一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料及其制備方法，其由具有相互貫通的大孔結(jié)構(gòu)的三維打印聚合物骨架和作為填充材料且具有微孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)材料組成。制備步驟為：1)用三維打印機(jī)制作聚合物三維骨架；2)配置蛋白質(zhì)的水溶液；3)冷凍干燥；4)加入交聯(lián)劑，水洗，再次冷凍干燥，即得到產(chǎn)品。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性高，全程不涉及有機(jī)溶劑，綠色安全，制備的骨組織支架力學(xué)性能良好，該支架中聚合物與蛋白緊密結(jié)合，其中聚合物骨架可以提供足夠的強(qiáng)力，而蛋白質(zhì)部分則可以提供更多的細(xì)胞粘附位點(diǎn)，有利于細(xì)胞的滲透長(zhǎng)入，進(jìn)而促進(jìn)組織再生。
【專利說(shuō)明】一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織工程和生物制造領(lǐng)域，特別涉及一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，由于創(chuàng)傷、腫瘤切除、感染、發(fā)育異常等原因造成的骨缺損的發(fā)病率較高，對(duì)患者日常生活產(chǎn)生了嚴(yán)重影響。現(xiàn)有的方法主要是自體骨和異體骨移植，自體骨的來(lái)源較少，且會(huì)給病人帶來(lái)一定的痛苦；異體骨移植容易引發(fā)排斥反應(yīng)，其應(yīng)用受到限制。近年來(lái)，以生物材料為基礎(chǔ)的骨組織工程的發(fā)展為治療骨缺損提供了新的途徑。骨組織工程包括種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和支架三個(gè)要素。其中三維空間支架可以為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供粘附位點(diǎn)、營(yíng)養(yǎng)輸送和代謝廢物的排放場(chǎng)所。骨組織工程改變了骨缺損修復(fù)的傳統(tǒng)模式，以少量細(xì)胞修復(fù)大塊組織缺損，同時(shí)可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行塑造達(dá)到理想狀態(tài)。
[0003]目前，快速成型技術(shù)三維打印被廣泛應(yīng)用于個(gè)性化骨修復(fù)支架材料的制備，是生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)和現(xiàn)代制造技術(shù)等多學(xué)科交叉發(fā)展的產(chǎn)物，能夠滿足臨床治療的迫切需求。三維打印骨組織工程支架的強(qiáng)力較大，更接近于天然骨的力學(xué)性能。該方法有效地縮短了開(kāi)發(fā)周期，降低了研發(fā)費(fèi)用，其精確定制可以滿足不同部位不同形狀的骨缺損修復(fù)，在復(fù)雜性狀的骨支架制備方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)?？梢愿鶕?jù)病人個(gè)性化的要求快速制備出任意形狀大小的骨組織工程支架。然而現(xiàn)有的三維打印骨組織工程支架由于打印技術(shù)的限制，其結(jié)構(gòu)無(wú)法再更精細(xì)的尺度上模仿天然骨的結(jié)構(gòu)，孔徑尺寸過(guò)大無(wú)法提供所必需的粘附位點(diǎn)使得組織難以長(zhǎng)入支架內(nèi)部(Roosa, Kemppainen et al.2010)。而且可以通過(guò)此方法加工的材料比較有限，多為高聚物合成材料，其生物相容性受到了限制。
[0004]此外，冷凍干燥技術(shù)也被應(yīng)用于制備三維多孔骨組織工程支架材料，利用冷凍過(guò)程中冰晶的生長(zhǎng)在支架內(nèi)部形成比較均勻的分布，冷凍干燥后，冰晶被去除，冰晶所在的位置形成大小均勻且相互貫通的孔洞。利用此方法可以將多種水溶性蛋白質(zhì)或其它生物材料制備成多孔結(jié)構(gòu)的支架。利用該種方所制備的支架，其孔洞大小可控、取向排列可控(Wu，Liu et al.2010)，具有良好的生物相容性，研究表明其能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖與滲透(Mandaland Kundu2009)，并被應(yīng)用于組織工程支架和醫(yī)用敷料的制備。然而該種微孔支架的力學(xué)性能較差，尤其是濕態(tài)下容易變形，限制了其在骨組織工程中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料及其制備方法，該支架的聚合物骨架能夠?yàn)楣墙M織再生提供必需的力學(xué)支撐，而蛋白質(zhì)材料形成的微孔結(jié)構(gòu)能夠?yàn)楣墙M織細(xì)胞提供有利的生長(zhǎng)環(huán)境，有效的促進(jìn)骨組織的再生。
