偽狂犬病病毒雙熒光標記缺失病毒的構建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種偽狂犬病病毒雙熒光標記缺失病毒的構建。該病毒以自行分離的一株偽狂犬病病毒(SX株)為母本，通過分子生物學、細胞生物學等手段，缺失gE基因、gI基因、US9基因和TK基因，并以綠色熒光蛋白(GFP)和紅色熒光蛋白(RFP)作為標記蛋白代替缺失的基因，獲得雙熒光標記的缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+；以該雙熒光標記缺失病毒作為活載體的成功構建，為研制重組偽狂犬病基因工程疫苗奠定了基礎。
【專利說明】偽狂犬病病毒雙熒光標記缺失病毒的構建
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)雙熒光標記基因缺失病毒(rPRV/gE - /gl - /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+)的構建，屬于生物技術和動物病毒學領域。
【背景技術】
[0002]偽狂犬病(Pseudorabies,PR ;又名 Aujeszky’ s disease, AD)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)引起的一種急性傳染病,可感染多種家畜、伴侶動物及野生動物。豬是感染后可以存活的唯一物種，也是貯存宿主。感染豬主要表現為神經癥狀、流涎、呼吸困難、母豬繁殖障礙、仔豬高死亡率等，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。
[0003]PRV是皰疫病毒科、α皰疫病毒亞科、水痘病毒屬的成員，與其同屬的還有I型牛皰疹病毒(BHV-1)、馬皰疹病毒(EHV)以及水痘帶狀皰疹病毒(VSV)。PRV基因組為線性雙股DNA，約145Kb，由長獨特區(qū)(UL)和短獨特區(qū)(US)及US兩側的末端倒轉重復(TR)與內部重復(IR)組成，可編碼70-100種蛋白質，成熟的病毒粒子約有50種蛋白。在上述基因產物中，UL區(qū)段中的gC、TK及US區(qū)段中的PK、gG、gl、gE、IIK和28K為病毒增殖的非必需成份，一般認為，TK、gC、gE、PK和CP (衣殼蛋白)等與PRV毒力相關。
[0004]疫苗免疫接種是防制偽狂犬病的主要策略。偽狂犬疫苗主要分為三種:一是常規(guī)疫苗，即滅活疫苗 和弱毒活疫苗，如目前應用較多的Bartha-K61株活疫苗；二是基因缺失疫苗，即通過分子生物學方法，人工缺失某些基因，使其毒力減弱的同時又保留其免疫原性。目前構建的偽狂犬病病毒基因工程疫苗大多為TK、g1、gE、gG基因的單基因缺失或多基因缺失突變株。目前在我國批準生產使用的有TK和gG雙基因缺失株(HB98株)活疫苗。PRV作為基因工程載體具備相當的優(yōu)勢:(I)PRV不感染人，具有很好的安全性?，F有的活疫苗株Bartha-K61或‘783’等在世界上已應用了幾十年，未發(fā)生重大的安全事故。(2)基因組容量大:在PRV長達145Kb的基因組中，約一半基因被認為是非必需的，如g1、gE、gM、TK、PK、gC和dUTPase等，在這些區(qū)域可先后或同時插入和表達多種外源基因而不顯著影響其繁殖及免疫原性。(3)生產原材料來源方便，生產成本低:PRV疫苗可以接種SPF雞胚成纖維細胞及PK15、ST等傳代細胞生產，原材料充足，生產工藝成熟，且PRV病毒滴度很容易達到免疫要求，大大降低了生產成本。(4)免疫期長:PRV以細胞免疫為主，病毒可以較長時間感染，外源基因可以在體內持續(xù)表達。(5)宿主范圍廣，多種家畜、經濟動物(如狐和貂)、伴侶動物及野生動物均可感染PRV，可研制針對不同動物的活載體疫苗。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是將自行分離并經鑒定命名為SX株的偽狂犬病病毒作為母本，經基因工程方法構建缺失gE、gl、US9和TK基因并插入GFP和RFP標記的重組病毒；并以該重組病毒作為偽狂犬活病毒載體系統(tǒng)，用于基因工程疫苗的開發(fā)和應用。
[0006]本發(fā)明的技術方案
