G-1在制備基于g蛋白偶聯(lián)受體30的三陰性乳腺癌靶向藥物方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了G-1在制備基于G蛋白偶聯(lián)受體30的三陰性乳腺癌靶向藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明研究表明GPR30的活化可通過G2/M周期阻滯及線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡靶向抑制TNBC的增殖，其中p53、ERK1/2及其上調(diào)p21介導(dǎo)了這一過程。移植瘤模型表明G-1可有效抑制TNBC在體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明提供了GPR30活化可體內(nèi)外顯著抑制TNBC腫瘤細(xì)胞的增殖并闡明其發(fā)生作用的分子機(jī)制，突破了以往認(rèn)為TNBC無靶可治的傳統(tǒng)觀念，并利用G-1作為活化手段，為TNBC的臨床治療提供了新的具有重要潛力的臨床治療方式及治療策略，實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)外靶向抑制三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，為三陰性乳腺癌開辟性地提供了一種全新的靶向治療策略及方法，具備良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】G-1在制備基于G蛋白偶聯(lián)受體30的三陰性乳腺癌靶向藥 物方面的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及本發(fā)明涉及G-1在制備基于G蛋白偶聯(lián)受體 30的三陰性乳腺癌靶向藥物方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有140萬婦女患乳腺癌。據(jù) 2013年最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，美國2012年共新增23萬例女性乳腺癌患者，占女性新生惡性腫 瘤的29%，排名第一。其死亡率占女性腫瘤死亡率的34%，列各惡性腫瘤第一位。我國乳 腺癌的發(fā)病率已躍居女性惡性腫瘤首位，死亡率高達(dá)40%以上，成為危害我國婦女健康的 重大原因。隨著對乳腺癌分子分型的深入研究，2006年Bryan等首先提出了三陰性乳腺癌 (triple-negative breast cancer, TNBC)這一概念，其指的是雌激素受體（ER)、孕激素受 體（PR)和人表皮生長因子受體2 (HER2)均為陰性的一類乳腺癌，約占全部乳腺癌的15? 20%，在我國約有25%的乳腺癌為TNBC患者。
[0003] TNBC的概念一經(jīng)提出，就引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。相對于其它類型的乳腺癌， TNBC具有高度侵襲性的生物學(xué)行為，大部分患者術(shù)后1?3年易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，并且在復(fù)發(fā)后快 速進(jìn)展，從而導(dǎo)致大多數(shù)病人在5年內(nèi)死亡。研究表明轉(zhuǎn)移性TNBC患者如果僅接受化療， 其中位無進(jìn)展生存期（PFS)〈4個(gè)月。多項(xiàng)臨床研究結(jié)果表明，與其它類型乳腺癌相比，TNBC 有最差的總生存率和無病生存期。究其治療失敗的原因，主要在于TNBC缺乏雌孕激素受體 的表達(dá)，沒有HER2的過表達(dá)，導(dǎo)致無法實(shí)行內(nèi)分泌治療及靶向治療，從而缺乏特別有效的 系統(tǒng)治療手段。由于腫瘤自身的生物學(xué)特點(diǎn)，許多患者都因迅速出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致死亡。 目前針對TNBC的系統(tǒng)治療手段僅為依靠化療，即使是化療有效，患者的緩解期也比較短， 短期內(nèi)腫瘤容易再次進(jìn)展。
[0004] 表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR)是目前極少數(shù) 的治療TNBC靶點(diǎn)之一，雖然目前圍繞著EGFR進(jìn)行了大量的工作，試圖通過EGFR找到治療 TNBC的最佳辦法，但最終結(jié)果均不理想。以上結(jié)果說明，我們需要尋找出針對TNBC更為有 效且安全的治療方法。因此，針對TNBC的發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制，開發(fā)其針對性的藥物治療靶 點(diǎn)，已經(jīng)成為當(dāng)前乳腺癌領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。
[0005] G蛋白偶聯(lián)受體30 (GPR30,又名G蛋白偶聯(lián)雌激素受體，GPER)是七次跨膜的G蛋 白偶聯(lián)受體，可介導(dǎo)雌激素的快速反應(yīng)。其活化后可刺激腺苷酸環(huán)化酶，反式激活表皮生長 因子受體，誘導(dǎo)動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca 2+)和活化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷酸肌醇 3-激酶（PI3K)信號傳導(dǎo)途徑，從而介導(dǎo)雌激素的快速非基因組效應(yīng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是目的在于針對三陰性乳腺癌的靶向治療技術(shù)不足，提 供G-1在制備基于G蛋白偶聯(lián)受體30的三陰性乳腺癌靶向藥物方面的應(yīng)用，基于本發(fā)明， 可以實(shí)現(xiàn)全新的三陰性乳腺癌靶向治療方案，即以G蛋白偶聯(lián)受體30 (又名G蛋白偶聯(lián)雌 激素受體，GPER)為治療靶點(diǎn)，通過其特異性活化從而實(shí)現(xiàn)靶向治療三陰性乳腺癌。
[0007] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)： 提供G-1在制備基于G蛋白偶聯(lián)受體30的三陰性乳腺癌靶向藥物方面的應(yīng)用。
