Kin17基因或蛋白在制備子宮頸癌診斷及治療藥劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了Kin17基因或蛋白在制備子宮頸癌診斷、預(yù)后評估及治療藥劑中的應(yīng)用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Kin17蛋白在正常子宮頸上皮組織及子宮頸良性病變組織細胞中表達較低，而其在子宮頸癌組織中的表達明顯異常升高，維持了子宮頸癌細胞的快速增殖活性，并且與患者的病理參數(shù)及化療效果、病情進展情況密切相關(guān)，在子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。沉默子宮頸癌細胞中Kin17的表達能抑制腫瘤細胞的增殖活性，也能增強子宮頸癌細胞對化療藥物的敏感性。Kin17基因或蛋白可作為子宮頸癌新的診斷標志及藥物靶標，應(yīng)用于子宮頸癌的早期鑒別診斷、患者預(yù)后評估及臨床治療。
【專利說明】Kin1 7基因或蛋白在制備子宮頸癌診斷及治療藥劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及子宮頸癌新的診斷標志及藥物靶標，具體涉及Kinl7基因或蛋白制備子宮頸癌診斷、預(yù)后評估及治療藥劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]子宮頸癌是女性最常見的惡 性腫瘤之一。2012年我國宮頸癌的發(fā)病率為
12.96/10萬，占全部女性腫瘤構(gòu)成的5.12%，嚴重威脅著我國女性的生命健康。宮頸上皮內(nèi)瘤變及鏡下早期浸潤癌一般無癥狀，子宮頸癌患者在出現(xiàn)典型癥狀后，一般已為浸潤癌。而在經(jīng)手術(shù)與化療等手段的有效治療后，80%的I期和II期宮頸癌患者能獲得明顯的療效。早期篩查與及早診治對子宮頸癌患者的預(yù)后及療效至關(guān)重要。目前用于臨床的早期篩查方法及診斷指標尚不理想。一般的宮頸癌化療藥物缺乏腫瘤特異性，毒性強，副作用大。分子靶向治療方法具有特異性好，副租用小的特點，在治療子宮頸癌患者，特別是晚期的患者中具有獨特的優(yōu)勢。目前宮頸癌靶向藥物還處于早期研發(fā)階段，而且在臨床試驗中出現(xiàn)療效不穩(wěn)定、個體療效差異大、與常規(guī)化療藥協(xié)同作用不佳等一些亟需解決的臨床問題，尚未見療效顯著的分子靶向藥物用于子宮頸癌患者的臨床治療。
[0003]子宮頸癌細胞具有旺盛的增殖力、持續(xù)的DNA復(fù)制潛能和蓄積的DNA損傷。Kinl7蛋白是一個在物種進化過程中十分保守的蛋白質(zhì)，它主要與細胞的DNA復(fù)制、DNA修復(fù)及細胞增殖功能有關(guān)，在人體各組織器官中表達普遍較低。目前，關(guān)于Kinl7基因或蛋白子宮頸癌新的診斷標志及藥物靶標還末見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供Kinl7基因或蛋白在制備子宮頸癌診斷、預(yù)后評估及治療藥劑中的應(yīng)用。
[0005]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Kinl7基因或蛋白可作為子宮頸癌新的診斷標志及藥物靶標，Kinl7蛋白在正常子宮頸上皮組織及子宮頸良性病變組織中表達較低，而其在子宮頸癌組織中的表達明顯異常升高；而且Kinl7維持了子宮頸癌細胞的快速增殖活性，在子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，Kinl7基因(核苷酸序列見SEQIDN0:1)或蛋白(氨基酸序列見SEQ ID NO:2)可作為子宮頸癌新的診斷標志及藥物靶標，Kinl7基因或蛋白可用于子宮頸癌的早期鑒別診斷、腫瘤患者的預(yù)后評估分析及臨床治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0006]圖1:Kinl7在子宮頸良性病變標本的上皮組織及宮頸癌標本的癌巢組織中的表達情況；
圖2:重組質(zhì)粒pET32a-KIN17中插入的Λ7Λ77基因的部分測序圖；
圖3:1PTG誘導(dǎo)Kinl7蛋白在大腸桿菌中原核表達的SDS-PAGE電泳圖；圖4:純化后的His標簽Kinl7蛋白的SDS-PAGE電泳圖(左)與Western_blot鑒定圖(右)；
圖5:用siRNA_Kinl7下調(diào)Kinl7表達(左)，抑制了子宮頸管癌HeLa細胞的生長增殖活性(右)；