[0007]1.一種偽狂犬病病毒雙熒光標記缺失病毒(rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+)，其特征在于，所表述的毒株同時缺失了 gE基因、gl基因、US9基因和TK基因四種偽狂犬病病毒基因，在基因缺失的部位通過同源重組分別插入綠色熒光蛋白(GFP)基因和紅色熒光蛋白(RFP)基因作為標記物，命名為偽狂犬病病毒雙熒光標記缺失病毒rPRV/gE ~ /8廠/^9-/11(-/^?71^+株，該毒株已于2014年05月06日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為:CGMCC N0.8879。
[0008]2.如權利要求1所述的雙熒光標記的偽狂犬缺失病毒的構建方法，其特征在于該毒株構建的步驟為:
[0009](I)分離和鑒定親本毒株，命名為PRV SX株；
[0010](2)轉移載體的構建，以PMD-18T克隆載體為骨架載體，構建兩種轉移載體:第一種轉移載體為PMD-US6-GFP-US2，插入偽狂犬病病毒g1、gE和US9兩端的US6和US2部分基因序列作為同源臂，左右同源臂間插入GFP基因；第二種轉移載體為PMD-UL24-RFP-UL22，插入偽狂犬病病毒TK基因兩端的UL24和UL22部分基因序列作為同源臂，左右同源臂間插入RFP基因；
[0011](3)雙熒光標記缺失病毒的構建，PMD-US6-GFP-US2轉移載體與親本株PRVSX株共轉染PK15細胞，通過克隆篩選，獲得含GFP標記蛋白的缺失病毒rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /GFP+ ;進而，再與pMD-UL24-RFP-UL22轉移載體共轉染PK15細胞，通過克隆篩選獲得雙熒光標記缺失病毒 rPRV/gE /gl /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+ 株。
[0012]3.權利要求包含如權利要求1所述的偽狂犬病病毒雙熒光標記缺失病毒在基因工程疫苗研制方面的應用，其特征在于rPRV/gE - /gl - /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+株作為活載體病毒可插入一種和/或多種動物病原抗原基因，以獲得表達外源基因的重組病毒，制備基因工程活載體疫苗，達到同時防制多種疾病的目的。
[0013]本發(fā)明技術路線如下:
[0014]1.從我國山西疑似PRV感染的病死豬中采集腦組織，提取DNA，利用PRV特異性引物進行PCR鑒定。將陽性腦組織進行凍融、離心、過濾等處理后接種PK15細胞進行病毒分離，并通過PCR方法、序列測定、特異性血清中和試驗等手段進行鑒定。試驗結果表明成功分離到一株PRV毒株，命名為SX株，PCR鑒定為PRV陽性，基因序列測定結果與GenBank上發(fā)表的PRV序列同源性在95%以上。該毒株能被PRV特異性陽性血清中和。
[0015]2.通過基因克隆技術以PRV(SX株)部分US6和US2基因序列作為同源臂，以及綠色熒光蛋白基因GFP作為篩選標記構建轉移載體pMD-US6-GFP-US2，將PRV (SX株)病毒和轉移載體共轉染PK15細胞獲得缺失gE、gl和US9基因，同時插入GFP標記的重組病毒rPRV/gE ' /gl ' /US9 ' /GFP+?
[0016]3.以TK基因兩測的UL24和UL22部分基因序列為同源臂，以紅色熒光蛋白基因(RFP)作為篩選標記構建轉移載體pMD-UL24-RFP-UL22，將其與rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /GFP+病毒共轉染PK15細胞獲得缺失TK基因同時插入RFP標記的重組病毒rPRV/gE ~ /gi' /us9' /TK' /gfp+/rfp+o
[0017]4.對重組病毒rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+進行生物特性分析，試驗結果表明該重組病毒能在PK15細胞上穩(wěn)定遺傳,對小鼠安全?！揪唧w實施方式】
[0018]一、偽狂犬病病毒(SX株)的分尚與鑒定
[0019]1.病料處理無菌取PRV陽性腦組織(采自我國山西某豬場，經PRV特異性引物g1-F/g1-R(序列I/序列2)鑒定為PRV陽性，與PBS以1:10 (V/V)比例勻漿，反復凍融3次，5000r/min離心30min，加入青鏈霉素各1000U/ml，4°C作用過夜，經0.45 μ m濾膜過濾除菌，_70°C保存?zhèn)溆?，引物序列如?
