一種靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物，為聚苯胺-透明質(zhì)酸摻雜態(tài)水溶性復(fù)合物，以苯胺和透明質(zhì)酸為原料，采用下述的一步法制備而成：將苯胺及透明質(zhì)酸混合于水中并攪拌，0～5℃下滴加與苯胺等摩爾量的過硫酸銨水溶液。本發(fā)明利用化學(xué)氧化聚合法，在無酸條件下一步合成具有醌式結(jié)構(gòu)參雜態(tài)聚苯胺納米粒子，并用透明質(zhì)酸（帶負(fù)電的多糖）將帶有部分正電荷的摻雜態(tài)聚苯胺包裹，形成納米球，增加聚苯胺水溶性。本發(fā)明的復(fù)合物同時(shí)具有光熱治療與靶向的雙重作用，增強(qiáng)了對癌細(xì)胞的殺傷效率；制備方法簡便，一步合成既解決了聚苯胺的水溶性，又增加光熱治療的靶向性，在光熱治療方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及光熱治療劑，屬于生物醫(yī)用材料【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一種靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明涉及的制備方法以苯胺和透明質(zhì)酸為材料，采用一步化學(xué)氧化聚合法，所得產(chǎn)物用于靶向光熱治療。
【背景技術(shù)】
[0002]光熱療法是利用光熱材料吸收特定波長的光，通過非輻射衰減將吸收的能量轉(zhuǎn)化為熱導(dǎo)致局部環(huán)境溫度升高，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對病變部位的治療。而在治療過程中如果能夠賦予光熱材料靶向性，使得光熱材料能夠有針對性地進(jìn)入病變細(xì)胞，進(jìn)一步，通過吸收具有較好的組織穿透性及對人體傷害小的近紅外光對病變細(xì)胞進(jìn)行加熱，則可以不損傷正常組織，提高光熱療法的精確性及可控性。與傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療等技術(shù)相比，光熱治療具有過程簡便、無創(chuàng)或微創(chuàng)、并發(fā)癥少、恢復(fù)快、住院時(shí)間短等優(yōu)勢，因而能有效緩解患者病痛，提聞患者治療效果。
[0003]聚苯胺是一種具有特殊的電學(xué)、光學(xué)性質(zhì)的高分子材料，常被用作為研究細(xì)胞增殖的電活性材料(M.Y Li, Y Guo, Y Wei, A.G.MacDiarmid, P.1.Lelkes, J.Biomaterials.Sc1.Polym.Ed.2006，27，2705 - 2715)。聚苯胺的電活性源于分子鏈中的P電子共軛結(jié)構(gòu):隨分子鏈中P電子體系的擴(kuò)大，P成鍵態(tài)和P*反鍵態(tài)分別形成價(jià)帶和導(dǎo)帶，這種非定域的P電子共軛結(jié)構(gòu)經(jīng)摻雜可形成P型和N型導(dǎo)電態(tài)。經(jīng)摻雜后在聚苯胺的價(jià)帶和導(dǎo)帶之間產(chǎn)生一個(gè)能帶，從而迫使電子發(fā)生轉(zhuǎn)移，降低了激發(fā)態(tài)能級(jí)，所以當(dāng)聚苯胺上亞胺基團(tuán)轉(zhuǎn)變成亞胺鹽時(shí)，即形成具有醌式結(jié)構(gòu)摻雜態(tài)的聚苯胺時(shí)，其吸收峰將移到近紅外區(qū)域。因此，摻雜態(tài)的聚苯胺可以很好的應(yīng)用于光熱治療(Yang，J.; Choi, J.;Bang, D.; Ki m, E.; Lim, E.Κ.; Park, Η.; Suh, J.S.; Lee, K.; Yoo, K.H.; Ki m, E.K.;Huh, Y.M.; Haam，S.Angew.Chem., Int.Ed.2011，50，441 - 444)，該發(fā)現(xiàn)將對聚苯胺應(yīng)用于活體生物納米【技術(shù)領(lǐng)域】起到非常重要的作用。由于聚苯胺鏈剛性和鏈間強(qiáng)相互作用，導(dǎo)致其溶解性極差，在水溶液中幾乎不溶，極大地限制了聚苯胺在生物納米【技術(shù)領(lǐng)域】的應(yīng)用。因此，改善聚苯胺水溶性近年來受到廣泛的關(guān)注。而近年來發(fā)現(xiàn)通過結(jié)構(gòu)修飾(YanyinY, YongM, Jen-Chieh ff, et al.Rapid Commun.2011, 32, 887-892)、聚合(Dipankar C，BrojaMM..Langmuir.1996, 12(6): 1585-1588 ；Jaroslav S, Pavel K.Langmuir.1996,12, 3389-3392)及制備膠體顆粒(Mohamad A, Gad E H, Sawsan Z.Chemical EngineeringJournal.2013, 217，460-465)等方法可獲得水溶性的聚苯胺。
