用于治療2型糖尿病的長(zhǎng)效腸激素多肽類(lèi)似物及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于治療2型糖尿病的長(zhǎng)效腸激素多肽類(lèi)似物及應(yīng)用，而提供一種半衰期較長(zhǎng)的GLP-1的類(lèi)似物及其應(yīng)用。該GLP-1類(lèi)似物具有下列通式A：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLX27KX29RX31n1YCZ，上述通式A中，X27為纈氨酸或半胱氨酸，X29為甘氨酸或半胱氨酸，X31甘氨酸或半胱氨酸，并且X27、X29和X31中至少有一個(gè)為半胱氨酸；n1X1表示有n1個(gè)Y，n1＝1-10，且Y為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸；Z表示氨基飽和脂肪酸；所述通式A中含有的兩個(gè)半胱氨酸均形成二硫鍵。本發(fā)明的GLP-1類(lèi)似物能夠有效增加GLP-1的血液半衰期，克服其因?yàn)榘胨テ诙潭鵁o(wú)法在臨床上使用的現(xiàn)狀，在糖尿病、肥胖癥治療藥物領(lǐng)域具有應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于治療2型糖尿病的長(zhǎng)效腸激素多肽類(lèi)似物及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種GLP-1類(lèi)似物及其在制備糖尿病、肥胖癥和/或糖尿病、肥胖癥相關(guān)疾病以及預(yù)防肥胖癥的藥物中藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]本發(fā)明涉及的GLP-1 (glucagon-1 ikepeptide-Ι,以下簡(jiǎn)稱(chēng):GLP_1)是主要由小腸L細(xì)胞分泌的一種37個(gè)氨基酸組成的多肽，其活性形式為GLP-1 (7-37) OH和GLP-1 (7-36)NH2 (Mojsov S，J Clin Invest.1987Feb ；79(2):616-9)。GLP-1 明顯減低人用餐后的血糖，能刺激胰島素的產(chǎn)生，同時(shí)還能起到一定減肥效應(yīng)，并且不會(huì)引起低血糖癥(Drucker DJ, Diabetes.1998Feb ；47 (2): 159-69)。近期研究還表明 GLP-1 有胰腺再生作用(Drucker DJ, 2003Dec ; 144 (12):5145-8)。此外，因?yàn)镚LP-1為完全人源化多肽，作為臨床藥物在安全上具有較大優(yōu)勢(shì)。然而，GLP-1 (7-37)的血清半衰期僅僅為3-5分鐘，每天多次注射給藥在臨床使用中非常不方便。
[0003]目前已經(jīng)有不少研究采用GLP-1類(lèi)似物融合蛋白技術(shù)解決GLP-1類(lèi)似物在體內(nèi)的存留時(shí)間，然而，現(xiàn) 有的技術(shù)與臨床理想的目標(biāo)還有很大距離，普遍都還沒(méi)有達(dá)到臨床標(biāo)準(zhǔn)，最近Novo Norisk生產(chǎn)的利拉魯肽為GLP-1類(lèi)似物，其對(duì)GLP-1進(jìn)行了棕櫚酸的修飾，并于2009年于美國(guó)上市。但是利拉魯肽也存在半衰期短的問(wèn)題，其劑型仍需每日注射。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，而提供一種半衰期較長(zhǎng)的GLP-1的類(lèi)似物。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種GLP-1類(lèi)似物的應(yīng)用。
[0006]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是:
[0007](I)GLP-1 類(lèi)似物:
[0008]本發(fā)明的GLP-1類(lèi)似物具有下列通式A:
[0009]HAEGTFTsDvssYLEGQAAKEFlAffLX27KX29RX31Ii1YCZ,
[0010]上述通式A中，X27為纈氨酸或半胱氨酸，X29為甘氨酸或半胱氨酸，X31甘氨酸或半胱氨酸，并且x27、x29和X31中至少有一個(gè)為半胱氨酸^1X1表示有Ii1個(gè)Y，Ii1 = 1-10，且Y為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸；Z表示氨基飽和脂肪酸；所述通式A中含有的兩個(gè)半胱氨酸均形成二硫鍵。
[0011 ] 所述通式A中，優(yōu)選II1 = 1-5，且Y為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸；Z優(yōu)選為氨基丁酸、氨基戊酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基辛酸、氨基壬酸以及氨基癸酸中的任一種。
[0012]所述具有通式A的GLP-1類(lèi)似物如:
[0013]SEQ ID NOl:HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLCKGRGGCZ ；
[0014]SEQ ID N02: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK EFIAffLVKCRGAACZ ；
[0015]SEQ ID N03:HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRCVVVVVC Z。[0016](2) GLP-1類(lèi)似物的應(yīng)用:
