神經(jīng)生長因子緩釋納米載體的制備及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種神經(jīng)生長因子緩釋納米載體的制備方法，將神經(jīng)生長因子和聚乳酸-羥基乙酸共聚物通過乳化揮發(fā)溶劑法制成球形納米粒子。所述的聚乳酸-羥基乙酸共聚物包裹的神經(jīng)生長因子納米緩釋系統(tǒng)是核殼結(jié)構(gòu)，其核是神經(jīng)生長因子，外殼是均勻、致密的聚乳酸-羥基乙酸共聚物，本發(fā)明解決了現(xiàn)有的神經(jīng)生長因子在體內(nèi)分布半衰期和生物活性半衰期較短、代謝快、易被酶解，在水溶液中極不穩(wěn)定的問題。本發(fā)明方法操作簡單、過程可控。本發(fā)明對(duì)神經(jīng)生長因子的應(yīng)用范圍進(jìn)行了二次開發(fā)，拓展了其藥用范圍，可利用神經(jīng)生長因子納米緩釋系統(tǒng)的神經(jīng)保護(hù)作用，將其應(yīng)用于制備糖尿病合并冠心病的藥物。
【專利說明】神經(jīng)生長因子緩釋納米載體的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物制備，具體涉及聚乳酸-羥基乙酸共聚物包裹的神經(jīng)生長因子緩釋系統(tǒng)(納米載體)及其制備方法，以及在制備糖尿病合并冠心病藥物中的應(yīng)用，適合于制備改善糖尿病心臟自主神經(jīng)和感覺神經(jīng)功能的藥物的場(chǎng)合。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)生長因子(NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)，目前研究最為透徹的，具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，它對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。神經(jīng)損傷后，NGF受體增加，反映在損傷修復(fù)過程中對(duì)NGF的需求。靶區(qū)NGF的水平也明顯升高。目前應(yīng)用于臨床的是注射用鼠神經(jīng)生長因子，用于促進(jìn)神經(jīng)損傷的恢復(fù)，例如:視神經(jīng)炎、脊髓損傷、坐骨神經(jīng)痛、腦萎縮、新生兒缺血缺氧性腦病、糖尿病末梢神經(jīng)炎等。目前臨床采用肌肉注射，一日一次，療效確切。但由于其在體內(nèi)消除半衰期較短，約為2.5小時(shí)，體內(nèi)平均滯留時(shí)間為3.5小時(shí)，故造成血藥濃度不穩(wěn)定，不能較長時(shí)間維持有效血藥濃度，治療效果不確切，其主要 副作用為注射部位局部疼痛，偶見蕁麻疹。
[0003]聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)由兩種單體一乳酸(LA)和羥基乙酸(GA)隨機(jī)聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域。在美國PLGA通過FDA認(rèn)證，被正式作為藥用輔料收錄進(jìn)美國藥典。不同的單體比例可以制備出不同類型的PLGA。所有的PLGA都是非定型的，其玻璃化溫度在40-60 ° C之間。純的乳酸或羥基乙酸聚合物比較難溶，與之不同的是，PLGA展現(xiàn)了更為廣泛的溶解性，它能夠溶解于更多更普遍的溶劑當(dāng)中，如:氯化溶劑類，四氫呋喃，丙酮或乙酸乙酯等。破壞酯鍵會(huì)導(dǎo)致PLGA的降解，降解程度隨單體比不同而有差異，乙交酯比例越大越易降解。也存在特例，當(dāng)兩種單體比為50:50時(shí)，降解的速度會(huì)更快，差不多需要兩個(gè)月。PLGA的降解產(chǎn)物是乳酸和羥基乙酸，同時(shí)也是人代謝途徑的副產(chǎn)物，所以當(dāng)它應(yīng)用在醫(yī)藥和生物材料中時(shí)不會(huì)有毒副作用。通過調(diào)整單體比，進(jìn)而改變PLGA的降解時(shí)間，因此可以根據(jù)藥物的性質(zhì)和用途調(diào)整乳酸和羥基乙酸之間的比例，制備具有特定功效的納米制劑，所制得的納米粒子粒徑從100納米到300納米不等，可用于肌肉注射和靜脈注射。