[0004] 透明質(zhì)酸，別名玻璃酸、糖醛酸、玻尿酸，其英文縮寫:HA，是一種酸性粘多糖。它是肌膚水嫩的重要基礎(chǔ)物質(zhì)，本身也是人體的一種成分，為具有較高臨床價(jià)值的生化藥物，廣泛應(yīng)用于各類眼科手術(shù)，如晶體植入、角膜移植和抗青光眼手術(shù)等。還可用于治療關(guān)節(jié)炎和加速傷口愈合。透明質(zhì)酸是由兩個(gè)雙糖單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的線狀的帶有負(fù)電荷的酸性多糖，內(nèi)側(cè)由于存在大量的羥基而產(chǎn)生強(qiáng)親水性，溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。具有良好的生物相容性、生物可降解性、水溶性、無毒性等，在細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要用。在大多腫瘤細(xì)胞表面有過度表達(dá)的透明質(zhì)酸受體CD44 (典型的有HCT-116，MCF-7，Hela細(xì)胞)，而通過與⑶44的作用，其可以有效的選擇性鍵合細(xì)胞(Culty M，NguyenHA, Underhill C B.J Cell Biol.1992，116 (4): 1055 - 1062)。因此，透明質(zhì)酸可以作為抗惡性腫瘤藥物的載體，實(shí)現(xiàn)祀向治療目的(Hyukjin L, Kyuri L, Tae G P.BioconjugateChem.2008， 19， 1319-1325)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明應(yīng)用化學(xué)氧化法合成聚苯胺-透明質(zhì)酸復(fù)合物納米粒子，利用納米粒子中聚苯胺的光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)和透明質(zhì)酸的良好水溶性及對癌細(xì)胞的靶向特性，增加了聚苯胺水溶性，研究其對特定癌變部位的光熱治療效果。
[0006]本發(fā)明基于上述【背景技術(shù)】，第一個(gè)目的就是提供一種靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物。
[0007]這種靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物，為聚苯胺-透明質(zhì)酸摻雜態(tài)水溶性復(fù)合物，以苯胺和透明質(zhì)酸為原料，采用下述的一步法制備而成:將苯胺及透明質(zhì)酸混合于水中并攪拌，(T5°C下滴加與苯胺等摩爾量的過硫酸銨水溶液。
[0008]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種一步法制備上述靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物的方法。
[0009]所述的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物的制備方法，包括:將1份苯胺及f 4倍苯胺質(zhì)量的透明質(zhì)酸混合于水中，攪拌20-40分鐘充分物理混合，在(T5°C繼續(xù)攪拌保持20-60分鐘；與苯胺等摩爾量的過硫酸銨溶于水中，滴加到上述混合液中，保溫反應(yīng)16~30小時(shí)；過濾并水洗后干燥。
[0010]上述的方法還可以包括將所得物研磨至細(xì)粉狀。這樣使得粒子更加微細(xì)，便于分散，以及提高收的率。
[0011]上述的方法還可以包括將所得物分散到去離子水中超聲處理，靜置后取上清液。這個(gè)過程是為了更好地除去大顆粒聚集物，超聲處理的作用是可以分開聚集的粒子，避免微細(xì)粒子被拋棄。所述超聲處理時(shí)間為30-180分鐘。
[0012]所述的制備方法中，所述透明質(zhì)酸的混合量為苯胺質(zhì)量的2~3倍為佳；
所述水為去離子水，這其中最為常用的就是蒸餾水；
為使反應(yīng)進(jìn)行的更加充分和徹底，以及易于控制，過硫酸銨水溶液需要慢慢滴加，一般來說所述過硫酸銨水溶液滴加速度為:f2ml/min ；
保溫反應(yīng)是需要控制溫度依然在(T5°C范圍，最好是使得保溫反應(yīng)于冰水浴中(也就是(TC)進(jìn)行，反應(yīng)24小時(shí)；
所述干燥為真空干燥，真空干燥溫度為4(T60°C，真空干燥時(shí)間為24~48小時(shí)。
[0013]為了確保產(chǎn)物質(zhì)量，盡量減少其中殘剩的反應(yīng)物，在過濾水洗時(shí)最好用蒸餾水洗三次。