[0008] 具體是采用G-1作為藥物或者藥物的重要成分，靶向激活GPR30受體的策略為利 用GPR30受體特異性激動(dòng)劑如G-1活化GPR30,從而靶向抑制三陰性乳腺癌體內(nèi)外增殖。 本發(fā)明的技術(shù)原理在于在三陰性乳腺癌細(xì)胞中，利用G-1特異性活化GPR30受體后， 可通過時(shí)間依賴性下調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclinB從而造成G2/M細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)活性氧 (R0S)的升高和線粒體膜電位（Λ Ψ?)的降低從而使得細(xì)胞發(fā)生凋亡，其介導(dǎo)的分子機(jī)制是 GPR30活化后可通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾上調(diào)ρ53，并通過GPR30/EGFR持續(xù)性激活ERK1/2，并 上調(diào)Ρ21，從而抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖。
[0009] 基于本發(fā)明，可實(shí)現(xiàn)一種靶向治療三陰性乳腺癌的方法，以G蛋白偶聯(lián)受體30 (G Protein-Coupled Rec印tor 30, GPR30)為靶點(diǎn)，利用其特異性激動(dòng)劑G-1靶向活化GPR30 受體，通過細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增 殖并體內(nèi)靶向治療三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。
[0010] 所述的三陰性乳腺癌靶向藥物策略，即以G蛋白偶聯(lián)受體30 (又名G蛋白偶聯(lián)雌 激素受體，GPER)為靶點(diǎn)，通過其特異性活化從而靶向治療三陰性乳腺癌。即利用GPR30受 體的特異性激動(dòng)劑如G-1，激活GPR30受體后，從而靶向抑制三陰性乳腺癌體內(nèi)外增殖。
[0011] 進(jìn)一步地，過表達(dá)GPR30或利用基于G-ι改造的GPR30受體特異性激動(dòng)劑，激活 GPR30受體從而靶向抑制三陰性乳腺癌體內(nèi)外增殖的策略。
[0012] G-ι應(yīng)用于制備抑制三陰性乳腺癌腫瘤的體內(nèi)生長的藥物方面。
[0013] G-1是作為所述G蛋白偶聯(lián)受體30的特異性激動(dòng)劑，通過細(xì)胞周期阻滯和/或誘 導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，應(yīng)用于抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖。
[0014] G-1是作為所述G蛋白偶聯(lián)受體30的特異性激動(dòng)劑活化G蛋白偶聯(lián)受體30后通 過誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯從而抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖。
[0015] G-1通過上調(diào)p53的表達(dá)，抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖。
[0016] G-1通過GPR30/EGFR持續(xù)活化ERK1/2并促使其入核介導(dǎo)細(xì)胞增殖抑制作用。
[0017] G-1通過EGFR/ERK1/2和p53上調(diào)p21的表達(dá)及其相互串話抑制三陰性乳腺癌細(xì) 胞增殖。
[0018] 所述誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是通過下調(diào)線粒體膜電位進(jìn)行。
[0019] 所述的藥物含有G-1，可以還含有藥學(xué)上可接受的輔料。
[0020] 所述含G-1的藥物，其劑型可以為口服型片劑、丸劑、膠囊、注射用注射液、粉劑或 經(jīng)皮或皮下吸收的劑型等。
[0021] 本發(fā)明的有益效果是： 三陰性乳腺癌（TNBC)指的是雌激素受體（ER)、孕激素受體（PR)和人表皮生長因子受 體2 (HER2)均為陰性的一類乳腺癌，約占全部乳腺癌的15?20%。由于無法實(shí)行靶向治 療，TNBC與其它類型乳腺癌相比生存率和無病生存期最差。因此，開發(fā)出針對TNBC的藥物 治療靶點(diǎn)，已經(jīng)成為當(dāng)前乳腺癌領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。本發(fā)明人經(jīng)長期大量深入的研 究，總結(jié)出GPR30在三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，是靶向治療三陰性乳腺癌 的重要靶標(biāo)分子，總結(jié)出G蛋白偶聯(lián)受體30為三陰性乳腺癌可靠的治療靶點(diǎn)，為三陰性乳 腺癌的靶向治療及后續(xù)藥物的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。并基于所述研究成果，針對目前三 陰性乳腺癌極差的臨床預(yù)后及無靶可治的臨床局面，提供了一種有效的靶向激活GPR30受 體從而抑制三陰性乳腺癌體內(nèi)外增殖的有效方法，提供G-1在制備治療基于GPR30的三陰 性乳腺癌藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明研究表明GPR30的活化可通過G2/M周期阻滯及線粒體介 導(dǎo)的細(xì)胞凋亡靶向抑制TNBC的增殖，其中p53、ERK1/2及其上調(diào)p21介導(dǎo)了這一過程。移 植瘤模型表明G-1可有效抑制TNBC在體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明提供了 GPR30活化可體內(nèi) 外顯著抑制TNBC腫瘤細(xì)胞的增殖并闡明其發(fā)生作用的分子機(jī)制，突破了以往認(rèn)為TNBC無 靶可治的傳統(tǒng)觀念，并利用G-1作為治療手段，為TNBC的臨床治療提供了新的具有重要潛 力的臨床治療方式及治療策略。實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)外靶向抑制三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，為三陰 性乳腺癌開辟性地提供了一種全新的靶向治療策略及方法，具備良好的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1 G-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023] 圖 2 SkBr3 和 MDA-MB-231 細(xì)胞利用 ΚΓ8 ?1(Γ5 M G-1 處理 48h，然后利用 CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞增殖。