[0020]g1-F5，-CGGCTGCTGTTCGTCTCG-3’(序列 I)，
[0021]g1-R5，-TCGTCGCCGTTGAGGTCGC-3，(序列 2)。
[0022]2.細胞培養(yǎng)取經以上過濾除菌的病料濾液接種PK15細胞(中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供)，37°C培養(yǎng)，連續(xù)傳代觀察，盲傳2代后接種細胞開始出現細胞圓縮，逐步空泡化的典型細胞病變。當細胞病變達80%時收獲感染的細胞培養(yǎng)液(分離物)并連續(xù)傳代以適應細胞生長。
[0023]3.分離物的鑒定 [0024](I)病毒含量測定將分離毒株做10倍系列稀釋，取KT1~10,接種于已長成良好細胞單層的PK15細胞(由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供)96孔細胞板，每個稀釋度接種6孔，每孔接種0.1ml，同時設正常細胞對照。置37°C，含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)觀察3~5日，記錄每個稀釋度CPE數，按Reed-Muench法計算分離毒株TCID5tl,該毒株在PK15細胞中繁殖滴度可達106 5TCID5Q/0.1ml。
[0025](2)中和試驗將分離毒株病毒液(分離物)稀釋至200TCID5Q/0.1ml，與等體積的PRV陰性血清或陽性血清(來自中國獸醫(yī)菌種保藏中心)混合，37°C作用I小時后接種已長成良好PK15細胞單層的96孔細胞板，每個中和樣品接種6孔，每孔0.1ml,同時設立正常細胞對照。培養(yǎng)觀察5日，記錄每個處理樣品的CPE數。結果分離物與陽性血清混合液接種細胞未出現特異性細胞病變，分離物與陰性血清混合液接種細胞出現特異性細胞病變，表明該分離物能被PRV特異性陽性血清中和。
[0026](3)分離毒株PCR鑒定及主要基因的序列測定
[0027]根據GenBank上PRV序列，自行設計PRV gE、gl、TK基因擴增引物，PCR擴增分離毒株的相應片段并進行序列測定。經序列測定分析證實，該毒株與GenBank上登錄的PRV各主要基因片段的同源性均在95%以上，以上引物序列如下:
[0028]gE-F5，-AGACCATGCGGCCCTTTCTG-3，(序列 3)
[0029]gE-R5，-CGACAGCGAGCAGATGACCAG-3，(序列 4)
[0030]TK-F5，-GACACGGTGGCCGGTATTTACG-3’(序列 5)
[0031]TK-R5’ -GGTGACGGGCACGGCAAACT-3’ (序列 6)
[0032]二、偽狂犬病病毒雙熒光標記缺失病毒(rPRV/gE7gr/US97TK7GPF+/RFP+)的構建
[0033]1.載體
[0034]PMD-18T載體，用于克隆測序及轉移載體的構建，購自寶生物工程(大連)有限公司。含有GFP基因的載體pU-EGFP和含有RFP基因的載體pU_ERFP，均由本實驗室保存。
[0035]2.引物設計
[0036]根據GenBank上發(fā)表的PRV序列設計合成以下引物:[0037]擴增gl基因左同源臂:
[0038]US6F:5，-GACTTAAGGATCTCCGACCCGCAGGTGG-3’ (序列 7)
[0039]US6R:5，-GACTTAAGGGAGCCGGGTCACGTCGCGC G-3’(序列 8)
[0040]US9基因右同源臂:
[0041]US2F:5，-GACTAGTATGGGGGTGACGGCCATCAC-3，(序列 9)
[0042]US2R:5，-GACTAGTCGGAGAGATCCTGCCGTCTAGG-3’(序列 10)
[0043]GFP 基因:
[0044]EGFP-F:5，-GGTATACGGATCCAAGGAGATATAACA-3’ (序列 11)
[0045]EGFP-R:5，-GACTAGTGAGCTCTTAAAGCTCATCAT-3，(序列 12)
[0046]US9 基因:
[0047]PUS9-F:5，-AGAAACCGGAAGTGACGAATGG-3’ (序列 13)
[0048]PUS9-R:5，-AGGAGCACCTGGTCGCAGAG-3’(序列 14)
[0049]TK基因左同源臂:
[0050]UL24F:5，-GGTATACCCGTGGTCGTCACGCCCATGAA-3’ (序列 15)
[0051]UL24R:5，-G GTATACATGCGCATCCCGGCGCGCTTC-3，(序列 16)