[0017]上述的GLP-1類(lèi)似物在制備治療糖尿病、肥胖癥和/或糖尿病、肥胖癥相關(guān)疾病以及預(yù)防肥胖癥的藥物中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明的GLP-1類(lèi)似物可以用在制備糖尿病治療藥物方面。具體地，本發(fā)明的組合物可以靜脈、肌肉或皮下注射劑形式給藥。雖然劑量依治療對(duì)象、給藥方式、癥狀及其它因素而改變，本發(fā)明的GLP-1類(lèi)似物在相當(dāng)寬的劑量范圍內(nèi)是有效的。在成人的治療中，劑量范圍在5 μ g/人一Img/人，每日一次或每幾日一次給藥。實(shí)際劑量應(yīng)該由醫(yī)生根據(jù)有關(guān)的情況來(lái)決定，這些情況包括被治療者的身體狀態(tài)、給藥途徑、年齡、體重、患者對(duì)藥物的個(gè)體反應(yīng)，患者癥狀的嚴(yán)重程度等等，因此上述劑量范圍并不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0019](3)含有GLP-1的藥物組合物:
[0020]本發(fā)明的含有上述GLP-1類(lèi)似物的藥物組合物，包括上述的GLP-1類(lèi)似物和一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。這些輔料包括:水溶性填充劑、PH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、注射用水、滲透壓調(diào)節(jié)劑等等。
[0021]本發(fā)明所述的水溶性填充劑輔料為選自以下的一種或多種:甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等。
[0022]PH調(diào)節(jié)劑為選自以下的一種或多種:枸櫞酸、磷酸、乳酸、酒石酸、鹽酸等非揮發(fā)性的酸以及氫氧化鉀、氫氧化鈉或氫氧化鉀或氫氧化銨、碳酸鈉或碳酸鉀或碳酸銨鹽、碳酸氫鈉或碳酸氫鉀或碳酸氫銨鹽等生理可接受的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸和堿及鹽等。
[0023] 穩(wěn)定劑為選自以下的一種或多種:EDTA_2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸鈉或三羥甲基氨基甲烷等。優(yōu)選焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、精氨酸、聚乙二醇6000、三羥甲基氨基甲烷。
[0024]滲透壓調(diào)節(jié)劑是氯化鈉、氯化鉀中的一種或兩種的組合。
[0025]本發(fā)明的藥用組合物可以通過(guò)肌肉、靜脈內(nèi)、皮下注射等途經(jīng)進(jìn)行給藥，本發(fā)明的藥物組合物的劑型優(yōu)選注射劑，如凍干粉針或溶液注射劑。
[0026]冷凍干燥制備凍干粉注射劑的制備方法:取上述GLP-1類(lèi)似物溶液適量，加入水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等，加入注射用水適量，調(diào)節(jié)PH值至4-8使其溶解，加水稀釋至適當(dāng)濃度，加入0.1-0.5%活性炭，在O — 10°C下攪拌10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過(guò)濾除菌，濾液進(jìn)行分裝，采用冷凍干燥法，制得白色疏松塊狀物，封口即得，每個(gè)規(guī)格含有GLP-1類(lèi)似物在5 μ g-lmg。
[0027]溶液注射劑的制備方法:取上述GLP-1類(lèi)似物溶液或凍干粉適量，加入水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等，加入注射用水適量，調(diào)節(jié)PH值至4-8使其溶解，加水稀釋至適當(dāng)濃度，加入0.1-0.5%活性炭，在O — 10°C下攪拌10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過(guò)濾除菌，濾液進(jìn)行分裝，封口即得，每個(gè)規(guī)格含有GLP-1類(lèi)似物在5 μ g-lmg。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0029]本發(fā)明的GLP-1類(lèi)似物克服了 GLP-1半衰期短的問(wèn)題，所提供的GLP-1類(lèi)似物在體內(nèi)的半衰期可達(dá)到72~96小時(shí)以上，較單獨(dú)給藥的GLP-1的半衰期(半衰期僅為3_5分鐘)明顯延長(zhǎng)，極大地便利了其臨床推廣和應(yīng)用?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1所示為通式A的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0031]圖2所示為實(shí)施例2中含GLP-1類(lèi)似物(SEQ ID NOl-3)的降血糖實(shí)驗(yàn)；
[0032]圖3所示為實(shí)施例3中GLP-1類(lèi)似物在人血清中的穩(wěn)定性的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0034]本發(fā)明的GLP-1類(lèi)似物具有下列通式A:
[0035]HAEGTFTsDvssYLEGQAAKEFlAffLX27KX29RX31Ii1YCZ,
[0036]上述通式A中，X27纈氨酸或半胱氨酸，X29為甘氨酸或半胱氨酸，X31甘氨酸或半胱氨酸，并且&7、&9和X31中至少有一個(gè)為半胱氨酸^1Y表示有II1AYa1 = 1-10，且Y為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸；z表示氨基飽和脂肪酸；所述通式A中含有的兩個(gè)半胱氨酸均形成二硫鍵。