[0004]心血管病作為危害人類健康的“第一殺手”，已波及全球，而冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)是心血管疾病中發(fā)病率、死亡率非常高的疾病。研究顯示，冠心病患者60%~80%存在血糖升高。循證醫(yī)學(xué)證明，糖尿病患者80%死于冠心病，糖尿病是冠心病的高危癥。早期預(yù)防和治療糖尿病合并冠心病具有重大的意義。由于糖尿病性神經(jīng)病變，患者的神經(jīng)末梢受損時(shí)，痛閾升高，導(dǎo)致即使發(fā)生了嚴(yán)重的心肌缺血，疼痛也較輕微而不典型，甚至沒有心絞痛癥狀，引起無痛性心肌梗死，這類患者因?yàn)闆]有明顯的胸痛癥狀而易被誤診或延誤病情而導(dǎo)致病情加重、死亡率增加?，F(xiàn)有治療方法多從降血糖、降血脂的角度出發(fā)，但治療效果并不樂觀。國外有文獻(xiàn)，將NGF-腺病毒轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，對(duì)其缺血損傷有明顯的保護(hù)作用。基于上述理論基礎(chǔ)，有待于將其應(yīng)用于糖尿病合并冠心病的治療中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種神經(jīng)生長因子緩釋納米載體的制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn):
Cl)制備內(nèi)水相、油相和外水相:內(nèi)水相(Wl)為NGF加入體積百分?jǐn)?shù)5%聚乙二醇(PEG);油相(O)為PLGA溶于二氯甲烷與丙酮體積比為3:1的混合溶液，PLGA濃度為1.25%(1.25g/100ml);外水相(W2)為體積百分?jǐn)?shù)為0.7%的聚乙烯醇(PVA)水溶液；
(2)制備包裹NGF的PLGA微球:將所述內(nèi)水相(Wl)加入油相(O)中，100W(瓦特)冰水中超聲Imin制備油包水型乳液(W1/0)，將(Wl/Ο)乳液加入含0.7% PVA的水溶液中，(Wl/O)乳液與外水相(W2)體積比為1:5 ;55W冰水中超聲20min，得到水包油包水型復(fù)乳(W1/0/W2)，將均勻的復(fù)乳倒入離心管中，51攝氏度真空旋蒸25min，以揮發(fā)溶劑；
(3)離心、沖洗、干燥、冷 藏包裹NGF的PLGA微球:將步驟(2)乳液收集后，20000rpm，4° C離心20min，用蒸餾水沖洗沉淀3次洗凈納米粒表面的PVA以及游離的蛋白，然后收集納米粒，-20°C冷凍干燥24h，冰凍干燥后，將凍干的包裹NGF的PLGA納米微球儲(chǔ)存于2_8°C冰箱中。
[0006]包裹的神經(jīng)生長因子(NGF)為鼠源性神經(jīng)生長因子(mNGF)和人工合成(rhNGF)。
[0007]包裹NGF的PLGA微球呈光滑的球形，其平均粒徑為250_330nm，微球的載藥量為
7.76ug/mg-8ug/mg，包封率為50%_80%。根據(jù)不同LA/GA和LA、GA分子量不同，分別得到具有不同釋放特性的緩釋微球。
[0008]其中PLGA選用乳酸:羥基乙酸(LA:GA) =50:50 (摩爾比)。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供神經(jīng)生長因子緩釋納米載體在制備治療糖尿病合并冠心病藥物中的應(yīng)用。為觀察神經(jīng)生長因子對(duì)糖尿病合并冠心病的治療作用，本發(fā)明對(duì)糖尿病小鼠予以PLGA-NGF尾靜脈注射，并采用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，對(duì)糖尿病小鼠的離體心臟進(jìn)行缺血再灌注處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLGA-NGF有改善糖尿病心肌缺血后心功能的作用，并且該作用與改善糖尿病心臟的感覺神經(jīng)功能有關(guān)，即改善糖尿病合并冠心病患者自主神經(jīng)和感覺神經(jīng)功能。所述藥物由神經(jīng)生長因子緩釋納米載體中有效成分神經(jīng)生長因子的單一組分，與藥用賦形劑制備，制劑形式包括液體制劑和固體制劑。
[0010]本發(fā)明提供的神經(jīng)生長因子緩釋納米載體是一種納米粒子，即聚乳酸-羥基乙酸共聚物包裹的神經(jīng)生長因子緩釋系統(tǒng)，其核是神經(jīng)生長因子，外殼是均勻、致密的聚乳酸-羥基乙酸共聚物。該共聚物能有效減緩神經(jīng)生長因子在體內(nèi)外的降解速度，增加其穩(wěn)定性和作用時(shí)間。聚乳酸-羥基乙酸是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、無毒及良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域，與其他包裹材料相比，大大提高了 NGF的包封率。NGF是具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，它對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。近年來，也發(fā)現(xiàn)NGF對(duì)于心血管系統(tǒng)亦有作用，可以增進(jìn)血管內(nèi)皮再生、抑制血管內(nèi)皮凋亡和抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。