[0052]TK基因右同源臂:
[0053]UL22F:5，-GACTAGTATGCCCGCGTCGTCCGTGCGC-3，(序列 17)
[0054]UL22R:5，-GACTAGTGCGGTACGCCTCGGCGACGGT-3，(序列 18)
[0055]RFP 基因:
[0056]RFP-F:5，-GGTATACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’ (序列 19) [0057]RFP-R:5，-GACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3，(序列 20)
[0058]3.含GFP標記的偽狂犬缺失病毒(rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /GFP+)的構建
[0059](I)轉移載體 pMD-US6-GFP-US2 的構建
[0060]以PRV (SX株)基因組為模板，采用引物US6F/R和US2F/R分別擴增gE、g1、US9缺失的同源重組左同源臂和右同源臂；以pU-EGFP為模板，用引物EGFP-F/EGFP-R擴增GFP基因。擴增目的片段分別連接PMD-18T載體，構建相應的重組質粒。以Sbfl/Aflll雙酶切左臂，以Spel/EcoRI雙酶切右臂，回收相應片段后依次與pMD_GFP質粒相應酶切后的片段連接，獲得轉移載體PMD-US6-GFP-US2。
[0061](2)同源重組
[0062]將轉移載體pMD-US6-GFP-US2與PRV (SX株)親本株共轉染PK15細胞，按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書(見附件I)進行轉染。轉染24小時后，觀察細胞病變及熒光蛋白表達情況。轉染細胞裂解后盲傳兩代，仍有綠色熒光表達，初步判斷重組病毒拯救成功。
[0063](3)重組病毒的蝕斑純化
[0064]將初步獲得的重組病毒接種已長成良好細胞單層的PK15細胞6孔細胞板，吸附I小時后，棄去吸附液，鋪上I %的低熔點瓊脂糖，繼續(xù)培養(yǎng)。接種48小時后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，挑選單個熒光蝕斑于ImlDMEM營養(yǎng)液中，凍融I次后，如此進行蝕斑純化3~4次，將獲得的重組病毒命名為rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /GFP+0
[0065](4)重組病毒 rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /GFP+ 的鑒定[0066] 采用gE、g1、US9和GFP基因特異性引物進行PCR擴增鑒定，結果發(fā)現未擴增出gE、gl和US9片段，擴增出GFP片段。經測序證實，重組病毒缺失了 gE、gI和US9三段基因，并成功插入了 GFP標記基因。
[0067]2.偽狂犬病病毒雙熒光標記缺失病毒(rPRV/gE7gr/US97TK7GFP+/RFP+)的構建
[0068](I)轉移載體的構建
[0069]以PRV(SX株)基因組為模板，采用引物UL24F/R和UL22F/R分別擴增TK缺失的同源重組左同源臂和右同源臂；以pU-RFP為模板，用引物RFP-F/RFP-R擴增RFP基因。擴增目的片段分別連接PMD-18T載體，構建相應的重組質粒。以SbfI/BstZ17I雙酶切左臂，以Spel/EcoRI雙酶切右臂，回收相應片段后依次與pMD-RFP質粒相應酶切后的片段連接，獲得轉移載體PMD-UL24-RFP-UL22。
[0070](2)同源重組
[0071]將轉移載體pMD-UL24-RFP-UL22 與 rPRV/gE ' /gl ' /US9 ' /GFP+ 共轉染 PK15 細胞，按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書(見附件I)進行轉染。轉染24小時后，觀察細胞病變及熒光蛋白表達情況。轉染細胞裂解后盲傳兩代，仍有綠色和紅色雙色熒光表達，初步判斷重組病毒拯救成功。
[0072](3)重組病毒的蝕斑純化