[0037]圖1所示為本發(fā)明涉及的GLP-1類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)示意圖，其中鏈狀結(jié)構(gòu)為GLP-1分子，字母C為半胱氨酸縮寫(xiě)并形成二硫鍵，(CH2)n2COOH指代含有不同碳鏈長(zhǎng)度的氨基飽和脂肪酸，C-末端偶聯(lián)氨基飽和脂肪酸，n2 = 4-10。
[0038]其中，HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGRG為人源 GLP-1 序列，上述通式 A 中的GLP-1類(lèi)似物為人工序列，分別并僅在第27、29或31位氨基酸上進(jìn)行了修飾，由半胱氨酸取代了原有的氨基酸。并且在上述的氨基酸通式中Y可為Gly，Ala或Val,且叫二卜川。
[0039]實(shí)施例1:多肽的固相合成
[0040]使用Fmoc策略的固相多肽合成方法，使用CSB1公司生產(chǎn)的CS336X型儀器進(jìn)行本發(fā)明的多肽的合成。合成的方法按照生產(chǎn)商的儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。本文所述的“Fmoc策略”是指以聚合物樹(shù)脂作為固相反應(yīng)基質(zhì)，將氨基端Fmoc保護(hù)的氨基酸在偶聯(lián)試劑的存在下依次縮合，從而合成多肽的合成方法。其具體方法參見(jiàn)Fmoc solid phase peptidesynthesis:a practical approach, 2000，Oxford University Press。
[0041]將制得的多肽使用HPLC C18半制備柱進(jìn)行純化，流動(dòng)相為乙腈。經(jīng)脫鹽及冷凍干燥得到多肽凍干粉。本發(fā)明專(zhuān)利中包含的多肽均含有二硫鍵，碳酸氫銨或其他氧化劑用來(lái)形成多妝中的二硫鍵。
[0042]實(shí)施例2 =GLP-1類(lèi)似物的降血糖功能
[0043]本實(shí)施例中，采用的多肽如下:
[0044]SEQ ID N04: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLCKGRGGC—氨基己酸；
[0045]SEQ ID N05: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK EFIAWLVKCRGAAC—氨基辛酸；
[0046]SEQ ID N06: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRCVVVVVC—氨基癸酸
[0047]將上述多肽各Img溶于Iml生理鹽水制成多肽溶液，將此多肽溶液皮下注射于小鼠(200 μ I/只，6只/組，購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，給藥30分鐘后將400微克葡萄糖注射于每只小鼠。分別于葡萄糖注射后2小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)及96小時(shí)測(cè)定小鼠的血糖(注:每次測(cè)血糖前兩個(gè)小時(shí)再次給相同劑量的葡萄糖)，結(jié)果如圖2所示，其中本實(shí)施例中的對(duì)照(空白)為向小鼠皮下注射生理鹽水，用量lml，葡萄糖的注射與其他試驗(yàn)組相同。
[0048]圖2所示的GLP-1類(lèi)似物的糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SEQ ID No4, SEQ ID No5以及SEQID No6具有良好的長(zhǎng)效血糖調(diào)控能力。
[0049]實(shí)施例3 =GLP-1類(lèi)似物在人血清中的穩(wěn)定性測(cè)定
[0050]本實(shí)施例中，采用的多肽如下:
[0051 ] SEQ ID N04: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLCKGRGGC—氨基己酸；
[0052]SEQ ID N05: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK EFIAWLVKCRGAAC—氨基辛酸；
[0053]SEQ ID N06: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRCVVVVVC—氨基癸酸
[0054](I)制備血清:用真空采血針(BD B1sciences, Franklin Lakes, NJ)取志愿者血樣三份，而后立即于離心機(jī)上13，OOOrpm離心20分鐘，取上層血清備用。
[0055](2)將上述三條多肽及GLP-1標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自上海生工公司，其序列為:HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG)各0.1mg溶于0.5ml生理鹽水中，充分溶解后分別加入到Iml大鼠血清中(購(gòu)自Invitrogen公司)，將血清標(biāo)記為空白組、Nol實(shí)驗(yàn)組(0.1mg序列為SEQ ID No4的肽溶于0.5ml血清中),No2實(shí)驗(yàn)組(0.1mg序列為SEQ ID No5的肽溶于0.5ml血清中)和No3實(shí)驗(yàn)組(0.1mg序列為SEQ ID No6的肽溶于0.5ml血清中)。于37°C孵育0，0.1,0.3，2.5，5，10，15及24h后，分別取50 μ I血清混合物，用GLP-1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自A LPCO Immunoassays)對(duì)各組血清進(jìn)行檢測(cè)，于SpectraMax M5酶標(biāo)儀上讀取吸光值，算出不同血清樣品中GLP-1類(lèi)似物在不同時(shí)間點(diǎn)的濃度，結(jié)果如圖3所示。其中圓圈代表空白組，倒三角代表Nol實(shí)驗(yàn)組,正三角代表No2實(shí)驗(yàn)組,方形代表No3實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果表明SEQ ID No4, SEQ ID No5及SEQ ID No6的半衰期>24h，結(jié)果證實(shí)GLP-1長(zhǎng)效類(lèi)似物大大延長(zhǎng)了人血清的穩(wěn)定性。