[0014]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種一種藥物組合物。
[0015]該組合物包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體和上述所述的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物。
[0016]本發(fā)明還提供上述所述的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物和上述的所述藥物組合物在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
[0017]抗腫瘤藥物的劑型包括注射劑、口服劑、外用搽劑以及其它藥學(xué)上的適宜劑型。適宜采用光熱治療的劑型，都是可以的。
[0018]所述腫瘤包括典型的宮頸癌、乳腺癌及結(jié)腸癌。也包括其它的適宜采用光熱治療的實(shí)體瘤。
[0019]在本發(fā)明的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物的復(fù)合體系中，一方面，聚苯胺作為光熱治療劑參與疾病的治療；另一方面，透明質(zhì)酸既改善了聚苯胺的水溶性，其自身也具有靶向癌細(xì)胞的效果。該多功能治療復(fù)合體系，在紅外光照射下可有效地有針對性地殺死癌細(xì)胞。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
該復(fù)合物的制備方法簡便，在無酸條件下合成具有醌式結(jié)構(gòu)的聚苯胺-透明質(zhì)酸復(fù)合納米粒子納米粒子并改善了聚苯胺的水溶性；
利用聚苯胺的光熱治療及透明質(zhì)酸的癌細(xì)胞靶向性增強(qiáng)對癌細(xì)胞的殺傷率；
試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明所得 的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物可以在水體系中均勻分散并穩(wěn)定存在至少2個(gè)月以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]附圖為本發(fā)明的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物水溶液的溫度隨光照時(shí)間變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]制備實(shí)施例1
(1)0.652g苯胺溶于30 ml蒸餾水，按苯胺與透明質(zhì)酸質(zhì)量比為1:1加入透明質(zhì)酸，攪拌20分鐘充分物理混合，在冰水浴下繼續(xù)攪拌保持30分鐘。1.597g過硫酸銨溶于70 ml蒸餾水中，慢慢滴加到上述混合溶液中，滴加時(shí)間為I小時(shí)。再在冰水浴中反應(yīng)24小時(shí)，停止反應(yīng)。過濾并用蒸餾水洗三次。50 °C真空干燥一晝夜，取出研磨成細(xì)粉。
[0023](2)將上述樣品分散到蒸餾水中并用超聲儀超聲60分鐘。將所得溶液靜置，取上清液，以除去大顆粒聚集物。得到靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物水溶液。
[0024]制備實(shí)施例2
(1)0.652g苯胺溶于30 ml蒸懼水,按苯胺與透明質(zhì)酸質(zhì)量比為1: 1.25加入透明質(zhì)酸，攪拌20分鐘充分物理混合，在冰水浴下繼續(xù)攪拌保持30分鐘。1.597g過硫酸銨溶于70 ml蒸餾水中，慢慢滴加到上述混合溶液中，滴加時(shí)間為I小時(shí)。再在冰水浴中反應(yīng)24小時(shí)，停止反應(yīng)。過濾并用蒸餾水洗三次。50 °C真空干燥一晝夜，取出研磨成細(xì)粉。
[0025](2)將上述樣品分散到蒸餾水中并用超聲儀超聲120分鐘。將所得溶液靜置，取上清液，以除去大顆粒聚集物。得到靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物水溶液。
[0026]制備實(shí)施例3
(1)0.652g苯胺溶于30 ml蒸餾水，按苯胺與透明質(zhì)酸質(zhì)量比為1:4加入透明質(zhì)酸，攪拌20分鐘充分物理混合，在冰水浴下繼續(xù)攪拌保持30分鐘。1.597g過硫酸銨溶于70 ml蒸餾水中，慢慢滴加到上述混合溶液中，滴加時(shí)間為I小時(shí)。再在冰水浴中反應(yīng)30小時(shí)，停止反應(yīng)。過濾并用蒸餾水洗三次。50 °C真空干燥一晝夜，取出研磨成細(xì)粉。[0027](2)將上述樣品分散到蒸餾水中并用超聲儀超聲40分鐘。將所得溶液靜置，取上清液，以除去大顆粒聚集物。得到靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物水溶液。
