一種動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法，涉及動物疫苗【技術(shù)領(lǐng)域】，所述制備過程為采用基因工程方法、自然傳代方法或化學(xué)合成方法，致使抗原物質(zhì)減少了一段或多段基因，進(jìn)而產(chǎn)生新的特征性，再將所述具有新特性的抗原物質(zhì)制備成可鑒別滅活疫苗。本發(fā)明的有益效果：動物免疫接種這樣的疫苗后，通過檢測特征可鑒別抗體，鑒別該抗體是由處理前的抗原(即野毒)產(chǎn)生還是處理后抗原(疫苗毒)產(chǎn)生，可以區(qū)分疫苗和野毒產(chǎn)生的抗體，診斷動物是否感染過野毒株，從而淘汰和清除帶毒動物，實(shí)現(xiàn)疾病凈化，有利于養(yǎng)殖場疾病的凈化。
【專利說明】一種動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動物疫苗【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)在動物疾病越來越多，疫苗已經(jīng)成為預(yù)防和控制疾病的主要工具，減毒活疫苗在預(yù)防傳染性疾病發(fā)生和控制傳染病爆發(fā)起到了十分重要的作用。但是，運(yùn)用減毒活疫苗生產(chǎn)用菌毒種的安全問題，是動物長期在使用減毒活疫苗可能出現(xiàn)疫苗毒株殘留，基因重組、基因變異、毒力返強(qiáng)等現(xiàn)象，造成疾病再次流行，不利于傳染性疾病的凈化和清除。
[0003]動物疫苗對預(yù)防動物疾病的發(fā)生起到至關(guān)重要的作用，國內(nèi)外許多傳染性疾病均通過免疫接種疫苗進(jìn)行預(yù)防和控制，但是要進(jìn)行疾病凈化和清除則需要可鑒別疫苗，尤其是可鑒別的滅活疫苗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可有效淘汰和清除帶毒動物、實(shí)現(xiàn)疾病凈化的動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法。
[0005]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)其目的采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法，所述制備過程為采用基因工程方法、自然傳代方法或化學(xué)合成方法，致使抗原物質(zhì)減少了一段或多段基因，進(jìn)而產(chǎn)生新的特征性，再將所述具有新特性的抗原物質(zhì)制備成可鑒別滅活疫苗。
[0007]作為優(yōu)選的技術(shù)方案:所述抗原物質(zhì)為細(xì)菌、病毒、寄生蟲、支原體或衣原體。
[0008]作為優(yōu)選的技術(shù)方案:所述病毒為偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、口蹄疫病毒、藍(lán)耳病毒、流行性腹瀉病毒、禽流感病毒、減蛋綜合征病毒、鴨瘟病毒或鴨肝炎病毒。
[0009]作為優(yōu)選的技術(shù)方案:所述抗原物質(zhì)可以是具有免疫原性的蛋白質(zhì)或合成肽。
[0010]作為優(yōu)選的技術(shù)方案:所述基因工程方法為將抗原物質(zhì)的一段或者多段基因敲除或?qū)?，通過表達(dá)后產(chǎn)生新的特征性，并保持抗原良好培養(yǎng)特性和免疫原性不變。
[0011] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案:所述自然方法為通過細(xì)胞、胚胎、動物體內(nèi)連續(xù)傳代培養(yǎng)致使抗原物質(zhì)缺失一段或多段基因，表達(dá)后產(chǎn)生新的特征性，并保持抗原良好培養(yǎng)性和免疫原性不變。
[0012]作為優(yōu)選的技術(shù)方案:所述可鑒別滅活疫苗可通過乳化工藝生產(chǎn)成乳劑滅活苗，或者通過冷凍干燥制成凍干滅活苗。
[0013]作為優(yōu)選的技術(shù)方案:所述乳劑滅活疫苗為含油佐劑滅活疫苗。
[0014]作為優(yōu)選的技術(shù)方案:所述含油佐劑滅活疫苗包括水包油型、油包水型、水包油包水型，其中油包括礦物油或植物油。
[0015]作為優(yōu)選的技術(shù)方案:所述乳劑滅活疫苗為親水劑型滅活疫苗，所述親水劑型滅活疫苗采用溶劑包括氫氧化鋁膠、磷酸鋁膠、蜂膠、高分子聚合物、樹脂。
[0016]傳染性疾病防控的最后階段是疾病的凈化和清除，這個階段則需要運(yùn)用滅活疫苗，尤其是帶有特征可鑒別的滅活疫苗，此類疫苗接種動物后不僅可以產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的保護(hù)力，而且通過檢測可鑒別抗體，可以鑒別診斷動物是否感染過野毒，從而可以清除和淘汰帶毒動物，達(dá)到動物群體疾病凈化的目的。滅活疫苗所需要的菌/毒種雖是毒力強(qiáng)的菌/毒種，由于在制備疫苗過程將菌毒種徹底滅活，因此，在使用過程中不會出現(xiàn)基因重組、基因變異、毒力返強(qiáng)等現(xiàn)象。在不影響病毒培養(yǎng)特性、免疫原性、免疫效力的情況下，通過基因工程方法和自然傳代方法使疫苗生產(chǎn)用菌毒種或蛋白質(zhì)、合成肽等帶有特征性可鑒別，再生產(chǎn)成可鑒別滅活疫苗，可產(chǎn)生可鑒別物對應(yīng)的抗體。動物免疫接種這樣的疫苗后，檢測可鑒別抗體，可以區(qū)分疫苗和野毒產(chǎn)生的抗體，診斷出感染過野毒的動物，從而淘汰和清除帶毒動物，有利于養(yǎng)殖場疾病的凈化。