[0056]實(shí)施例4:冷凍干燥制備凍干粉注射劑的制備方法:
[0057]取GLP-1類(lèi)似物制成溶液適量，加入水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等，加入注射用水適量，調(diào)節(jié)PH值至4-8使其溶解，加水稀釋至適當(dāng)濃度，加入0.1-0.5%活性炭，在O — 10°C下攪拌10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過(guò)濾除菌，濾液進(jìn)行分裝，采用冷凍干燥法，制得白色疏松塊狀物，封口即得，每個(gè)規(guī)格含有GLP-1類(lèi)似物在5 μ g-lmg。
[0058]實(shí)施例5溶液注射劑的制備方法:
[0059]取GLP-1類(lèi)似物溶液或凍干粉適量，加入水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等，加入注射用水適量，調(diào)節(jié)PH值至4-8使其溶解，加水稀釋至適當(dāng)濃度，加入0.1-0.5%活性炭，在O — 10°C下攪拌10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過(guò)濾除菌，濾液進(jìn)行分裝，封口即得，每個(gè)規(guī)格含有GLP-1類(lèi)似物在5 μ g-lmg。
[0060]本發(fā)明的GLP-1類(lèi)似物能夠有效增加GLP-1的血液半衰期，克服其因?yàn)榘胨テ诙?br> 而無(wú)法在臨床上使用的現(xiàn)狀，在糖尿病、肥胖癥治療藥物領(lǐng)域具有應(yīng)用前景。
[0061]
【權(quán)利要求】
1.一種GLP-1類(lèi)似物，其特征在于，具有下列通式A:
HAEGTFTsDvssYLEGQAAKEFlAffLX27KX29RX31Ii1YCZ, 上述通式A中，X27為纈氨酸或半胱氨酸，X29為甘氨酸或半胱氨酸，X31甘氨酸或半胱氨酸，并且X33> X35和X37中至少有一個(gè)為半胱氨酸^1X1表示有H1個(gè)Y，Ii1 = 1-10，且Y為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸；Z表示氨基飽和脂肪酸；所述通式A中含有的兩個(gè)半胱氨酸均形成 硫鍵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GLP-1類(lèi)似物，其特征在于，所述通式A中，Ii1= 1-5，Y為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸。Z為氨基丁酸、氨基戊酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基辛酸、氨基壬酸以及氨基癸酸中的任一種。
3.—種權(quán)利要求1或2所述的GLP-1類(lèi)似物在制備治療糖尿病、肥胖癥和/或糖尿病、肥胖癥相關(guān)疾病以及預(yù)防肥胖癥的藥物中的應(yīng)用。
4.一種含有權(quán)利要求1或2所述的GLP-1類(lèi)似物的藥物組合物，其特征在于，包括權(quán)利要求I或2中所述的GLP-1類(lèi)似物和一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。
5.一種含有權(quán)利要求1或2所述的GLP-1類(lèi)似物的藥物組合物的制備方法，其特征在于，取權(quán)利要求1或2所述的GLP-1類(lèi)似物制成溶液，加入水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑及注射用水，調(diào)節(jié)PH值至4-8使所述GLP-1溶解，加水稀釋?zhuān)尤?.1-0.5%活性炭，在O — 10°C下攪拌10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過(guò)濾除菌，濾液進(jìn)行分裝，采用冷凍干燥法，制得白色疏松塊狀物，封口即得，每個(gè)規(guī)格含有所述GLP-1類(lèi)似物在5 μ g-lmg。
6.一種含有權(quán)利要求1或2所述的GLP-1類(lèi)似物的藥物組合物的制備方法，其特征在于，取所述GLP-1類(lèi)似物制成溶液，加入水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑以及注射用水，調(diào)節(jié)PH值至4-8使所述GLP-1溶解，加水稀釋?zhuān)偌尤?.1-0.5%活性炭，在O — 10°C下攪拌10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過(guò)濾除菌，濾液進(jìn)行分裝，封口即得，每個(gè)規(guī)格含有所述GLP-1類(lèi)似物在5 μ g-lmg。
【文檔編號(hào)】A61P3/10GK104031141SQ201410243272
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】李瑛 , 高井珍, 伊原 申請(qǐng)人:李瑛