[0024] 圖 3 SkBr3 和 MDA-MB-231 細(xì)胞利用 1 μ M G-1 處理 24, 36 和 48h，然后 利用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖。
[0025] 圖 4 利用空白 siRNA(si-NC)及 si-GPR30 轉(zhuǎn)染 SkBr3 和 MDA-MB-231 細(xì)胞 24h 后 利用Western-blotting技術(shù)檢測GPR30蛋白的表達(dá)情況。
[0026] 圖 5 利用空白 siRNA (si-NC)及 si-GPR30 轉(zhuǎn)染 SkBr3 和 MDA-MB-231 細(xì)胞 24h 后，再加入ΙμΜ G-1處理24h，然后利用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖。*p〈 0·05;**ρ〈 0. 01ο
[0027] 圖6利用雙重胸腺嘧啶（TdR)阻滯法，將SkBr3細(xì)胞阻滯在G1/S期，加入ΙμΜ G_ 1處理如圖不時(shí)間，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。
[0028] 圖7將SkBr3細(xì)胞周期同步化后，加入1 μ M G-1處理24、48和72h， 利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。
[0029] 圖8利用ΙμΜ G-1處理SkBr3細(xì)胞24h后，細(xì)胞周期蛋白利用熒光定量PCR進(jìn)行 測定。
[0030] 圖9 SkBr3和MDA-MB-231細(xì)胞1 μ M G-1處理72h后，細(xì)胞周期蛋白的蛋白表達(dá) 水平利用Western-blotting進(jìn)行檢測。
[0031] 圖10利用1 μ M G-1處理SkBr3和MDA-MB-231不同時(shí)間后，cyclinB的表達(dá)水 平利用 Western-blotting 進(jìn)行檢測；*p〈 0.05。
[0032] 圖11 SkBr3和MDA-MB-231利用不同濃度G-1處理48h后，利用流式細(xì)胞儀檢測 細(xì)胞凋亡。
[0033] 圖12利用不同濃度G-1處理SkBr3細(xì)胞24h后，細(xì)胞的線粒體膜電位通過加 入JC-1染料進(jìn)行分析。
[0034] 圖13不同濃度G-1處理SkBr3細(xì)胞48h后，線粒體介導(dǎo)凋亡的相關(guān)蛋白如 Bcl_2、Bax、Bim 和 caspase3 等利用 Western-blotting 進(jìn)行檢測。
[0035] 圖14利用1 μ Μ G-1處理SkBr3和MDA-MB-231 24h后利用熒光定量PCR進(jìn)行檢 測p53的mRNA表達(dá)水平。
[0036] 圖15利用1 μ M G-1處理SkBr3和MDA-MB-231 24h后利用熒光定量PCR進(jìn)行檢 測MDM2的mRNA表達(dá)水平。
[0037] 圖16利用Western-blotting進(jìn)行檢測p53的蛋白表達(dá)水平。
[0038] 圖17利用si-NC和si-p53轉(zhuǎn)染SkBr3細(xì)胞24h后，mRNA和蛋白表達(dá)水平，表 明p53成功被干擾。
[0039] 圖18成功干擾p53后，用G-1 (1 μ M)處理細(xì)胞24h，利用CCK-8檢測細(xì)胞增殖。 [0040] 圖19利用不同濃度G-1處理SkBr3細(xì)胞24h后，分別提取細(xì)胞漿和細(xì)胞核的蛋 白，檢測P53在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中的蛋白表達(dá)變化。
[0041] 圖20利用1 μ M G-1處理SkBr3細(xì)胞24h后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察p53的 細(xì)胞定位(紅色）的變化。
[0042] 圖21利用1 μ M G-1處理SkBr3細(xì)胞不同時(shí)間后，利用免疫共沉淀檢測p53的泛 素化水平。
[0043] 圖22利用ΙμΜ G-1處理SkBr3細(xì)胞不同時(shí)間后，利用Western-blotting檢測 p-Ser-p53 和 p53 的表達(dá)變化。*p〈 0.05;林p〈 0.01。
[0044] 圖23 SkBr3細(xì)胞利用ΙμΜ G-1處理不同時(shí)間后，ERK1/2、JNK、和p-38的蛋白表 達(dá)及磷酸化水平的Western-blotting檢測結(jié)果。
[0045] 圖24 MDA-MB-231細(xì)胞利用1 μ M G-1處理不同時(shí)間后，ERK1/2、JNK、和p-38的 蛋白表達(dá)及磷酸化水平的Western-blotting檢測結(jié)果。
[0046] 圖25利用ΙμΜ G-1處理SkBr3細(xì)胞24h后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察 P-ERK1/2的細(xì)胞定位(綠色)。
[0047] 圖26將SkBr3細(xì)胞分別加入10 μ Μ MEK抑制劑PD98059 (PD)，PI3K抑制齊[J LY294002 (LY)，ρ38 ΜΑΡΚ 抑制劑 SB203580 (SB)，或 EGFR 抑制劑 AG1478 (AG)處理 24h 后，再利用luM G-1處理48h，利用Western-blotting檢測蛋白表達(dá)。*p〈 0.05。
[0048] 圖27將SkBr3細(xì)胞分別加入10 μ Μ MEK抑制劑PD98059 (PD)，PI3K抑制齊[J LY294002 (LY)，p38 ΜΑΡΚ 抑制劑 SB203580 (SB)，或 EGFR 抑制劑 AG1478 (AG)處理 24h 后，再利用ΙμΜ G-1處理48h,利用cck-8細(xì)胞增殖。#p〈 0. 01。
[0049] 圖 28 利用 si_NC 或 si_p21 轉(zhuǎn)染 SkBr3 細(xì)胞 24h 后，Western-blotting表明 p21 的表達(dá)被成功抑制。
[0050] 圖29成功抑制p21后，加入1 μ M G-1處理細(xì)胞24h后，利用CCK-8檢測細(xì)胞增 殖。