[0073]將初步獲得的重組病毒接種已長成良好細胞單層的PK15細胞6孔細胞板，吸附I小時后，棄去吸附液，鋪上I %的低熔點瓊脂糖，繼續(xù)培養(yǎng)。接種48小時后在熒光顯微鏡下觀察熒光，挑選同時表達了綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的單個熒光蝕斑于ImlDMEM營養(yǎng)液中，凍融I次后，如此進行蝕斑純化4次，將獲得的重組病毒命名為偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)雙突光標記缺失株(rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+),該株病毒已于2014年05月06日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為=CGMCCN0.8879。
[0074](4)重組病毒 rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+ 的鑒定
[0075]采用gE、gl、US9、GFP, TK和RFP基因特異性引物進行PCR擴增鑒定，結果發(fā)現未擴增出gE、g1、US9、TK基因片段，擴增出GFP、RFP基因片段。經測序證實，重組病毒缺失了gE、g1、US9、TK基因，并成功插入了 GFP、RFP標記基因(見附圖3，序列21/序列22)。
[0076](5)重組病毒 rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+ 生物學特性
[0077]I)病毒含量測定對重組病毒rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+株病毒進行病毒含量測定。結果發(fā)現重組病毒含量可達107_°TCID5(l/ml。
[0078]2)遺傳穩(wěn)定性試驗重組病毒rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+株病毒在PK15細胞上傳代10代，綠色和紅色熒光蛋白均能穩(wěn)定表達(附圖4)，通過PCR鑒定每個代次的病毒液，可檢測到插入的GFP基因和RFP基因及插入點兩側的病毒基因序列，表明所獲得的重組病毒rPRV/gE - /gl - /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+株病毒能穩(wěn)定遺傳。
[0079]3)對小鼠安全性試驗將rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+及親本株SX株分別以IO6.0TCID50病毒量接種Balb/c小鼠，每組6只，觀察14天，結果rPRV/gE VglVUS9 - /TK - /GFP+/RFP+株病毒接種的小鼠在14天均表現正常，而接種SX株PRV的小鼠全部死亡，取兩組小鼠腦組織，病料處理后接種PK15細胞，rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+株病毒組小鼠的腦組織中均能檢測到紅色突光和綠色突光。由此說明，重組病毒rPRV/gE - /gl - /US9 - /TK - /GFP+/RFP+毒力較親本株明顯下降，且高劑量攻擊小鼠，對小鼠是安全的。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0080]圖1發(fā)病豬腦組織樣品gl基因PCR鑒定結果圖中:M =DNAMarker2000 ;1、腦組織樣品；2、陽性對照(PRV疫苗)；3、滅菌水陰性對照
[0081]圖2分離病毒在PK15細胞上的病變情況圖中:A圖為用分離病毒接種PK15細胞20小時后細胞開始脫落，出現空泡；B圖為正常細胞對照。
[0082]圖3 重組病毒 rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+PCR 鑒定電泳圖中:M:DNAMarkerIV ;1、2、3、4分別為重組病毒gE、gl、US9、GFP擴增結果；5、6、7、8分別為親本毒PRVSX株gE、g1、US9、GFP擴增結果；9、10分別為重組病毒TK、RFP擴增結果；11、12分別為親本毒SX株TK、RFP擴增結果。
[0083]圖4rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+ 感染 PK15 細胞熒光觀察圖中:A 圖為重組病毒接種PK15細胞后在藍色激發(fā)光下觀察到的綠色熒光蝕斑；B圖為重組病毒接種PK15細胞后在綠色激發(fā) 光下觀察到的與綠色熒光位置相同的紅色熒光蝕斑；C圖為相同位置綠色和紅色兩種熒光重疊效果。