[0011]本發(fā)明載體能有效減緩神經(jīng)生長因子在體內(nèi)外的降解速度，增加其穩(wěn)定性和作用時(shí)間。載體是聚乳酸-羥基乙酸，一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域，與其他包裹材料相比，大大提高了 NGF的包封率NGF是具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，它對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。近年來，也發(fā)現(xiàn)NGF對(duì)于心血管系統(tǒng)亦有作用，可以增進(jìn)血管內(nèi)皮再生、抑制血管內(nèi)皮凋亡和抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。
[0012]本發(fā)明(I)有效應(yīng)用了聚乳酸-羥基乙酸共聚物這一組織相容性好、無毒無害的納米材料，將其應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，可以明顯改善蛋白類藥物的穩(wěn)定性；(2)解決了 NGF在體內(nèi)外性質(zhì)不穩(wěn)定，消除半衰期短的問題，增加其在血液循環(huán)中維持的時(shí)間和血藥濃度。(3)對(duì)NGF的藥理作用進(jìn)行了二次開發(fā)，拓寬了 NGF的應(yīng)用范圍。利用其保護(hù)神經(jīng)的作用，將其應(yīng)用于糖尿病合并心肌缺血的治療中，具有很好的社會(huì)及市場(chǎng)前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為TEM下納米粒子放大50000倍的形態(tài)。
[0014]圖2為TEM下納米粒子放大100000的形態(tài)。
[0015]圖3為NGF-PLGA 21天體外單次釋放曲線。
[0016]圖4為NGF-PLGA 21天累積釋放曲線。
[0017]圖5為NGF-PLGA注射后不同時(shí)間點(diǎn)血清濃度。
[0018]圖6為NGF-PLGA對(duì)糖尿病心臟缺血再灌注后心功能的影響和相應(yīng)對(duì)照組比較。
[0019]圖7是NGF對(duì)LVDP恢復(fù)率的影響。
[0020]圖8是野生型、NGF組和糖尿病組TRPVl的表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。
[0022]實(shí)施例一:PLGA-NGF 制作
將500 μ g NGF加入250 μ I硼酸鹽緩沖溶液中(0.05Μ)，稱取0.5mg FITC加入250 μ I蛋白體系中，混合均勻，直到FITC完全溶解。室溫下避光反應(yīng)I小時(shí)后上純化柱純化，100g離心30-45秒，收集經(jīng)純化后的蛋白，4度避光冷藏。內(nèi)水相(W1 )，200 μ I經(jīng)FITC標(biāo)記后NGF加入5% PEG ;油相(0)，25mg PLGA溶于2毫升二氯甲烷與丙酮體積比為3:1的混合溶液中，將蛋白溶液加入到PLGA溶液中，100W冰水中超聲Imin制備油包水型乳液(W1A)X將(W1/
O)乳液加入1ml含0.7% PVA的水溶液中，55W冰水中超聲20min，得到水包油包水型復(fù)乳(W1AVW2)15將均勻的復(fù)乳倒入離心管中，51攝氏度真空旋蒸25min，以揮發(fā)溶劑。將乳液收集后，20000rpm，4° C離心20min，用蒸餾水沖洗沉淀3次洗凈納米粒表面的PVA以及游離的蛋白，然后收集納米粒。在-20 V冷凍干燥24h后，將凍干NGF-PLGA保存于2_8 V冰箱里。
[0023]實(shí)施例二:PLGA-NGF表面形態(tài)觀察
稱取PLGA-NGF納米粒子凍干粉lmg，加入到Iml蒸餾水中攪拌均勻形成白色乳液，吸取少量乳液滴在銅網(wǎng)上，再滴加2%磷鎢酸溶液負(fù)染，自然晾干。然后在透射電子顯微鏡(TEM)下觀察粒子的表面形態(tài)。參見圖1。
[0024]實(shí)施例三:納米粒子平均粒徑及粒徑分布的測(cè)定
稱取PLGA-NGF納米粒子凍干粉少許，用蒸餾水稀釋至目視稍顯渾濁的濃度，在室溫下(20攝氏度)用激光納米粒度分析儀(S90 Malvern，英國)測(cè)量粒子的平均粒徑和粒徑分布，取14個(gè)循環(huán),取三個(gè)獨(dú)立樣本,每個(gè)樣本測(cè)三次重復(fù)。