[0051] 圖30將SkBr3細(xì)胞分別加入10 μ Μ MEK抑制劑PD98059 (PD)，PI3K抑制齊[J LY294002 (LY)，ρ38 ΜΑΡΚ 抑制劑 SB203580 (SB)，或 EGFR 抑制劑 AG1478 (AG)處理 24h 后，再利用luM G-1處理24h，利用Western-blotting檢測p21的蛋白表達(dá)。*p〈 0.05。
[0052] 圖31將SkBr3細(xì)胞分別加入10 μ Μ MEK抑制劑PD98059 (PD)，PI3K抑制齊[J LY294002 (LY)，ρ38 ΜΑΡΚ 抑制劑 SB203580 (SB)，或 EGFR 抑制劑 AG1478 (AG)處理 24h 后，再利用luM G_1處理24h，利用Western-blotting檢測p-Ser -p53、p53的蛋白表達(dá)。 〈 0· 050
[0053] 圖32利用2X 106個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞在左側(cè)第四對乳腺脂肪墊處構(gòu)建裸鼠 TNBC 移植瘤模型，然后靜脈注射G-1 (0. 4mg/kg)，每隔三天注射一次，繪制腫瘤體積變化曲線。
[0054] 圖33實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出裸鼠腫瘤發(fā)現(xiàn)G-1組小鼠腫瘤體積明顯小于對照組，結(jié)果 顯不。
[0055] 圖34利用Western-blotting檢測兩組小鼠瘤體內(nèi)GPR30誘導(dǎo)增殖抑制的相關(guān)蛋 白的表達(dá)水平。*Ρ〈 〇·〇5;#ρ〈 0.01。
[0056] 圖35 GPR30受體活化后靶向抑制TNBC細(xì)胞體內(nèi)外增殖的分子機(jī)制。

【具體實(shí)施方式】
[0057] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明實(shí)施例采 用的生物材料、試劑為本領(lǐng)域常規(guī)使用的生物材料、試劑；除非特別說明，本發(fā)明實(shí)施例采 用的方法為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)方法。
[0058] 實(shí)施例1 GPR30活化后能劑量/時(shí)間依賴性抑制TNBC細(xì)胞的體外增殖 利用GPR30特異性激動(dòng)劑G-l(化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)，探討其對TNBC細(xì)胞體外增殖的影響。
[0059] 實(shí)驗(yàn)材料和方法 1. 1主要試劑及儀器 TNBC 乳腺癌細(xì)胞株 Skfc3 (ER a -，ER β -)和 MDA-MB-231 (ER α -，ER β +)由本 實(shí)驗(yàn)室保種或采用其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)室以及細(xì)胞庫來源的TNBC乳腺癌細(xì)胞株SkBr3和 MDA-MB-231，不因乳腺癌細(xì)胞株來源限定本發(fā)明。胎牛血清購自Gbico公司，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試 齊[J、siRNA空白對照、及si-GPR30購自銳博生物科技有限公司，G-1以及其余試劑為Sigma 公司（分析純或以上)。Cell Counting Kit-8試劑盒購自同仁化學(xué)公司熒光顯微鏡購自 Olympus公司，熒光定量PCR儀LightCycler 480II購自Roche公司，激光共聚焦顯微鏡 LSM710購自Zeiss公司。
[0060] 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 將凍存于液氮罐中TNBC乳腺癌細(xì)胞株SkBr3 (ERa-，ERP-)和MDA-MB-231 (ERa-， ERi3+)取出，于37°C水浴鍋中快速融化。超凈工作臺中，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至10 mL離心管中， 加入5 mL 1640培養(yǎng)基，低速離心1000 rpmX5 min，棄上清，加入含10% FBS的1640培養(yǎng) 基內(nèi)，于5% C02、37 °C條件下培養(yǎng)。
[0061] 細(xì)胞處理及增殖測定 將貼壁的SkBr3和MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行消化重懸，鋪板至96孔板，每孔加入100 μ 1 細(xì)胞懸液（5000 cells/well)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h，將10 μ?不同濃度的G-1 加入培養(yǎng)板中，養(yǎng)箱孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，將10 μ 1 CCK-8溶液加入到每孔中，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 2小時(shí)，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度，分析G-1活化GPR30后對細(xì)胞增殖的影響。
[0062] 干擾實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染前將SkBr3和MDA-MB-231細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度能夠達(dá)到50? 60%的匯合度時(shí)，采用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。主要步驟為：用100 μ?不含血清 Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋2. 5 μ? 10 mM的siRNA(加入的siRNA終濃度為100 ηΜ)，輕輕混勻， 室溫孵育5 min，用100 μ?不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋2 μ? Lipo 2000,將兩者輕輕混 勻，室溫孵育20 min后加入含有細(xì)胞以及培養(yǎng)液的培養(yǎng)板各孔中。將細(xì)胞置于37 °C的C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4?6 h后，移去含siRNA-1 ip〇2000混合液的培養(yǎng)基，更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基 繼續(xù)培養(yǎng)。干擾si-GPR30的細(xì)胞24 h后，進(jìn)行G-1處理，利用CCK-8 Kit檢測細(xì)胞增殖。