[0084]本發(fā)明涉及的微生物資源信息
[0085]本發(fā)明涉及的微生物為:偽狂犬病病毒(SX株)，系本 申請人:自行由山西某豬場采集的病死豬腦組織病料中分離、鑒定而獲得；并對此分離病毒經分子生物技術，缺失gE基因、gl基因、US9基因和TK基因，并以綠色熒光蛋白(GFP)和紅色熒光蛋白(RFP)作為標記蛋白代替缺失的基因，獲得雙熒光標記的缺失病毒，命名為偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus, PRV)雙熒光標記缺失病毒(rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+)，該株病毒已于2014年05月06日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為=CGMCC N0.8879。
[0086]本發(fā)明的積極意義
[0087]本發(fā)明涉及一種偽狂犬病病毒雙熒光標記缺失病毒的構建。該病毒以自行分離的一株偽狂犬病病毒(SX株)為母本，通過分子生物學、細胞生物學等手段，缺失gE基因、gl基因、US9基因和TK基因，并以綠色熒光蛋白(GFP)和紅色熒光蛋白(RFP)作為標記蛋白代替缺失的基因，獲得雙熒光標記的缺失病毒株(rPRV/gE - /gl - /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+)。本發(fā)明建立了一套偽狂犬活病毒載體系統(tǒng)；雙熒光蛋白標記便于今后基因工程操作的篩選和鑒定；可同時插入多種外源基因，較一般活載體系統(tǒng)更加高效。該雙熒光標記缺失病毒作為活載體的成功構建，為研制重組偽狂犬病基因工程疫苗奠定了基礎。
[0088]實施例
[0089]以下實施例為更好說明本發(fā)明的技術方案，但不對本發(fā)明技術方案構成限制。
[0090]實施例1
[0091]—偽狂犬病病毒(SX株)的分離與鑒定
[0092]1.材料病死豬腦組織，采自我國山西某豬場，經PRV特異性引物gl-F/gl-R(序列
I和序列2)，鑒定為PRV陽性(見附圖1)。PRV陰性血清、PRV陽性血清、PK15細胞，由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供，本實驗室保存；PRV特異性引物gl-F/gl-R的序列如下:
[0093]gl-F 5，-CGGCTGCTGTTCGTCTCG-3’(序列 I)，
[0094]gl-R 5，-TCGTCGCCGTTGAGGTCGC-3，(序列 2)。
[0095]2.病料處理無菌取PRV陽性腦組織，與PBS以1:10 (V/V)比例勻衆(zhòng)，反復凍融3次，5000r/min離心30min，加入青鏈霉素各1000U/ml，4°C作用過夜，經0.45 μ m濾膜過濾除菌，-70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0096]3.細胞培養(yǎng)取經以上過濾除菌的病料濾液接種PK15細胞(中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供)，37°C培養(yǎng)，連續(xù)傳代觀察，盲傳2代后接種細胞開始出現細胞圓縮，逐步空泡化的典型細胞病變(見附圖2)。當細胞病變達80%時收獲感染的細胞培養(yǎng)液(分離物)并連續(xù)傳代以適應細胞生長。
[0097]4.分離物的鑒定
[0098](I)病毒含量測定將分離毒株做10倍系列稀釋，取KT1~10,接種于已長成良好細胞單層的PK15細胞96孔細胞板，每個稀釋度接種6孔，每孔接種0.1ml，同時設正常細胞對照。置37°C，含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)觀察3~5日，記錄每個稀釋度CPE數，按Reed-Muench法計算分離毒株TCID5tl,該毒株在PK15細胞中繁殖滴度可達106.5TCID50/0.1m lo
[0099](2)中和試驗將分離毒株病毒液(分離物)稀釋至200TCID5Q/0.1ml，與等體積的PRV陰性血清或陽性血清(來自中國獸醫(yī)菌種保藏中心)混合，37°C作用I小時后接種已長成良好PK15細胞單層的96孔細胞板，每個中和樣品接種6孔，每孔0.1ml,同時設立正常細胞對照。培養(yǎng)觀察5日，記錄每個處理樣品的CPE數。結果分離物與陽性血清混合液接種細胞未出現特異性細胞病變，分離物與陰性血清混合液接種細胞出現特異性細胞病變，表明該分離物能被PRV特異性陽性血清中和。
