價(jià)鍵合，所述N- (2-巰基丙?；?甘氨酸的羧基與所述三螺旋形成寡核苷酸的 5'端修飾的氨基形成酰胺鍵連接。
[0011] 已經(jīng)證明，采用N- (2-巰基丙?；?甘氨酸作為連接子，能夠?qū)崿F(xiàn)金納米顆粒與 三螺旋形成寡核苷酸的高效、穩(wěn)定的連接，因?yàn)镹-(2-巰基丙?；?甘氨酸的巰基與金納 米顆粒形成共價(jià)鍵合，N-(2-巰基丙?；?甘氨酸的羧基與三螺旋形成寡核苷酸的5'端 修飾的氨基形成酰胺鍵連接，都是非常專一和穩(wěn)定的。
[0012] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，采用N-(2-巰基丙?；?甘氨酸作為連接子只是 本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，其基于巰基與金的共價(jià)鍵合以及羧基與氨基形成酰胺鍵連接的原 理，因此其它帶有巰基端和羧基端的小分子也可以作為本發(fā)明的金納米顆粒與三螺旋形成 寡核苷酸的連接子，例如谷胱甘肽等。此外，即使沒有連接小分子，在三螺旋形成寡核苷酸 單鏈一端修飾巰基，直接與金納米顆粒表面共價(jià)鍵合連接，也可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0013] 需要說(shuō)明的是：針對(duì)靶基因上的序列設(shè)計(jì)與其特異性結(jié)合的三螺旋形成寡核苷酸 的技術(shù)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)其具備的知識(shí)和技能針對(duì)要 沉默的靶基因設(shè)計(jì)合適的三螺旋形成寡核苷酸，并通過(guò)人工方法合成。
[0014] 本發(fā)明中，所述金納米顆粒的粒徑為l_6nm，在該范圍內(nèi)，金納米顆粒載運(yùn)三螺旋 形成寡核苷酸進(jìn)入細(xì)胞核的能力比較強(qiáng)，而且能夠有效保護(hù)三螺旋形成寡核苷酸免于DNA 酶降解；并且金納米顆粒與三螺旋形成寡核苷酸的比例關(guān)系比較合理，沒有金納米顆?；?三螺旋形成寡核苷酸過(guò)量冗余的問(wèn)題。
[0015] 作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述金納米顆粒的粒徑為2nm。
[0016] 作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述靶基因?yàn)樾枰獙?shí)施基因治療的基因，優(yōu)選為原 癌基因。通過(guò)將所述基因載體系統(tǒng)導(dǎo)入特定細(xì)胞（比如腫瘤細(xì)胞）的細(xì)胞核，所述基因載 體系統(tǒng)上的三螺旋形成寡核苷酸通過(guò)與雙鏈DNA形成Hoogsteen氫鍵，插入到雙鏈DNA的 大溝中。如果插入位點(diǎn)正好位于特定基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，那么三螺旋形成寡核苷酸結(jié)合 到靶基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，阻止轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄起始，達(dá)到基因沉默的目的， 實(shí)現(xiàn)基因治療。
[0017] 作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述靶基因上的序列為轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的序列，優(yōu)選為 啟動(dòng)子序列。
[0018] 在第二方面，本發(fā)明提供一種制備第一方面所述的基因載體系統(tǒng)的方法，包括：將 粒徑為l-6nm的金納米顆粒和能夠與靶基因上的序列結(jié)合而沉默所述靶基因的三螺旋形 成寡核苷酸連接形成所述基因載體系統(tǒng)。
[0019] 作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述方法包括如下步驟：
[0020] (1)在還原劑的存在下，使氯金酸與N-(2-巰基丙?；甘氨酸接觸，生成金納米 顆粒，所述金納米顆粒與所述N- (2-巰基丙?；?甘氨酸的巰基形成共價(jià)鍵合；
[0021] (2)在催化劑的存在下，使步驟（1)生成的連有N-(2-巰基丙?；?甘氨酸的金 納米顆粒與5'端修飾氨基的三螺旋形成寡核苷酸接觸，形成酰胺鍵連接，得到所述基因載 體系統(tǒng)。
[0022] 作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述還原劑為硼氫化鈉。