[0063] 分析 收集處理后的細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入三去污細(xì)胞裂解液，冰上放置15?20 min。收 集細(xì)胞裂解液于EP管，最大轉(zhuǎn)速離心20 min，收集上清。Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。以 每孔20 μ g蛋白上樣量，電壓80?120 V進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。恒流200 mA、90 min 的條件下電轉(zhuǎn)印至甲醇預(yù)處理的PVDF膜上。5%脫脂奶粉（PBST配制)封閉PVDF膜2 h。檢 測抗體以1: 1000比例與封閉液稀釋，4°C孵育PVDF膜過夜。PBST洗滌PVDF膜10 minX3 次，加入HPR標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠 IgG二抗（1:5000,封閉液稀釋)，室溫孵育1 h。PBST 洗滌PVDF膜10 min X 3次。加入ECL發(fā)光液用X光片曝光。
[0064] 結(jié)果 本實(shí)施例兩種TNBC乳腺癌細(xì)胞株，SkBr3 (ERa-，ERP-)和MDA-MB-231 (ERa-， ER3 +)，利用G-1激活GPR30受體后對細(xì)胞增殖的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用G-1處理細(xì)胞48小時(shí) 后，細(xì)胞的增殖受到抑制并呈現(xiàn)出濃度依賴性（圖2 )。G-1對SkBr3和MDA-MB-231細(xì)胞的 IC50 分別是 4. 05 μ Μ 和 7. 84 μ M。利用 1 μ Μ 的 G-1 作用 SkBr3 和 MDA-MB-231 24、36、48h 后，發(fā)現(xiàn)G-1對兩種TNBC細(xì)胞成顯著抑制效應(yīng)，且隨時(shí)間的延長抑制效果顯著增加（圖3)。 為確認(rèn)GPR30受體介導(dǎo)了 G-1對TNBC細(xì)胞體外增殖的抑制作用，利用si-GPR30特異性抑 制GPR30在SkBr3和MDA-MB-231的表達(dá)后（圖4)，發(fā)現(xiàn)其能顯著逆轉(zhuǎn)G-1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖 抑制作用（圖5)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用G-1活化GPR30受體后能顯著抑制TNBC細(xì)胞的 體外增殖。
[0065] 實(shí)施例2 GPR30活化后誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞G2/M周期阻滯及線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 利用GPR30特異性激動(dòng)劑G-1 (化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)，探討其對TNBC細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡 的影響。
[0066] 實(shí)驗(yàn)材料和方法 1. 1 PI單染檢測細(xì)胞周期與凋亡 將 TNBC 細(xì)胞 SkBr3 或 MDA-MB-231 鋪板至 6 孔板（5X105 cells/well)，培養(yǎng) 24 h 后 加入不同濃度的G-1處理。胰酶消化、收集細(xì)胞，3000 rpm/min離心3 min,棄去培養(yǎng)液。 PBS洗滌1次，3000 rpm/min離心3 min，棄去PBS。加入冰預(yù)冷的70%的乙醇，4°C固定2 小時(shí)，離心棄去固定液。PBS洗漆1次，3000 rpm/min離心3 min，棄去PBS。加入150 μ 1 RNaseA (250-500 μ g/ml PBS 稀釋）重懸細(xì)胞，37°C消化 30 分鐘。3000 rpm/min 離心 3 min，棄去PBS。加入0.5 mL PI染色液（100 yg/ml)，4°C避光染色30 min。400目的篩網(wǎng) 過濾，轉(zhuǎn)至流式檢測管。流式細(xì)胞儀檢測：PI用488nm氬離子激光器激發(fā)，由630帶通濾 光片接收，通過FS/SS散點(diǎn)圖收集10000個(gè)細(xì)胞，采用設(shè)門技術(shù)排除粘連細(xì)胞和在碎片，分 析PI熒光直方圖上細(xì)胞各周期（G0/G1、S、G2/M)的百分率和凋亡細(xì)胞（sub-Gl)百分率。 [0067] 探針檢測細(xì)胞膜電位) 將TNBC細(xì)胞SkBr3或MDA-MB-231鋪板至6孔板培養(yǎng)24h后加入不同濃度G-1進(jìn)行處 理，用PBS洗滌細(xì)胞1次，每孔加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C孵育20 min。在孵育期間，按照每1 ml JC-1染色緩沖液（5X)加入4 ml蒸餾水的比例，配制適量 的JC-1染色緩沖液（1 X )，并放置于冰浴。37°C孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液 (1X )洗滌2次。每孔加入2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察。
[0068] 細(xì)胞總RNA提取與Real-time PCR檢測細(xì)胞周期蛋白 采用E.Z.N.A. HP Total RNA Kit根據(jù)說明書提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。并對提取的RNA采 用PrimeScript RT reagent Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，37°C逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min得到cDNA，然后采用 TaKaRa SYBRPremix Ex Taq?試劑盒進(jìn)行Real Time PCR分析。起始溫度設(shè)為65°C ;溫度 變化設(shè)為〇.5°C，結(jié)束溫度設(shè)為95°C。Real Time PCR反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)Real time PCR的 擴(kuò)增曲線和融解曲線，采用Λ Λ Ct法對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中Λ Ct=目的基因 Ct值-內(nèi) 參基因 Ct值，Λ ACt=實(shí)驗(yàn)組ACt-對照組ACt，基因相對表達(dá)量=2_ΔΔα。