[0006]本發(fā)明的一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料，由具有相互貫通的大孔結(jié)構(gòu)的三維打印聚合物骨架和作為填充材料且具有微孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)材料組成。
[0007]所述大孔結(jié)構(gòu)孔徑為0.1-20毫米；所述微孔結(jié)構(gòu)孔徑為0.05-0.6毫米。[0008]所述聚合物是聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚氨酯中的一種或幾種；所述蛋白質(zhì)是明膠、再生絲素、膠原等水溶性蛋白中的一種或幾種。
[0009]所述聚合物骨架與納米羥基磷灰石形成聚合物/納米羥基磷灰石骨架，納米羥基磷灰石的質(zhì)量百分比為10% -60%。
[0010]所述蛋白質(zhì)中包含活性物質(zhì)；其中，活性物質(zhì)為藥物、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)納米顆粒中的一種或幾種。
[0011]所述藥物是慶大霉素、四環(huán)素等抗菌類藥物、抗炎癥類藥物、紫杉醇等抗癌癥類藥物中的一種或幾種；生長(zhǎng)因子是骨形態(tài)發(fā)生蛋白或者轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白為BMP-U BMP-2、BMP-3、BMP-7或BMP-14 ;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子為TGF-α或TGF-β ;無(wú)機(jī)納米顆粒為納米羥基磷灰石或納米生物玻璃顆粒，無(wú)機(jī)納米顆粒直徑為30-200納米，無(wú)機(jī)納米顆粒與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1: 0.5-10。
[0012]所述聚合物骨架外觀形狀為立方體、圓柱體、長(zhǎng)方體、截面為異形多邊形或圓環(huán)的柱體中的一種。
[0013]本發(fā)明的一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料的制備方法，其包括下述步驟: [0014](I)三維打印:將聚合物加熱使其熔融，利用三維打印機(jī)擠出，擠出的聚合物流體冷卻凝固，形成聚合物三維骨架；
[0015](2)蛋白質(zhì)水溶液的配制:將蛋白質(zhì)固體溶于去離子水中，經(jīng)過(guò)攪拌至完全溶解，得到蛋白質(zhì)水溶液；
[0016](3)冷凍干燥:將打印成型的聚合物骨架放置于模具中，將蛋白質(zhì)水溶液注入模具，將聚合物骨架完全浸沒(méi)，然后將模具置于-80°C冷凍，進(jìn)行冷凍干燥處理；
[0017](4)交聯(lián):利用交聯(lián)劑交聯(lián)蛋白質(zhì)使其不溶于水，交聯(lián)之后用去離子水洗滌去除交聯(lián)劑，再次冷凍干燥，即得。
[0018]所述步驟(1)中的針頭內(nèi)徑為0.3-1.0毫米，聚合物擠出速率為0.02-0.10毫米/秒，接受平板移動(dòng)速率為0.01-0.1毫米/秒，聚合物流體的直徑為0.3-0.6毫米，聚合物流體間距為0.1-20毫米，聚合物三維骨架的層高為0.2-0.5毫米，聚合物三維骨架高度> 0.3毫米。
[0019]所述步驟(2)中的蛋白質(zhì)水溶液的濃度為0.5-20毫克/毫升。
[0020]所述步驟(4)中的交聯(lián)劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺EDC/NHS、京尼平、乙醇中的一種或幾種。
[0021]所述步驟(1)中的聚合物中可以選擇性的加入納米羥基磷灰石。具體操作步驟為:將聚合物溶于有機(jī)溶劑形成溶液，加入羥基磷灰石顆粒攪拌均勻，加熱使有機(jī)溶劑蒸發(fā)，冷卻后利用三維打印機(jī)制備聚合物/納米羥基磷灰石骨架。
[0022]有益.效果
[0023]采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明至少有以下有益效果:
[0024](I)本發(fā)明通過(guò)將三維打印技術(shù)與冷凍干燥技術(shù)結(jié)合在一起該支架的聚合物骨架能夠?yàn)楣墙M織再生提供必需的力學(xué)支撐，而蛋白質(zhì)材料形成的微孔結(jié)構(gòu)能夠?yàn)楣墙M織細(xì)胞提供有利的生長(zhǎng)環(huán)境，有利于骨組織的修復(fù)和再生；
[0025](2)三維打印技術(shù)可以依照骨缺損部位的形狀定制相應(yīng)的聚合物骨架，聚合物骨架具有優(yōu)良的機(jī)械性能，蛋白質(zhì)水溶液注入聚合物骨架經(jīng)冷凍干燥可以形成填充聚合物骨架大孔的微孔結(jié)構(gòu)，能夠在成分上仿生天然骨。
[0026] (3)蛋白質(zhì)微孔大小可控、取向可控，且微孔相互連通能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖與遷移，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送和代謝廢物的移除。