[0023] 優(yōu)選地，所述催化劑為1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基 琥珀酰亞胺。
[0024] 在第三方面，本發(fā)明提供一種基因治療試劑，包括第一方面所述的基因載體系統(tǒng)。 除所述基因載體系統(tǒng)以外，還可以包括緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)液或生理鹽水等其它成分。
[0025] 在第四方面，本發(fā)明提第一方面所述的基因載體系統(tǒng)在制備基因治療試劑中的應(yīng) 用。
[0026] 本發(fā)明中，N-(2_巰基丙?；甘氨酸，又稱硫普羅寧，下文出現(xiàn)的硫普羅寧應(yīng)理 解為指N- (2-巰基丙酰基）-甘氨酸。
[0027] 本發(fā)明中，基因載體系統(tǒng)，在下文有些地方又稱為金納米顆粒-三螺旋形成寡核 苷酸復(fù)合物。
[0028] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的基因載體系統(tǒng)以金納米顆粒表面 載運(yùn)三螺旋形成寡核苷酸的形式存在，其中金納米顆粒對(duì)三螺旋形成寡核苷酸具有保護(hù)作 用，能夠保護(hù)其免于DNA酶降解；而且能將三螺旋形成寡核苷酸直接帶入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作 用，大幅度提高效果。。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在三螺旋形成寡核苷酸濃度相同的情況下，本發(fā)明的基因 載體系統(tǒng)比游離三螺旋形成寡核苷酸具有更強(qiáng)的抑制靶基因表達(dá)的能力，因此對(duì)腫瘤細(xì)胞 等惡性細(xì)胞具有更強(qiáng)的毒性，因此是一種能夠用于基因治療的良好的基因載體系統(tǒng)，可應(yīng) 用于臨床基因治療中。本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單易行，不涉及復(fù)雜的操作和苛刻條件，并且成 本較低。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備粒徑為2nm的硫普羅寧（ΤΙ0Ρ)包被的金納米顆粒 (Au-TIOP NPs)的反應(yīng)原理圖。
[0030] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備的粒徑為2nm的硫普羅寧（ΤΙ0Ρ)包被的金納米顆粒 (Au-TIOP NPs)的透射電鏡照片，標(biāo)尺為20nm。
[0031] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1制備粒徑為2nm的金納米顆粒載P0Y2T三螺旋形成寡核苷 酸（Au-P0Y2T NPs)的反應(yīng)原理圖。
[0032] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例1制備的粒徑為2nm的金納米顆粒載P0Y2T三螺旋形成寡 核苷酸（Au-P0Y2T NPs)的透射電鏡照片，標(biāo)尺為20nm。
[0033] 圖5為本發(fā)明試驗(yàn)例1中乳腺癌細(xì)胞分別在不同濃度（0. 1 μ Μ、1 μ M、2. 5 μ Μ、5 μ Μ 和1(^]?)的411-1'10?咿8、游離？0￥21^11-?0￥21咿8、游離？0￥21'和411-?0￥2了咿8中處理 24小時(shí)后的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理 解，以下實(shí)施例僅為本發(fā)明的示例性實(shí)施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定 本發(fā)明的范圍。
[0035] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú) 特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購(gòu)買得到的。