[0069] 其余實(shí)驗(yàn)方法見實(shí)施例1。
[0070] 結(jié)果 2. 1 GPR30活化導(dǎo)致TNBC細(xì)胞G2/M期阻滯 我們用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法同步化處理細(xì)胞以便于細(xì)胞都處于G1期，再用G-1處 理SkBr3 12小時(shí)后進(jìn)行流式分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G-1處理組G2/M期顯著升高，在同步化后的 第一個(gè)周期中，細(xì)胞在9小時(shí)后都同時(shí)進(jìn)入了 G2/M期但G-1延緩了它往G2/M期的進(jìn)程（圖 6)，且這種由G-1處理后引起的G2/M期阻滯可待續(xù)至72小時(shí)（圖7)，以上證據(jù)表明GPR30 受體活化后可通過誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯從而抑制TNBC細(xì)胞增殖。
[0071] 細(xì)胞周期蛋白是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵蛋白分子。我們利用qRT-PCR及 Western-blotting檢測相關(guān)周期蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果表明G-1能顯著下調(diào)cyclin B的 mRNA，而對其它周期蛋白無影響（圖8)，這一結(jié)果在蛋白水平得到了驗(yàn)證（圖9)，且G-1處理 前細(xì)胞用血清饑餓cyclin B的下調(diào)更明顯。進(jìn)一步研究表明，G-1能呈時(shí)間依賴性下調(diào) cyclinB在SkBr3和MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)（圖10)。cyclinB被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞G2/ Μ期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵周期蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明G-1可以通過下調(diào)cyclinB而且導(dǎo)致TNBC細(xì)胞的 G2/M期阻滯。
[0072] 激活GPR30可以誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞發(fā)生線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 利用1?5 μ M G-1處理SkBr3和MDA-MB-231細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)G-1 處理組的細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性增加（圖11)。蛋白檢測結(jié)果表明G-1可以劑量依賴性地上 調(diào)Bax、Bims、和caspase3成熟體的表達(dá)，并抑制Bcl-2的表達(dá)（圖13)。以上結(jié)果表明G-1 可誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)從而抑制細(xì)胞增殖。
[0073] 我們進(jìn)一步探討G-1對TNBC細(xì)胞株的線粒體膜電位影響。如圖12所示，G-1能使 細(xì)胞紅色熒光向綠色熒光（FITC)的轉(zhuǎn)變呈劑量依賴性增加。JC-1在線粒體膜電位較高時(shí)， 聚集在線粒體的基質(zhì)中所形成聚合物能產(chǎn)生紅色熒光；JC-1在線粒體膜電位較低時(shí)，不能 聚集在線粒體的基質(zhì)中而單體形式存在，產(chǎn)生綠色熒光。線粒體膜電位的變化通過熒光顏 色的轉(zhuǎn)變來檢測。從而表明G-1誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可通過下調(diào)線粒體膜 電位進(jìn)行。
[0074] 實(shí)施例3 p53、ERK1/2及其串話介導(dǎo)了 GPR30對TNBC細(xì)胞的增殖抑制作用 為進(jìn)一步闡明GPR30活化后抑制TNBC細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，本實(shí)施例研究探討p53、 ERK1/2及其串話在其中的作用。
[0075] 實(shí)驗(yàn)材料和方法 1. 1細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白的提取 采用細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒分別提取細(xì)胞核蛋白和胞質(zhì)蛋白。收集處理后 的細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次。加入200 μ 1遇冷的Buffer A (使用前每ml Buffer A加入1 μ? DTT，10yl PMSF，lyl蛋白酶抑制劑)，劇烈震蕩15 s，冰上放置15 min。加入11 μ? Buffer Β，劇烈震蕩15 s，冰上放置15 min。4 °C 12000 g離心5 min，此時(shí)溶液分為3層： 最下層為透明層，中間為白色細(xì)胞核沉淀，最上層為胞質(zhì)蛋白裂解液。收集上層胞質(zhì)蛋白裂 解液，吸出下層液體并丟棄，剩余白色細(xì)胞核沉淀。在細(xì)胞核沉淀中加入1〇〇μ1 Buffer C (使用前每ml Buffer A加入1 μ? DTT，10yl PMSF，lyl蛋白酶抑制劑)，劇烈震蕩15 s， 冰浴40 min，期間劇烈震蕩30 s多次。4 °C 12000 g離心5 min，收集上清即為細(xì)胞核裂 解液。