[0027](4)本發(fā)明還引入無(wú)機(jī)納米顆粒、藥物、生長(zhǎng)因子等生物活性材料，可進(jìn)一步改善三維支架材料的生物相容性，促進(jìn)骨組織的再生。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1是一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料的制備流程圖；
[0029]圖2是實(shí)施例1中PCL骨架的照片；
[0030]圖3是實(shí)施例1中PCL骨架的SEM圖像；
[0031]圖4是實(shí)施例1中PCL/再生絲素復(fù)合三維支架材料的照片；
[0032]圖5是實(shí)施例1中PCL/再生絲素復(fù)合三維支架材料的SEM圖片；
[0033]圖6是實(shí)施例1中PCL/再生絲素復(fù)合三維支架材料上細(xì)胞形態(tài)(PCL部分)。
[0034]圖7是實(shí)施例1中PCL/再生絲素復(fù)合三維支架材料上細(xì)胞形態(tài)(絲素部分)。
[0035]圖8是實(shí)施例1中PCL/再生絲素復(fù)合三維支架與純絲素凍干支架的力學(xué)性能對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0037]實(shí)施例1
[0038](a)聚己內(nèi)酯(?(^，分子量65，000)加熱到60攝氏度，由內(nèi)徑為0.4毫米針頭擠出，形成0.4毫米PCL流體，接受平板移動(dòng)速度為0.05毫米/秒，聚合物擠出速率為0.05毫米/秒，流體間距為0.5毫米，層與層之間垂直排列，層高0.3毫米，層數(shù)為7層，形成圓柱體PCL骨架，直徑為20毫米(圖2，圖3)。
[0039](b)將I克桑蠶絲再生絲素固體溶于50毫升去離子水中，攪拌使其完全溶解，得到質(zhì)量體積百分比為2%的絲素溶液。
[0040](c)將PCL骨架放置于塑料模具中，并注入配置好的絲素溶液，使其完全浸潤(rùn)并沒(méi)過(guò)PCL骨架。將模具置于-80攝氏度冰箱中冷凍12小時(shí)，隨后于冷凍干燥機(jī)中(-60攝氏度)凍干處理2天，得到孔徑為100-150 μ m的多孔結(jié)構(gòu)。
[0041](d)配制95%的乙醇水溶液，將凍干好的樣品浸入乙醇水溶液中，交聯(lián)處理4小時(shí)。其后，用去離子水洗滌支架三遍，并再次冷凍干燥，得到用于骨組織修復(fù)的PCL/再生絲素復(fù)合支架材料(圖4，圖5)。
[0042]在此支架上培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，三天后可觀測(cè)到細(xì)胞在支架上呈現(xiàn)出良好的細(xì)胞形態(tài)。如圖6、圖7所示。
[0043]實(shí)施例2
[0044](a) PCL加熱到60攝氏度，由內(nèi)徑為0.4毫米的針頭擠出，形成0.4毫米PCL流體，接受平板移動(dòng)速度為0.05毫米/秒，聚合物擠出速率為0.05毫米/秒，流體間距為0.5毫米，層與層之間垂直排列，層高0.3毫米，層數(shù)為7層，得到圓柱體PCL骨架，直徑為14毫米。
[0045](b)將I克明膠(A型豬皮明膠)與I克桑蠶絲再生絲素溶于50毫升去離子水中，加熱至60攝氏度攪拌使明膠與絲素完全溶解，得到質(zhì)量體積百分比為4%的明膠/絲素(I: D水溶液。
[0046](c)將PCL骨架放置于塑料模具中，并注入配置好的絲素溶液，使其完全浸潤(rùn)并沒(méi)過(guò)PCL骨架。將模具置于-80攝氏度冰箱中冷凍12小時(shí)，隨后于冷凍干燥機(jī)中(-60攝氏度)凍干處理2天。
[0047](d)配制95%的乙醇水溶液，加入EDC和NHS使得兩者的濃度皆為0.15摩爾/升。將凍干好的樣品浸入含EDC/NHS的乙醇水溶液中，隨后放置于4攝氏度冰箱冷藏交聯(lián)，交聯(lián)時(shí)間為18小時(shí)。用去離子水洗滌支架三遍，并再次冷凍干燥，得到用于骨組織修復(fù)的明膠/再生絲素和PCL復(fù)合支架材料。
[0048]實(shí)施例3
[0049](a)將3克PCL加入到30毫升三氟乙醇中，攪拌使其溶解，溶解完全后加入1.5克納米羥基磷灰石顆粒，繼續(xù)攪拌并超聲使羥基磷灰石均勻分散。配好的PCL/納米羥基磷灰石溶液倒入金屬容器中，加熱使三氟乙醇迅速揮發(fā)并全部去除，得到PCL和納米羥基磷灰石質(zhì)量比例為2/1的混 合物。將此混合物加熱到60攝氏度，有內(nèi)徑為0.5毫米的針頭擠出，形成0.5毫米PCL流體，接受平板移動(dòng)速度為0.05毫米/秒，聚合物擠出速率為0.05毫米/秒，流體間距為0.5毫米，層與層之間60度排列，層高0.4毫米，層數(shù)為9層，得到圓柱體PCL骨架，直徑為20毫米。
[0050](b)將0.4克膠原(I型豬皮膠原)加入到20毫升去離子水中，攪拌使其完全溶解，得到質(zhì)量體積百分比為2%的膠原水溶液。再加入0.4克納米羥基磷灰石顆粒，攪拌并超聲，使納米羥基磷灰石顆粒均勻分散，得到膠原/納米羥基磷灰石質(zhì)量比為1:1的均勻水溶液。