[0036] 硼氫化鈉（彡98. 0%，NaBH4)、三水氯金酸鹽（彡99. 9%，HAuC14 · 3Η20)、檸檬酸 三鈉（>99.0 %，trisodium citrate tribasic dihydrate)、Ν_ (2-疏基丙醜基）-甘氨酸 (N-(2_mercapt〇-propionyl)glycine，硫普羅寧，tiopronin)、Ν-輕基琥拍酰亞胺（98%, N_hydroxysuccinimide,NHS,C4H5N03)和 1-(3-二甲氨基丙基）-3_ 乙基碳二亞胺鹽酸鹽（N-G-DimethylaminopropylJ-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC,C8H17N3 *HC1)均購(gòu) 自Sigma-Aldrich(St Louis,美國(guó)）公司；實(shí)驗(yàn)中用到的DNA單鏈（三螺旋形成寡核苷酸） 均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，純度均大于95% ;所有化學(xué)試劑用之前均 未經(jīng)過(guò)其他處理，整個(gè)實(shí)驗(yàn)使用的超純水采用密理博公司的Milli-Q三蒸水（18. 2ΜΩ ·_， Millipore System Inc)〇
[0037] 實(shí)施例1
[0038] 本實(shí)施例以 2nm 的金納米顆粒載 P0Y2T(TGGGTGGGTGGTTTGTTTTTGGG，SEQ ID NO :1)三螺旋形成寡核苷酸（Au-P0Y2T NPs)為例說(shuō)明基因載體系統(tǒng)的制備。其 中P0Y2T具有特異性下調(diào)原癌基因 c-myc表達(dá)的功能；以將P0Y2T序列打亂設(shè)計(jì)的 P0Y2M(GGTGTGTTGTTGGTGGTGTGTTG，SEQ ID N0:2)無(wú)意義寡核苷酸序列作為對(duì)照。
[0039] 首先，介紹2nm硫普羅寧包被的金納米顆粒（2nm Au-TIOP NPs)的制備，以硼氫化 鈉（NaBH4)作為還原劑，硫普羅寧（Tiopronin)作為穩(wěn)定劑，制備2nm的金納米顆粒，反應(yīng) 原理如圖1所示。
[0040] 具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0041] (1)分別量取18mL甲醇和3mL乙酸于50mL錐形瓶，緩慢攪拌均勻；
[0042] (2)分別移取15mLl % HAuC14加入到以上溶液中，并稱取191. 3mg硫普羅寧 (tiopronin)溶于lmL三蒸水緩慢滴加至其中，攪拌約30min ;
[0043] (3)稱量0· 3g NaBH4溶于2mL冰水，在劇烈攪拌下緩慢滴加至錐形瓶中，隨著NaBH4 溶液的加入，溶液顏色逐漸加深，同時(shí)伴隨放熱，滴加完畢，室溫繼續(xù)攪拌2h ;
[0044] (4)將所得溶液經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉溶劑，透析除去多余的保護(hù)劑，得到深色均質(zhì)溶 液，即得到2nm表面硫普羅寧包被的金納米顆粒Au-TIOP NPs，其透射電鏡照片如圖2所示。
[0045] 后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用到的金納米顆粒溶液中金元素濃度由電感耦合等離子體發(fā)射光 譜儀（ICP-0ES)測(cè)得。
[0046] 然后，介紹2nm的金納米顆粒載P0Y2T三螺旋形成寡核苷酸（Au-P0Y2TNPs)的制 備，反應(yīng)原理如圖3所示。
[0047] 具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0048] (1)材料準(zhǔn)備：2nm Au-TIOP NPs(濃度為 25μΜ)、合成的 NH2-P0Y2T 和 NH2-P0Y2M(5'端氨基修飾，濃度均為ΙΟΟμΜ)和催化劑EDC/NHS ;
[0049] (2)在含有200 μ L三蒸水的玻璃試管中加入30 μ L2nm Au-TIOP NPs溶液，緩慢攪 拌 10min ;
[0050] (3)在以上溶液中加入10 μ L濃度為100 μ Μ的EDC溶液，緩慢攪拌15min ;
[0051] (4)在以上溶液中加入10 μ L濃度為100 μ Μ的NHS溶液，緩慢攪拌15min ;
[0052] (5)加入 250 μ L NH2-P0Y2T 或 NH2-P0Y2M，濃度均為 100 μ M，避光緩慢攪拌 24h ;
[0053] (6)反應(yīng)得到的液體裝于透析袋內(nèi)（MWC0 = 1000)放于裝有三蒸水的大燒杯中避 光透析2d,每8h更換透析外液；
[0054] (7)收集透析袋內(nèi)溶液，得到2nm金納米顆粒-三螺旋形成寡核苷酸復(fù)合物（分 別為Au-P0Y2T NPs和Au-P0Y2M NPs)的溶液，用于后續(xù)細(xì)胞毒性試驗(yàn)，其中，Au-P0Y2T NPs 的透射電鏡照片如圖4所示。