[0025]實(shí)施例四:PLGA-NGF體外釋放試驗(yàn)
稱取lmg PLGA-NGF納米粒子凍干粉，置于15ml離心管中，加入1ml PH 7.4的磷酸鹽緩沖液(phoshate-buffered saline, PBS)緩沖液中，37° C,速度10rpm的條件下進(jìn)行21天的釋放試驗(yàn)。在第4h、8h、12h、24h、之后隔天取樣一次，一直取樣到第21天，取三個(gè)獨(dú)立的樣本。
[0026]取樣方法:離心(12000rpm，4° C)，取上清液，并在離心管中加入等量的新鮮PBS緩沖液。采用NGF Ema； ImmunoAssay Syatem ELISA試劑盒來檢測(cè)上清液中NGF的含量，記錄了 21天內(nèi)的單次釋放量和累積釋放量。
[0027]21天的體外釋放結(jié)果參見圖2，可以看到，經(jīng)過21天的釋放，大約83.9%的NGF被釋放出來，有著明顯的緩釋效果，在最初的2天內(nèi)，NGF有一個(gè)突釋的過程，兩天內(nèi)釋放全部的大約60%，其原因主要是部分NGF存在于納米粒子的外層或者吸附在納米粒子表面，所以在PLGA初期降解的過程中，當(dāng)外殼崩解時(shí)，位于納米粒子表面和表層內(nèi)的NGF會(huì)被迅速釋放出來，且NGF的水溶性強(qiáng)，溶解速度快；2天之后漸趨穩(wěn)定，至14天，每天釋放的藥物在2%-5%這是因?yàn)殡S著釋放時(shí)間的增長，PLGA的骨架開始逐步降解，位于粒子內(nèi)部的藥物緩慢被釋放出來，到第15天后釋藥量有明顯的下降，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NGF在37° C情況下14天后會(huì)迅速變性失活，導(dǎo)致 檢測(cè)到的NGF的量明顯減少。由此可見，納米粒子的藥效持續(xù)時(shí)間最長不超過14天。見圖3和圖4。
[0028]實(shí)施例五:PLGA-NGF體內(nèi)釋放試驗(yàn)
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料
雄性6周齡ICR小鼠，體重20-25g ；NGF購買自R&D; PLGA-NGF劑量計(jì)算PLGA-NGF 的包封率為 7.76ug/mg ；PLGA, LA: GA 50:50 (摩爾比)購自 Iakeshoreb1material,美國.2.NGF血藥濃度測(cè)定
ICR小鼠35只，隨機(jī)分為7組，6組為實(shí)驗(yàn)組，I組為對(duì)照組，每組5只.。實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射NGF-PLGA (包封率為7.76ug/mg), NGF注射劑量為100ug/kg，給藥體積為0.1ml ；對(duì)照組小鼠注射同樣劑量的PBS緩沖液。實(shí)驗(yàn)各組小鼠給藥后分別于不同時(shí)間點(diǎn)(6h、12h、24h、2d、3d和5d)右心室取血0.6ml，收集于Iml離心管中，室溫靜置1min后，4°C離心分離血清，取心肌組織勻漿處理。將收集到血清樣品和心肌勻漿上清液存放于_80°C。樣品收集完全后，應(yīng)用ELISA法，確定NGF血藥濃度和心肌濃度。
[0029]PLGA-NGF體內(nèi)5天釋放結(jié)果如圖5所示:可以看到，PLGA-NGF可以持續(xù)緩慢釋放5天，前24h釋放較快，大部分NGF已釋放，2d-5d，血清NGF濃度已接近血清正常水平。單次注射PLGA-NGF在心肌組織的代謝結(jié)果如圖6所示:PLGA_NGF可以持續(xù)緩慢釋放5天，前24h釋放較快，大部分NGF已釋放，2d-5d，心肌NGF濃度已接近心肌正常水平。根據(jù)以前的文獻(xiàn)報(bào)道，未包裝的1251-NGF體內(nèi)釋放情況是:按劑量25 ug/kg靜注，測(cè)得消除相半衰期(tl/2(β ))為 3.65h。
[0030]實(shí)施例六:PLGA_NGF對(duì)糖尿病心臟缺血再灌注的心功能的影響
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料:雄性12周齡C57小鼠，體重20-25g ；Langendorff離體心臟灌流裝置購自南京美易科技有限公司。
[0031]2.實(shí)驗(yàn)步驟