[0076] 激光共聚焦檢測p53和p-ERKl/2的核轉(zhuǎn)位 SkBr3細(xì)胞在多聚賴氨酸預(yù)處理過的蓋玻片上培養(yǎng)，血清饑餓處理12 h ;G-1處理細(xì)胞 24h后，PBS洗滌細(xì)胞3次；4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min;山羊血清于37 °C封閉細(xì)胞30 min ;加入抗p53或p-ERKl/2抗體（1 :200稀釋）4°C孵育過夜；PBS清洗細(xì)胞3次；加入 FITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗（1: 1000稀釋）于37 °C孵育lh; PBS洗滌細(xì)胞3次；加入10 μ g/ml的DAPI孵育10 min染細(xì)胞核；激光共聚焦顯微鏡檢測分析F0X03a的核轉(zhuǎn)位情況。
[0077] 免疫共沉淀檢測p53的泛素化 細(xì)胞按1 X 1〇6個(gè)/皿接種在10 mm2的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h后，加相應(yīng)濃度的化 合物繼續(xù)培養(yǎng)12h。棄舊的細(xì)胞培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌1次，然后加入500 μ L IP 細(xì)胞裂解液在冰上裂解細(xì)胞20 min。9, 000 g，20 min，4 ° C離心收集細(xì)胞碎片，得上清 的蛋白樣品。經(jīng)BCA法測定蛋白濃度后，取約1 mg的上清蛋白樣品，加入lyg跟一抗同 源的普通 IgG 和 20yL 混勻的 Protein A+G Agarose，4 ° C 慢搖 lh。1,000 g，5 min， 4 ° C離心收集上清的蛋白樣品，再加入lyg相應(yīng)的一抗，4 ° C慢搖過夜。接著加入 20μ? 混勻的 Protein A+G Agarose，4 ° C 慢搖 3h，l，000 g，5 min,棄上清。用 IP 細(xì) 胞裂解液洗滌Protein A+G Agarose 5次，1，000 g，5 min，棄上清。最后加入20 μ L SDS 上樣裂解緩沖液重新Protein A+GAgarose，100 ° C煮沸5 min,冷卻離心后，上清液用于 Western blot 分析。
[0078] 其余實(shí)驗(yàn)方法見實(shí)施例1及2。
[0079] 結(jié)果 2. 1 p53參與介導(dǎo)GPR30活化后對TNBC的增殖抑制作用 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，1 μ M G-1能時(shí)間依賴性上升p53的mRNA (圖14)及蛋白（圖16)在 SkBr3細(xì)胞中的表達(dá)，并降低p53的活性抑制劑MDM2的mRNA表達(dá)（圖15)。為驗(yàn)證p53在 G-1抑制細(xì)胞增殖中重要作用，我們利用si-p53特異性敲除p53在SkBr3細(xì)胞中的表達(dá)（圖 17)，發(fā)現(xiàn)p53的抑制能顯著逆轉(zhuǎn)G-1對SkBr3細(xì)胞的增殖抑制作用（圖18)。以上結(jié)果表明 G-1能上調(diào)p53的表達(dá)從而發(fā)揮TNBC細(xì)胞增殖抑制作用。
[0080] 研究表明p53的翻譯后修飾及細(xì)胞定位對其腫瘤抑制功能發(fā)揮了重要作用。我們 利用0. 5 μ Μ和1 μ Μ G-ι刺激SkBr3 24小時(shí)分別提取細(xì)胞的核蛋白與漿蛋白，WB檢測結(jié) 果表明G-1顯著上調(diào)了 p53的細(xì)胞核表達(dá)（圖19)，且這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣被免疫熒光所證實(shí) (圖20)。細(xì)胞內(nèi)p53穩(wěn)定性主要通過泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解過程調(diào)節(jié)的，我們檢測結(jié)果 發(fā)現(xiàn)G-1刺激后可以降低它的泛素化水平（圖21)。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)p53蛋白15位絲氨酸位點(diǎn)的 磷酸化在P53的入核中起著重要的作用，我們的檢測結(jié)果表明G-1能顯著促進(jìn)SkBr3細(xì)胞 中P53蛋白15絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化，并隨著時(shí)間的推移p53蛋白的表達(dá)量增加（圖22)。以 上結(jié)果表明G-1抑制TNBC的增殖是通過上調(diào)p53的轉(zhuǎn)錄及翻譯，促使其15絲氨酸磷酸化 后入核并抑制其泛素化，從而發(fā)揮作用。
[0081] 的持續(xù)活化參與了 GPR30活化后對TNBC細(xì)胞的增殖抑制作用 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)在SkBr (圖23)和MDA-MB-231 (圖24)中，G-1刺激可以快速活化 ERK1/2并持續(xù)超過48h，而對ERK1/2蛋白表達(dá)沒有影響，同樣JNK和p38等另外兩個(gè)重要 的MAPK信號分子不受G-1的刺激發(fā)生變化。免疫熒光發(fā)現(xiàn)，G-1刺激后能使得p-ERKl/2入 核顯著增加（圖25)。以上結(jié)果表明G-1可誘導(dǎo)ERK1/2的持續(xù)磷酸化并促進(jìn)其入核。
[0082] 為探討G-1誘導(dǎo)ERK1/2持續(xù)磷酸化的分子機(jī)制及其作用，我們分別用MEK抑制劑 PD98059(PD), PI3K 抑制劑 LY294002(LY), p38-MAPK 抑制劑 SB203580(SB),和 EGFR 抑 制劑AG1478(AG)處理SkBr3細(xì)胞24h后加入G-1。結(jié)果表明AG1478和PD98059可以減弱 G-1引起的cyclin B的上調(diào)和ERK1/2的磷酸化（圖26)，并顯著逆轉(zhuǎn)G-1對SkBr3細(xì)胞的 增殖抑制作用（圖27)。以上結(jié)果證實(shí)G-1可通過GPR30/EGFR持續(xù)活化ERK1/2并促使其入 核從而介導(dǎo)細(xì)胞增殖抑制作用。