[0051](c)將PCL/納米羥基磷灰石骨架放置于塑料模具中，并注入配置好的膠原/納米羥基磷灰石溶液，使其完全浸潤(rùn)并沒(méi)過(guò)骨架。將模具置于-80攝氏度冰箱中冷凍12小時(shí)，隨后于冷凍干燥機(jī)中(-60攝氏度)凍干處理2天。
[0052](d)配制95%的乙醇水溶液，加入EDC和NHS使得兩者的最終濃度皆為0.15摩爾/升。將凍干好的樣品浸入含EDC/NHS的乙醇水溶液中，隨后放置于4攝氏度冰箱冷藏交聯(lián)，交聯(lián)時(shí)間為12小時(shí)。用去離子水洗滌支架三遍，并再次冷凍干燥，得到用于骨組織修復(fù)的膠原/納米羥基磷灰石和PCL復(fù)合支架材料。
【權(quán)利要求】
1.一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料，其特征在于:由具有相互貫通的大孔結(jié)構(gòu)的三維打印聚合物骨架和作為填充材料且具有微孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)材料組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料，其特征在于:所述大孔結(jié)構(gòu)孔徑為0.1-20毫米；所述微孔結(jié)構(gòu)孔徑為0.05-0.6毫米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料，其特征在于:所述聚合物是聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚氨酯中的一種或幾種；所述蛋白質(zhì)是明膠、再生絲素、膠原中的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料，其特征在于:所述聚合物骨架與納米羥基磷灰石形成聚合物/納米羥基磷灰石骨架，納米羥基磷灰石的質(zhì)量百分比為10% -60% ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料，其特征在于:所述蛋白質(zhì)中包含活性物質(zhì)；其中，活性物質(zhì)為藥物、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)納米顆粒中的一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料，其特征在于:所述藥物是抗菌類藥物、抗炎癥類藥物、抗癌癥類藥物中的一種或幾種；生長(zhǎng)因子是骨形態(tài)發(fā)生蛋白或者轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；無(wú)機(jī)納米顆粒為納米羥基磷灰石或納米生物玻璃顆粒，無(wú)機(jī)納米顆粒直徑為30-200納米，無(wú)機(jī)納米顆粒與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1: 0.5-10。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料，其特征在于:所述聚合物骨架外觀形狀為立方體、圓柱體、長(zhǎng)方體、截面為異形多邊形或圓環(huán)的柱體中的一種。
8.一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料的制備方法，其包括下述步驟: (1)將聚合物加熱使其熔融，利用三維打印機(jī)擠出，擠出的聚合物流體冷卻凝固，形成聚合物三維骨架； (2)將蛋白質(zhì)固體溶于去離子水中，經(jīng)過(guò)攪拌至完全溶解，得到蛋白質(zhì)水溶液； (3)將打印成型的聚合物骨架放置于模具中，將蛋白質(zhì)水溶液注入模具，將聚合物骨架完全浸沒(méi)，然后將模具置于-80°C冷凍，進(jìn)行冷凍干燥處理； (4)利用交聯(lián)劑交聯(lián)蛋白質(zhì)使其不溶于水，交聯(lián)之后用去離子水洗滌去除交聯(lián)劑，再次冷凍干燥，即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中的針頭內(nèi)徑為0.3-1.0毫米，聚合物擠出速率為0.02-0.10毫米/秒，接受平板移動(dòng)速率為0.01-0.1毫米/秒，聚合物流體的直徑為0.3-0.6毫米，聚合物流體間距為0.1-20毫米，聚合物三維骨架的層高為0.2-0.5毫米，聚合物三維骨架高度> 0.3毫米。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中的蛋白質(zhì)水溶液的濃度為0.5-20毫克/毫升。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種用于骨組織修復(fù)的三維支架材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中的交聯(lián)劑為EDC/NHS、京尼平、乙醇中的一種或幾種。
【文檔編號(hào)】A61L27/56GK103990182SQ201410236085
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】莫秀梅, 李大偉, 許杜亮, 柯勤飛 申請(qǐng)人:東華大學(xué)