圖6:用siRNA_Kinl7剔降Kinl7，能增強紫杉醇對子宮頸癌HeLa細胞增殖的抑制作用。
【具體實施方式】
[0007]Kinl7基因或蛋白的定名與序列
編碼Kinl7蛋白的基因定名為“KIN17基因”，KIN17基因編碼的蛋白定名為“Kinl7蛋白”，KIN17基因的登錄號為:NM_012311。
[0008]KIN17基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]Kin17蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0010]下面結(jié)合具體的實驗對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0011]Kinl7基因或蛋白應(yīng)用于子宮頸癌診斷:
子宮頸癌組織是由子宮頸正常上皮細胞發(fā)生惡性變化及不受控制地增殖而形成的。本發(fā)明人用免疫組織化學方法，檢測了 Kinl7在129例子宮頸活檢標本中的表達，其中包含27例宮頸良性病變標本(含慢性宮頸炎、宮頸上皮不典型增生及宮頸上皮內(nèi)瘤變標本等)及102例子宮頸癌標本(含82例宮頸鱗癌、15例宮頸腺癌和5例宮頸腺鱗癌)。
[0012]免疫組化檢測的步驟:
1)組織切片脫蠟至水，置于0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中，100°C微波抗原修復(fù)處理20min，自然冷卻至室溫；
2)蒸餾水沖洗后，滴加3%H202孵育15min;然后用0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)沖洗3次,每次3min ；
3)滴加I: 150稀釋的Kinl7抗體(購自Santacruz)，37°C孵育60min后，用PBS沖洗3次,每次3min ；
4)接著滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的EnVision?二抗試劑(購自Dako公司)，37°C孵育30min后，用PBS沖洗3次，每次3min。最后用3，3’- 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色3min，Mayer蘇木素復(fù)染3min ；
5)梯度酒精脫水、透明、封固。
[0013]染色評分:分別就每張切片的染色強度(一，±，I +，2 +，3 +，4十)與陽性細胞的百分率(0-100)%進行打分。計算染色得分=染色強度(0，0.5，1，2，3，4)X (0-100)。
如，某張玻片的染色強度是2 +，陽性細胞的百分率是65%，那得分等于2X60=130。得分(100定義為低表達，得分> 100定義為高表達。全部切片由兩個病理科醫(yī)生在不知道組織診斷性質(zhì)的情況下獨立打分。
[0014]根據(jù)染色評分結(jié)果對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Kinl7在子宮頸正常組織及宮頸不典型增生組織中表達較低，而在子宮頸癌組織中表達明顯異常升高0° < 0.01，圖1)。Kinl7的表達隨著疾病的進程由宮頸上皮細胞從正?；虿坏湫驮錾l(fā)展到宮頸癌而升高。腫瘤細胞增殖越旺盛的組織部位，Kinl7的表達越強。因此，采用免疫組化、免疫熒光和實時定量PCR等方法對患者宮頸病變組織中的Kinl7表達水平進行檢測，有助于鑒別診斷子宮頸的良性病變與子宮頸癌。
[0015]Kinl7蛋白的制備
純化Kinl7蛋白是制備Kinl7抗體及相關(guān)的診斷試劑的重要材料。為了研發(fā)基于Kinl7表達的肺癌診斷試劑，采用如下方法制備Kinl7蛋白。
[0016]I)先用引物 Pl (5，-CGGGATCCATGGGGAAGTCGGATTTTCT-3’，SEQ ID NO:3)和 P2 (5，-CGTAAGCTTTCAGGCAAGTTTAGAAATGTCTTC-3’，SEQ ID NO:4)從細胞中 PCR 擴增基因開放閱讀框全長，經(jīng)用內(nèi)切酶漢3ΜΠ和歷id分別進行雙酶切反應(yīng)后，插入到pET32a-c (+)載體中，測序分析(圖2)證明成功構(gòu)建pET32a-KIN17重組質(zhì)粒；
2)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達菌BL21中，再用IPTG誘導(dǎo)表達攜帶His標簽的Kinl7蛋白，經(jīng)SDS — PAGE電泳分離及考馬斯亮藍染色后，發(fā)現(xiàn)目的蛋白的表達較好(圖3)；