[0083] 上調(diào)參與了 GPR30活化后對TNBC細(xì)胞的增殖抑制作用 圖16表明G-1在上調(diào)p53表達(dá)的同時(shí)可顯著上調(diào)p21。為探討p21是否參與了 G-1 的細(xì)胞增殖抑制作用，我們利用si-p21特異性敲除SkBr3細(xì)胞中的p21 (圖28)，發(fā)現(xiàn)p21 的敲除能顯著逆轉(zhuǎn)G-1對SkBr3細(xì)胞的增殖抑制作用（圖29)。研究表明ERK1/2的活化可 通過轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾上調(diào)P21的表達(dá)，為探討非p53依賴型信號在G-1上調(diào)p21中的作 用，我們分別用MEK抑制劑Η)98059 (Η))，PI3K抑制劑LY294002 (LY)，p38-MAPK抑制劑 SB203580 (SB)，和EGFR抑制劑AG1478 (AG)處理SkBr3細(xì)胞24h后加入G-1，發(fā)現(xiàn)AG和 PD，而非LY和SB，能顯著地減弱G-1上調(diào)p21的作用（圖30)，從而表明GPR30/EGFR/ERK1/2 介導(dǎo)了 G-1對p21的上調(diào)作用。同時(shí)，AG和能顯著逆轉(zhuǎn)G-1誘導(dǎo)的p53第15位絲氨酸 的磷酸化水平（圖31)，而對p53蛋白水平?jīng)]有顯著變化。以上結(jié)果表明G-1可通過EGFR/ ERK1/2和p53上調(diào)p21的表達(dá)，并且它們相互串話參與G-1對TNBC細(xì)胞的增殖抑制作用。
[0084] 實(shí)施例4激活GPR30受體可以抑制TNBC細(xì)胞的體內(nèi)生長 為探討GPR30活化對TNBC體內(nèi)生長的影響，我們通過構(gòu)建TNBC移植瘤模型，繪制腫瘤 體積曲線，探討G-1對腫瘤體內(nèi)生長的影響及分子機(jī)制。
[0085] 實(shí)驗(yàn)材料和方法 1. 1裸鼠 TNBC移植瘤模型的構(gòu)建 裸鼠20只，隨機(jī)分為2組。溶劑對照組10只，G-1處理組10只。每只裸鼠利用2 X 106個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞在左側(cè)第四對乳腺脂肪墊處構(gòu)建裸鼠 TNBC移植瘤模型。接種15天 后可以觸摸到芝麻粒大小腫瘤長出，將移植瘤組裸鼠隨機(jī)分為2組，其中G-1處理組靜脈注 射G-1 (0. 4mg/kg),每隔三天注射一次，給藥時(shí)間為15天。
[0086] 裸鼠體內(nèi)生長評價(jià) 給藥前用游標(biāo)卡尺測定腫瘤的長徑a和短徑b，按v=l/2ab2計(jì)算腫瘤體積，隔天測量一 次，繪制腫瘤體積變化曲線。于給藥后第22天采用頸椎脫白法處死裸鼠，解剖裸鼠，剝離移 植瘤并稱量重量。并利用Western-blotting檢測腫瘤內(nèi)蛋白的變化。
[0087] 結(jié)果 兩組小鼠腫瘤生長曲線見圖32。10天后，對照組細(xì)胞長出可測量大小的腫瘤，且體積 隨著時(shí)間的增加而增大。而G-1處理組細(xì)胞在18天后才長出可測量大小的腫瘤，且生長緩 慢。24天后，所有的裸鼠被處死因?yàn)閷φ战M的腫瘤已經(jīng)大到影響裸鼠的生存。在這整個(gè)觀 察過程中，G-1組形成的腫瘤大小明顯比對照組?。▓D32和圖33)。結(jié)果表明G-1可顯著 抑制TNBC在體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展。WB結(jié)果表明，G-1能顯著地增加 p53、p21、ERK1/2、cyclinB 在瘤內(nèi)的表達(dá)（圖34)，從而可以按圖35所示機(jī)制體內(nèi)抑制TNBC的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明研 究表明GPR30的活化可通過G2/M周期阻滯及線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡靶向抑制TNBC的增 殖，其中p53、ERKl/2及其上調(diào)p21介導(dǎo)了這一過程（圖35)。移植瘤模型表明G-1可有效 抑制TNBC在體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展。
【權(quán)利要求】
1. G-1在制備基于G蛋白偶聯(lián)受體30的三陰性乳腺癌靶向藥物方面的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，G-1應(yīng)用于制備抑制三陰性乳腺癌腫瘤的 體內(nèi)生長的藥物方面。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，G-1是作為所述G蛋白偶聯(lián)受體30 的特異性激動(dòng)劑，通過細(xì)胞周期阻滯和/或誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，應(yīng)用于抑制三陰 性乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，G-1是作為所述G蛋白偶聯(lián)受體30 的特異性激動(dòng)劑活化G蛋白偶聯(lián)受體30后通過誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯從而抑制三陰性乳腺 癌細(xì)胞增殖。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，G-1通過上調(diào)p53的表達(dá)，抑制三陰 性乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，G-1通過GPR30/EGFR持續(xù)活化ERK1/2 并促使其入核介導(dǎo)細(xì)胞增殖抑制作用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，G-1通過EGFR/ERK1/2和p53上調(diào) P21的表達(dá)及其相互串話抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是通 過下調(diào)線粒體膜電位進(jìn)行。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞為SkBr3和/或MDA-MB-231。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物還含有藥學(xué)上可接受的輔 料。
【文檔編號】A61P35/00GK104083368SQ201410209369
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月19日
【發(fā)明者】王紅勝, 韋微, 杜軍, 陳卓佳 申請人:中山大學(xué)