應(yīng)用STZ腹腔注射制造糖尿病小鼠模型，造模成功后高脂飲食8周后，給予PLGA-NGF尾靜脈注射，100ug/kg,給藥體積為0.5ml,每日一次,共5天。對(duì)于注射后的糖尿病小鼠,迅速摘下心臟，于4°C K-H液中洗去心腔內(nèi)的血液后，將其主動(dòng)脈殘端掛于Langendorff裝置上。剪開左心耳，將充滿水的球囊通過左心耳插入左心室，球囊另一端與壓力換能器相接，壓力換能器另一端連接在生物信息采集器上。離體心臟用含95%氧氣和5% 二氧化碳混合氣體預(yù)飽和的K-H液灌流，穩(wěn)定期15min，停灌期40min和復(fù)灌期40min。觀察穩(wěn)定期和復(fù)灌期心功能指標(biāo):LVSP、LVDP, CF和±dp/dt。并與未進(jìn)行PLGA-NGF治療的糖尿病小鼠離體心臟灌流情況相比較。分別取注射了 PLGA-NGF治療的糖尿病小鼠和未治療的糖尿病小鼠的心肌組織，提取蛋白做western blot,以推測(cè)是否PLGA-NGF治療糖尿病合并心肌缺血與改善感覺神經(jīng)受體TRPVl的功能有關(guān)。
[0032]3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
參見附圖7，給予PLGA-NGF治療的糖尿病小鼠，離體心臟缺血復(fù)灌后，心功能損傷程度明顯弱于對(duì)照組 ，分析可能心肌組織改善神經(jīng)功能有關(guān)。見附圖8，給予PLGA-NGF治療的糖尿病小鼠，其心肌組織TRPVl表達(dá)量較為治療糖尿病小鼠有所上升。
【權(quán)利要求】
1.一種神經(jīng)生長因子緩釋納米載體的制備方法，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)制備內(nèi)水相、油相和外水相:內(nèi)水相Wl為NGF加入體積百分?jǐn)?shù)為5%的聚乙二醇；油相O為PLGA溶于二氯甲烷與丙酮體積比為3:1的混合溶液，聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA濃度為1.25% ;外水相W2為體積百分?jǐn)?shù)為0.7%的聚乙烯醇水溶液； (2)制備包裹NGF的PLGA微球:將所述內(nèi)水相Wl加入油相O中，10W冰水中超聲Imin制備油包水型乳液Wl/Ο，將Wl/Ο乳液加入含0.7%聚乙烯醇的水溶液中，ffl/Ο乳液與外水相W2體積比為1:5 ;55W冰水中超聲20min，得到水包油包水型復(fù)乳W1/0/W2，將均勻的復(fù)乳倒入離心管中，51攝氏度真空旋蒸25min，以揮發(fā)溶劑； (3)離心、沖洗、干燥、冷藏包裹神經(jīng)生長因子的聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球:將步驟(2)乳液收集后，20000rpm，4° C離心20min，用蒸餾水沖洗沉淀3次洗凈納米粒表面的聚乙烯醇以及游離的蛋白，然后收集納米粒，-20°C冷凍干燥24h，冰凍干燥后，將凍干的包裹神經(jīng)生長因子的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米微球儲(chǔ)存于2-8°C冰箱中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種神經(jīng)生長因子緩釋納米載體的制備方法，其特征在于，包裹的神經(jīng)生長因子為鼠源性神經(jīng)生長因子mNGF和人工合成rhNGF。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種神經(jīng)生長因子緩釋納米載體的制備方法，其特征在于，包裹神經(jīng)生長因子的聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球呈光滑的球形，其平均粒徑為250-330nm，微球的載藥量為 7.76ug/mg-8ug/mg，包封率為 50%_80%。
4.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的一種神經(jīng)生長因子緩釋納米載體的制備方法，其特征在于，其中聚乳酸-羥基乙酸共聚物選用乳酸:羥基乙酸的摩爾比為50:50。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法制備的一種神經(jīng)生長因子緩釋納米載體在制備治療糖尿病合并冠心病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K47/34GK104027793SQ201410230303
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】鄭良榮, 趙文婷, 張媛媛, 孫澤瑋, 韓飛 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)