[0055] 最后，進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0056] 分別以本實(shí)施例制得的不同濃度（0. 1 μ Μ、1 μ M、2. 5 μ Μ、5 μ Μ和10 μ M)的 Au-TIOP NPs、游離 P0Y2M、Au-P0Y2M NPs、游離 Ρ0Υ2Τ 和 Au-P0Y2T NPs 中處理乳腺癌細(xì)胞 MCF-724小時(shí)，統(tǒng)計(jì)不同濃度的上述物質(zhì)處理后的細(xì)胞活性（即細(xì)胞存活率），結(jié)果如圖5 所示。
[0057] 結(jié)果顯示：游離P0Y2T對(duì)MCF-7細(xì)胞孵育24h后，在2. 5 μ Μ、5 μ Μ和10 μ Μ游離 Ρ0Υ2Τ的濃度下，細(xì)胞存活率顯著下降，而1 μ Μ沒有影響。文獻(xiàn)報(bào)道無(wú)意義的寡核苷酸序 列也對(duì)細(xì)胞有一定毒性，所以將Ρ0Υ2Τ序列打亂設(shè)計(jì)的游離Ρ0Υ2Μ，處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)也有一 定毒性，但是遠(yuǎn)沒有Ρ0Υ2Τ顯著，說(shuō)明Ρ0Υ2Τ的細(xì)胞毒性來(lái)自于對(duì)c-myc轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的特 異性識(shí)別。對(duì)應(yīng)濃度下的2nmAu-P0Y2T NPs對(duì)MCF-7細(xì)胞具有明顯的殺傷效果，在濃度為 1 μ Μ時(shí)，細(xì)胞存活率僅為60%左右，而1 μ Μ的游離P0Y2T對(duì)細(xì)胞存活率幾乎沒有影響。
[0058] 由于AU-P0Y2T中使用的是氨基修飾的寡核苷酸鏈，為排除氨基修飾的干擾，又測(cè) 試了游離ΝΗ 2-Ρ0Υ2Τ的毒性，結(jié)果顯示氨基修飾不會(huì)提高寡核苷酸鏈的毒性。此外，對(duì)應(yīng)濃 度的單純硫普羅寧包被的金納米顆粒（Au-TIOP NPs)對(duì)細(xì)胞存活率影響很小，可忽略。
[0059] 上述結(jié)果說(shuō)明：金納米顆粒（Au NPs)提高了三螺旋形成寡核苷酸的穩(wěn)定性，使原 本在低濃度時(shí)無(wú)細(xì)胞增殖抑制效果的P0Y2T三螺旋形成寡核苷酸產(chǎn)生了明顯的細(xì)胞增殖 抑制效果。
[0060] 實(shí)施例2
[0061] 本實(shí)施例與實(shí)施例1的差別在于將實(shí)施例1中191. 3mg硫普羅寧改為382. 6mg，制 備得到粒徑為lnm的金納米顆粒-三螺旋形成寡核苷酸復(fù)合物（分別為AU-P0Y2T NPs和 Au-P0Y2M NPs)。
[0062] 以本實(shí)施例制得的金納米顆粒-三螺旋形成寡核苷酸復(fù)合物（分別為AU-P0Y2T NPs和Au-P0Y2M NPs)進(jìn)行的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例1的相似。
[0063] 實(shí)施例3
[0064] 本實(shí)施例與實(shí)施例1的差別在于將實(shí)施例1中191. 3mg硫普羅寧改為20. 73mg，制 備得到粒徑為6nm的金納米顆粒-三螺旋形成寡核苷酸復(fù)合物（分別為AU-P0Y2T NPs和 Au-P0Y2M NPs)。
[0065] 以本實(shí)施例制得的金納米顆粒-三螺旋形成寡核苷酸復(fù)合物（分別為AU-P0Y2T NPs和Au-P0Y2M NPs)進(jìn)行的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例1的相似。
[0066] 實(shí)施例4
[0067] 本實(shí)施例以文獻(xiàn)（Karen M. Vasquez等人，Science, 290, 530 (200))報(bào)道的三螺旋 形成寡核苷酸 AG30(5' -AGGAAGGGGGGGGTGGTGGGGGAGGGGGAG-3'，SEQ ID N0:3)為例，按照 實(shí)施例1的方法制備得到2nm金納米顆粒-三螺旋形成寡核苷酸復(fù)合（Au-AG30NPs)。
[0068] 以本實(shí)施例制得的金納米顆粒-三螺旋形成寡核苷酸復(fù)合物（Au-AG30NPs)進(jìn)行 的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示：AG30濃度相同的Au-AG30NPs對(duì)supFGl基因的沉默效果明顯高 于游離AG30對(duì)supFGl基因的沉默效果，說(shuō)明金納米顆粒（AuNPs)提高了三螺旋形成寡核 苷酸AG30的穩(wěn)定性，使其基因沉默能力增強(qiáng)。