3)接著利用N1-NTAHis-Bind柱進行親和層析來純化Kinl7蛋白。
[0017]純化終產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示，一個和His標簽Kinl7蛋白大小一致的蛋白條帶純度很高，達到95%以上(如圖4左);該主要條帶經(jīng)Western blot方法鑒定為Kinl7目的蛋白(圖4右)。
[0018]Kinl7基因或蛋白應(yīng)用于子宮頸癌患者的預(yù)后判斷的方案: 收集宮頸癌患者及腫瘤組織的病理參數(shù)的數(shù)據(jù)信息，統(tǒng)計分析病理組織中Kinl7表達與這些參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，患者腫瘤組織中Kinl7表達水平高低(評分> 100或者≤100)與患者P53突變情況Gd = 0.035，x 2檢驗)、Ki_67表達0° = 0.028，x 2檢驗)和對化療藥物敏感性Gd = 0.046，X2檢驗)等參數(shù)密切相關(guān)；通過患者的隨訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的子宮頸癌患者的組織中，Kinl7的表達比沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移的子宮頸癌患者要高0°= 0.042，X2檢驗)。因此，對Kinl7基因或蛋白的檢測有助于評估與預(yù)期子宮頸癌患者的病情進展狀況、抗癌治療效果及預(yù)后情況。
[0019]Kinl7基因或蛋白應(yīng)用于子宮頸癌的臨床治療的方案:
按照以下步驟進行RNA干擾試驗:子宮頸癌HeLa細胞經(jīng)血清饑餓2h后，用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染 Kinl7 特異性的 siRNA (siRNA_Kinl7)與相對應(yīng)的對照 siRNA(siRNA_NC)到細胞中；48h后，收集兩組細胞進行Western blot分析及細胞生長曲線比較，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA_Kinl7的HeLa細胞中Kinl7表達被明顯下調(diào)，而且其生長速度明顯減慢Gd< 0.05，圖5)。因此，沉默子宮頸癌細胞中Kinl7表達，抑制能夠腫瘤細胞的增殖活性。
[0020]轉(zhuǎn)染siRNA_Kinl7與siRNA_NC到HeLa細胞48h后，在兩組細胞中各加入子宮頸癌常用化療藥紫杉醇，然后比較兩組細胞的存活率變化；結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA_Kinl7的HeLa細胞存活率下降得比對照組要更快。當今，很多化療藥是利用抑制DNA復(fù)制與增加細胞內(nèi)DNA損傷的程度，來達到抑制腫瘤細胞生長的作用。因此，沉默子宮頸癌細胞中與DNA復(fù)制、修復(fù)相關(guān)的Kinl7表達，能增強其對化療藥紫杉醇的敏感性(圖6)。
[0021]因此，Kinl7可以作為子宮頸癌治療的靶點，采用特異性的si_RNA、sh_RNA、Kinl7特異性的抗體或者小分子藥物，沉默或者降低腫瘤組織中的Kinl7的表達，可用于子宮頸癌的臨床治療。
【權(quán)利要求】
1.用于檢測Kinl7基因的方法在制備子宮頸癌診斷或預(yù)后評估的試劑中的應(yīng)用。
2.檢測Kinl7蛋白表達水平的方法在制備子宮頸癌診斷或預(yù)后評估的試劑中的應(yīng)用。
3.抑制Kinl7蛋白表達的制劑在制備治療子宮頸癌或改善子宮頸癌患者病情的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:抑制Kinl7蛋白表達的制劑選自Kinl7基因啟動子抑制劑、轉(zhuǎn)錄抑制劑和Kinl7蛋白合成抑制劑。
5.使Kinl7蛋白特異性失活的制劑在制備治療子宮頸癌或改善子宮頸癌患者病情的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:使Kinl7蛋白特異性失活的制劑選自Kinl7蛋白抗體。
【文檔編號】A61K45/00GK104004830SQ201410188539
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月7日
【發(fā)明者】曾濤 申請人:曾濤