[0028]測試實(shí)例I 實(shí)驗(yàn)方法如下:
將制備實(shí)施例2所得的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物水溶液配制75μ g/mL。取ImL該溶液，用808 nm激光(1W，光斑直徑5 mm)照射，用紅外熱像儀記錄溶液的溫度隨光照時(shí)間的變化。見附圖1。
[0029]由圖看出，隨著光照時(shí)間的增加，靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物水溶液的溫度也顯著升高，并在10分鐘內(nèi)升高了 25 °C，而純水在相同光照條件下僅升高0.2 °C。證實(shí)本發(fā)明的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物水溶液具有良好的光熱效果。
[0030]應(yīng)用實(shí)施例1
利用制備實(shí)施例2的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物作為光熱治療試劑，其體外細(xì)胞測試方法如下:
分別配置一系列濃度分別為140、150、160、170 μ g/mL的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物水溶液。將人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116細(xì)胞)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)及人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7細(xì)胞)在96孔板(每孔IO4個(gè)細(xì)胞)中培養(yǎng)。一晝夜后，加入所配制的系列濃度的溶液，再培養(yǎng)24小時(shí)。分別用808 nm激光(1W，光斑直徑5 mm)照射10 min。再培養(yǎng)24小時(shí)，用噻唑藍(lán)比色法測細(xì)胞抑制率(抑制率(%) = (1-試驗(yàn)孔OD值/對照孔OD值)X 100% )。 [0031]在808 nm激光(1W,光斑直徑5 mm)照射條件下,板中顯示對細(xì)胞的殺死率可達(dá)65%~80% ;而無光照的顯示細(xì)胞存活率均大于80%。實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物結(jié)合光熱治療對人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116細(xì)胞)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)及人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7細(xì)胞)具有良好的殺死率。
[0032]應(yīng)用實(shí)施例2
利用制備實(shí)施例2的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物作為光熱治療試劑，其體外細(xì)胞靶向測試方法如下:
分別配置一系列濃度分別為140、150、160、170 μ g/mL的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物水溶液。將HCT-116細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞及人包皮成纖維細(xì)胞(HFF細(xì)胞)在96孔板(每孔104個(gè)細(xì)胞)中培養(yǎng)。一晝夜后，加入所配制的系列濃度的溶液，再培養(yǎng)24小時(shí)。分別用808 nm激光(1W，光斑直徑5 mm)照射10 min,再培養(yǎng)24小時(shí)。分別用噻唑藍(lán)比色法測細(xì)胞抑制率。(抑制率(%) = (1-試驗(yàn)孔OD值/對照孔OD值)X 100% )。
[0033]將HCT-116細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞及人包皮成纖維細(xì)胞(HFF細(xì)胞)在24孔板(每孔104個(gè)細(xì)胞)中培養(yǎng)。一晝夜后，加入濃度為170 μ g/mL的溶液，再培養(yǎng)24小時(shí)。分別用808 nm激光(1W，光斑直徑5 mm)照射10 min,再培養(yǎng)24小時(shí)。用PI染色，進(jìn)行共聚焦成像。