[0017]疫苗生產(chǎn)用菌(毒)株培養(yǎng)方法和常規(guī)方法相同，只是通過篩選優(yōu)化出最佳的可鑒別后疫苗菌(毒)株的培養(yǎng)條件，然后根據(jù)疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)把培養(yǎng)的原液稀釋成所需的抗原含量，進(jìn)行滅活，篩選合適的免疫佐劑，按照最優(yōu)比例配制成滅活疫苗。當(dāng)然安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)要合乎要求。
[0018]本發(fā)明具有的有益效果:
[0019]動物免疫接種這樣的疫苗后，通過檢測特征可鑒別抗體，鑒別該抗體是由處理前的抗原(即野毒)產(chǎn)生還是處理后抗原(疫苗毒)產(chǎn)生，可以區(qū)分疫苗和野毒產(chǎn)生的抗體，診斷動物是否感染過野毒株，從而淘汰和清除帶毒動物，實(shí)現(xiàn)疾病凈化，有利于養(yǎng)殖場疾病的凈化。

【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅僅局限于實(shí)施例。
[0021]實(shí)施例1
[0022]豬偽狂犬病毒可鑒別滅活疫苗的制備:
[0023]豬偽狂犬新流行毒株的分離:從豬場發(fā)病死亡的仔豬無菌操作采集腦和肺、腎等組織，混合后在滅菌的研缽內(nèi)剪碎，按此方法處理了 3頭仔豬的病料，用DMEM作1:5倍稀釋成懸液，_70°C反復(fù)凍融3次。經(jīng)3000r/min離心30分鐘，取上清液經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾后，加入適量青、鏈霉素，接種于已長成單層的BHK-21細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，置于37°C恒溫箱吸附I小時，然后加入DMEM維持液培養(yǎng)72小時收毒。純化、鑒定為偽狂犬病毒。
[0024]gE 的敲除:轉(zhuǎn)化前 2 小時于 LB平板上涂x-gal(40y g/ml)和 IPTG (20 μ g/ml) 37°C溫箱中倒置平皿，使X-gal和IPTG充分吸入瓊脂中；從_70°C冰箱中取出2管感受態(tài)細(xì)胞，融化后，立即把管轉(zhuǎn)移到冰浴中，放置10分鐘后，于冰浴中將管中加入待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒(體積〈10 μ 1，<50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，干冰上放置30分鐘，而后迅速轉(zhuǎn)入42°C水浴中熱沖擊90秒，再迅速轉(zhuǎn)入冰浴中冷卻2分鐘，加入400 μ 137°C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床緩慢搖動(250轉(zhuǎn)/分)溫育45分鐘，分別涂布含有Amp (50ug/ml)的LB平板上，37°C溫箱中過夜培養(yǎng)。將重組質(zhì)粒PBsA轉(zhuǎn)化DH5，挑取單個菌落，用LB液體培養(yǎng)基增殖，提取質(zhì)粒，BamHI酶切，回收大小約為6.6kb的片段。將此PRV6.6kbDNA片段連接到pUC18BamHI位點(diǎn)中，獲得重組質(zhì)粒pUc6.6，同時繼續(xù)用Kpnl酶切此PRV6.6kb DNA片段，回收PRV4.1kb片段，作為疫苗毒株。
[0025]將該可鑒別疫苗毒株接種PK15、BHK、VER0、ST等細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、24~48小時收獲病毒培養(yǎng)液，然后在培養(yǎng)液中添加0.1%~0.5%的滅活劑,搖勻，置2~8°C 48小時。檢驗(yàn)完全滅活病毒液后，將病毒也與適宜佐劑或凍干保護(hù)劑混勻，分裝進(jìn)行乳化或凍干，制備成半成品，然后分裝，檢驗(yàn)合格后為成品，置2~8 °C保存。
[0026]實(shí)施例2
[0027]豬瘟可鑒別滅活疫苗的制備:
[0028]目前預(yù)防豬瘟的疫苗是C株活疫苗，免疫效果良好，但是不能和野毒株區(qū)分。在C株的基礎(chǔ)上，E2基因人工敲除，使其缺失了 54個氨基酸，即B/C區(qū)693~746。敲除后不影響該毒株的培養(yǎng)和免疫原性和效力，能夠抵御豬瘟強(qiáng)毒的攻擊。