[〇〇69] 申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法，但 本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)特征 以及詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā) 明選用組分的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍 和公開范圍之內(nèi)。 序列表 一種用于基因治療的基因載體系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用-序列表20140723084946. txt SEQUENCE LISTING <110 國(guó)家納米科學(xué)中心 <120 一種用于基因治療的基因載體系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用 <130 2014 <160 3 <170 PatentIn version 3.3 <210' 1 <211 23 <212 DNA <213-人工序列 <400 1 tgggtgggtg gtttgttttt ggg 23 <210 2 <211 23 <212. DNA <213 人工序列 <400 2 ggtgtgttgt tggtggtgtg ttg 23 <210 3 <211' 30 〈212. DM <213 人工序列 <400 - 3 aggaaggggg gggtggtggg ggagggggag 30
【權(quán)利要求】
1. 一種用于基因治療的基因載體系統(tǒng)，包括金納米顆粒和與所述金納米顆粒相連的三 螺旋形成寡核苷酸，所述金納米顆粒的粒徑為l-6nm，所述三螺旋形成寡核苷酸能夠與靶基 因上的序列結(jié)合而沉默所述靶基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述金納米顆粒和三螺旋形成 寡核苷酸以N- (2-巰基丙酰基）-甘氨酸為連接子互連，所述N- (2-巰基丙?；?甘氨酸 的巰基與所述金納米顆粒形成共價(jià)鍵合，所述N- (2-巰基丙酰基）-甘氨酸的羧基與所述三 螺旋形成寡核苷酸的5'端修飾的氨基形成酰胺鍵連接。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述金納米顆粒的粒徑為 2nm〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述靶基因?yàn)樾枰獙?shí) 施基因治療的基因，優(yōu)選為原癌基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述靶基因上的序列 為轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的序列，優(yōu)選為啟動(dòng)子序列。
6. -種制備權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的基因載體系統(tǒng)的方法，包括：將粒徑為l-6nm 的金納米顆粒和能夠與靶基因上的序列結(jié)合而沉默所述靶基因的三螺旋形成寡核苷酸連 接形成所述基因載體系統(tǒng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 在還原劑的存在下，使氯金酸與N-(2-巰基丙?；?甘氨酸接觸，生成金納米顆 粒，所述金納米顆粒與所述N- (2-巰基丙酰基）-甘氨酸的巰基形成共價(jià)鍵合； (2) 在催化劑的存在下，使步驟（1)生成的連有N-(2-巰基丙酰基）-甘氨酸的金納米 顆粒與5'端修飾氨基的三螺旋形成寡核苷酸接觸，形成酰胺鍵連接，得到所述基因載體系 統(tǒng)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述還原劑為硼氫化鈉； 優(yōu)選地，所述催化劑為1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀 酰亞胺。
9. 一種基因治療試劑，包括權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的基因載體系統(tǒng)。
10. 如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的基因載體系統(tǒng)在制備基因治療試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104083773SQ201410184248
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月4日
【發(fā)明者】梁興杰, 霍帥東, 金叔賓 申請(qǐng)人:國(guó)家納米科學(xué)中心