[0034]在808 nm激光(Iff,光斑直徑5 mm)照射條件下，MTT實(shí)驗(yàn)顯示對三種癌細(xì)胞細(xì)胞的殺死率可達(dá)60%~85% ;而正常細(xì)胞存活率均大于80%。共聚焦成像證明了癌細(xì)胞較正常細(xì)胞介導(dǎo)本發(fā)明的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物進(jìn)入的多，細(xì)胞凋亡成像明顯。實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物結(jié)合光熱治療對人結(jié)腸癌、人宮頸癌和人乳腺癌等細(xì)胞表面有過度表達(dá)透明質(zhì)酸受體CD44的癌細(xì)胞相對正常成纖維細(xì)胞具有良好的靶向性。[0035]應(yīng)用實(shí)施例3
制備實(shí)施例2制備的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物作為光熱治療試劑劑，其體內(nèi)裸鼠測試方法如下:
把人乳腺癌細(xì)胞皮下移植到裸鼠體內(nèi)，培養(yǎng)6~7天。靜脈注射本發(fā)明的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物溶液到裸鼠體內(nèi)，隨后每天用808 nm激光(lW/cm2)照射腫瘤部位10分鐘，持續(xù)照射10天。
[0036]激光照射明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長，并且腫瘤體積在以肉眼可見的速度減小。持續(xù)照射10天后，腫瘤消失。證實(shí)本發(fā)明的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物可有效殺傷體內(nèi)人乳腺癌細(xì) 胞。
【權(quán)利要求】
1.一種靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物，其特征在于:為聚苯胺-透明質(zhì)酸摻雜態(tài)水溶性復(fù)合物，以苯胺和透明質(zhì)酸為原料，采用下述的一步法制備而成:將苯胺及透明質(zhì)酸混合于水中并攪拌，(T5°c下滴加與苯胺等摩爾量的過硫酸銨水溶液。
2.權(quán)利要求1所述的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物的制備方法，其特征在于:包括:將1份苯胺及1~4倍苯胺質(zhì)量的透明質(zhì)酸混合于水中，攪拌20-40分鐘充分物理混合，在(T5°C繼續(xù)攪拌保持20飛0分鐘；與苯胺等摩爾量的過硫酸銨溶于水中，滴加到上述混合液中，保溫反應(yīng)16~30小時(shí)；過濾并水洗后干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:還包括將所得物研磨至細(xì)粉狀。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于:還包括將所得物分散到去離子水中超聲處理，靜置后取上清液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述透明質(zhì)酸的混合量為苯胺質(zhì)量的2~3倍； 所述水為去離子水； 所述過硫酸銨水溶液滴加速度為:f2ml/min ； 所述保溫反應(yīng)于冰水浴中進(jìn)行，反應(yīng)24小時(shí)； 所述干燥為真空干燥，真空干燥溫度為4(T60°C，真空干燥時(shí)間為24~48小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:所述超聲處理時(shí)間為30-180分鐘。
7.—種藥物組合物，包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體和權(quán)利要求1所述的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物。
8.權(quán)利要求1所述的靶向光熱治療用水溶性復(fù)合物和權(quán)利要求7的所述藥物組合物在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的的應(yīng)用，其特征在于:抗腫瘤藥物的劑型包括注射劑、口服劑、外用搽劑以及其它藥學(xué)上的適宜劑型。
10.如權(quán)利要求8所述的的應(yīng)用，其特征在于:所述腫瘤包括:宮頸癌、乳腺癌及結(jié)腸癌。
【文檔編號(hào)】A61K47/36GK104013960SQ201410208088
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月17日
【發(fā)明者】蔣邦平, 沈星燦, 張麗 申請人:廣西師范大學(xué)