[0029]將該可鑒別豬瘟疫苗毒株接種ST細(xì)胞、犢牛睪丸細(xì)胞等進(jìn)行培養(yǎng)、36~48小時收獲病毒培養(yǎng)液，然后在培養(yǎng)液中添加0.1 %~0.5%的滅活劑，搖勻，置2~8°C 48小時。檢驗(yàn)完全滅活病毒液后，把滅活后的病毒液和凍干保護(hù)劑按照體積比1:1混合，分裝到安玻瓶中(2ml)，按照合適的凍干曲線，凍干成粉狀，制備成半成品，按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做無菌檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后為成品，置2~8°C保存。
[0030]實(shí)施例3
[0031]鏈球菌可鑒別滅活疫苗的制備:
[0032]擴(kuò)增了 srtA基因的上、下游同源臂Pl和P2及其全長序列，利用溫度敏感型“自殺性”質(zhì)粒pSET4s構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSET4s-Pl-P2，并將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入野生菌株SS2 (SC21)中，通過抗生素和溫度雙重篩選，得到srtA基因缺失菌株，缺失突變菌株能夠穩(wěn)定遺傳，不影響培養(yǎng)特性，仍保有很好的免疫原性。
[0033]疫苗的培養(yǎng)、滅活、配苗，和常規(guī)疫苗制作方法相同。
[0034] 本發(fā)明的疫苗經(jīng)以下檢驗(yàn):無菌檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)都合格方可使用。
[0035]最后應(yīng)說明的是:以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明而并非限制本發(fā)明所描述的技術(shù)方案；因此，盡管本說明書參照上述的各個實(shí)施例對本發(fā)明已進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，仍然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或等同替換；而一切不脫離本發(fā)明的精神和范圍的技術(shù)方案及其改進(jìn)，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
【權(quán)利要求】
1.一種動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述制備過程為采用基因工程方法、自然傳代方法或化學(xué)合成方法，致使抗原物質(zhì)減少了一段或多段基因，進(jìn)而產(chǎn)生新的特征性，再將所述具有新特性的抗原物質(zhì)制備成可鑒別滅活疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述抗原物質(zhì)為細(xì)菌、病毒、寄生蟲、支原體、衣原體、具有免疫原性的蛋白質(zhì)或合成肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述病毒為偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、口蹄疫病毒、藍(lán)耳病毒、流行性腹瀉病毒、禽流感病毒、減蛋綜合征病毒、鴨瘟病毒或鴨肝炎病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述基因工程方法為將抗原物質(zhì)的一段或者多段基因敲除或?qū)?，通過表達(dá)后產(chǎn)生新的特征性，并保持抗原良好培養(yǎng)特性和免疫原性不變。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述自然方法為通過細(xì)胞、胚胎、動物體內(nèi)連續(xù)傳代培養(yǎng)致使抗原物質(zhì)缺失一段或多段基因，表達(dá)后產(chǎn)生新的特征性，并保持抗原良好培養(yǎng)性和免疫原性不變。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述可鑒別滅活疫苗可通過乳化工藝生產(chǎn)成乳劑滅活苗，或者通過冷凍干燥制成凍干滅活苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述乳劑滅活疫苗為含油佐劑滅活疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述含油佐劑滅活疫苗包括水包油型、油包水型、水包油包水型,其中油包括礦物油或植物油。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的動物用可鑒別滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述乳劑滅活 疫苗為親水劑型滅活疫苗，所述親水劑型滅活疫苗采用溶劑包括氫氧化鋁膠、磷酸鋁膠、蜂膠、高分子聚合物、樹脂。
【文檔編號】A61K39/39GK104069487SQ201410225569
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】賴 志, 高俊鋒, 馬晶晶, 吳碧清 申請人:上海創(chuàng)宏生物科技有限公司