[0100](3)分離毒株PCR鑒定及主要基因的序列測定
[0101]根據GenBank上PRV序列，自行設計PRV gE、gl、TK基因擴增引物(序列3/序列
4、序列I/序列2和序列5/序列6)，PCR擴增分離毒株的相應片段并進行序列測定。經序列測定分析證實，該毒株與GenBank上登錄的PRV各主要基因片段的同源性均在95%以上，以上引物序列如下:
[0102]gl-F 5，-CGGCTGCTGTTCGTCTCG-3’(序列 I)，
[0103]gl-R 5，-TCGTCGCCGTTGAGGTCGC-3，(序列 2)
[0104]gE-F5，-AGACCATGCGGCCCTTTCTG-3，(序列 3)
[0105]gE-R5’ -CGACAGCGAGCAGATGACCAG-3，(序列 4)
[0106]TK-F5，-GACACGGTGGCCGGTATTTACG-3’(序列 5)
[0107]TK-R5’-GGTGACGGGCACGGCAAACT-3’(序列 6)。
[0108]實施例2
[0109]——偽狂犬病病毒雙熒光標記缺失病毒(rPRV/gE7gr/US97TK7GPF+/RFP+)的構建
[0110]1.載體
[0111]PMD-18T載體，用于克隆測序及轉移載體的構建，購自寶生物工程(大連)有限公司。含有GFP基因的載體pU-EGFP和含有RFP基因的載體pU_ERFP，均由本實驗室保存。
[0112]2.引物設計
[0113]根據GenBank上發(fā)表的PRV序列設計合成以下引物(見表1):
[0114]表1本發(fā)明構建所涉及的相關引物信息
[0115]
【權利要求】
1.一種偽狂犬病病毒雙熒光標記缺失病毒，其特征在于，所表述的偽狂犬病病毒同時缺失了 gE基因、gl基因、US9基因和TK基因四種偽狂犬病病毒基因，在基因缺失的部位通過同源重組分別插入GFP基因和RFP基因作為標記物，該毒株被命名為偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus)雙突光標記缺失病毒 rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 _ /TK _ /GFP+/RFP+株，該毒株已于2014年05月06日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為=CGMCC N0.8879。
2.如權利要求1所述偽狂犬病病毒雙熒光標記缺失病毒的構建方法，其特征在于該毒株的構建步驟為: (1)分離和鑒定親本毒株，命名為PRVSX株； (2)轉移載體的構建，以PMD-18T克隆載體為骨架載體，構建兩種轉移載體:第一種轉移載體為PMD-US6-GFP-US2，插入偽狂犬病病毒gl、gE和US9兩端的US6和US2部分基因序列作為同源臂，左右同源臂間插入GFP基因；第二種轉移載體為pMD-UL24-RFP-UL22，插入偽狂犬病病毒TK基因兩端的UL24和UL22部分基因序列作為同源臂，左右同源臂間插入RFP基因； (3)雙熒光標記缺失病毒的構建，pMD-US6-GFP-US2轉移載體與親本株PRVSX株共轉染PK15細胞，通過克隆篩選，獲得含GFP標記蛋白的缺失病毒rPRV/gE ~ /gl ~ /US9 ~ /GFP+ ；進而，再與PMD-UL24-RFP-UL22轉移載體共轉染PK15細胞，通過克隆篩選獲得偽狂犬病病毒雙熒光標記缺失病毒rPRV/gE /gl /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+株。
3.如權利要求1所述的偽狂犬病病毒雙熒光標記缺失病毒的在基因工程疫苗研制方面的應用，其特征在于rPRV/gE - /gl - /US9 ~ /TK ~ /GFP+/RFP+株作為活載體病毒可插入一種和/或多種動物病原抗原基因，以獲得表達外源基因的重組病毒，制備基因工程活載體疫苗，達到同時防制多種疾病的目的。
【文檔編號】A61K39/245GK103981153SQ201410234394
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權日:2014年5月29日
【發(fā)明者】李俊平, 陳曉春, 楊承槐, 李啟紅, 李慧姣, 夏業(yè)才, 吳華偉, 鄧永, 徐微, 蔡青秀 申請人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所