棲土曲霉蛋白酶在制備傷口清創(chuàng)、促進(jìn)傷口愈合的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種棲土曲霉蛋白酶在制備傷口清創(chuàng)、促進(jìn)傷口愈合的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明由棲土曲霉獲得的能夠?qū)o活力組織進(jìn)行傷口清創(chuàng)的蛋白酶，清創(chuàng)能力強(qiáng)、副作用小，并且制備工藝簡單、產(chǎn)量高。
【專利說明】棲土曲霉蛋白酶在制備傷口清創(chuàng)、促進(jìn)傷口愈合的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種棲土曲霉蛋白酶在制備傷口清創(chuàng)、促進(jìn)傷口愈合的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]壓瘡、糖尿病足、燒傷及慢性傷口內(nèi)存在很多失活組織。失活組織是機(jī)會性感染的優(yōu)良培養(yǎng)基，會阻礙傷口的愈合。因此有效的清創(chuàng)是必要的。目前臨床上最常用的清創(chuàng)方式仍是手術(shù)清創(chuàng)。除此之外，還有采用蛋白水解酶的酶清創(chuàng)。酶清創(chuàng)可以將壞死或失活的組織分解清除，同時又不損害鄰近正常組織，從而達(dá)到清創(chuàng)目的。己有描述將枯草菌蛋白酶、膠原酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶及鏈激酶作為清創(chuàng)劑。但這些清創(chuàng)酶各有優(yōu)缺點(diǎn)，并且早期清創(chuàng)效果尚未能完全令人滿意。
[0003]己發(fā)現(xiàn)棲土曲霉能夠廣生水解能力很強(qiáng)的棲土曲霉中性蛋白酶。但把棲土曲霉蛋白酶作為傷口清創(chuàng)酶并未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種清創(chuàng)能力強(qiáng)、副作用小，并且制備工藝簡單、產(chǎn)量高的棲土曲霉蛋白酶在制 備傷口清創(chuàng)、促進(jìn)傷口愈合的藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
[0006]一種棲土曲霉蛋白酶在制備傷口清創(chuàng)、促進(jìn)傷口愈合的藥物中的應(yīng)用。
[0007]所述傷口為燒傷傷口、壓瘡傷口、慢性感染傷口或糖尿病足傷口。
[0008]所述棲土曲霉蛋白酶由下列步驟制得:
[0009](I)培養(yǎng)基的制備
[0010]發(fā)酵培養(yǎng)基配比為:麩皮3%、米糠1%、玉米粉1%、KH2PO40.4%，加水至100%，并于120°C下高溫滅菌30分鐘；
[0011](2)粗酶液的制備液
[0012]將棲土曲霉3.942菌種按培養(yǎng)基8%的重量接種后，在250r/min振蕩器中30°C下培養(yǎng)72小時；終止培養(yǎng)后，將發(fā)酵培養(yǎng)物于離心機(jī)中3000r/min離心10分鐘，取上清液即為粗酶液；
[0013](3)棲土曲霉蛋白酶的分離
[0014]粗酶液過濾，濾液調(diào)節(jié)pH至7.0，加入20%濃度的單寧酸，邊加邊攪拌；單寧酸用量為粗酶液重量的1% ;待沉淀完全后離心，收集沉淀；沉淀用pH7.2,0.02M磷酸緩沖液溶解；使用聚乙二醇洗脫單寧酸，在攪拌下加入10%濃度的PEG，使PEG與單寧酸之比值達(dá)到3: lml/g ;離心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，靜置過夜，離心，收集沉淀；沉淀再浸泡于冷丙酮，靜置過夜，然后過濾，沉淀用乙醚再洗滌一次，干燥即得棲土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制劑；[0015](4)棲土曲霉蛋白酶的純化
[0016]上述丙酮粉粗酶用pH8.4,0.05Μ Tris -HCL 緩沖液溶解，上 DEAE -Sephadex A -25柱，然后用平衡緩沖液洗滌；層析共分離出7個峰，酶活力存在于Ρ2峰內(nèi)；收集Ρ2峰，對水于低溫下透析至無鹽止，再用PEG脫水濃縮后，冷凍干燥。
[0017](5)蛋白酶活力的測定
[0018]采用福林酚法測定蛋白酶活力。酶活定義為在40°C，適當(dāng)?shù)腜H條件下，I分鐘內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生I微克酪氨酸所需的酶量為I個蛋白酶活力單位。測得棲土曲霉蛋白酶冷干粉的酶活力為1.1xio5u/g。
[0019]本發(fā)明由棲土曲霉獲得的能夠?qū)o活力組織進(jìn)行傷口清創(chuàng)的蛋白酶，清創(chuàng)能力強(qiáng)、副作用小，并且制備工藝簡單、產(chǎn)量高。
[0020]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
【具體實施方式】
[0021]棲土曲霉 蛋白酶的制備
[0022](I)培養(yǎng)基的制備
[0023]發(fā)酵培養(yǎng)基配比為:麩皮3%、米糠I %、玉米粉HKH2PO40.4%，加水至100%并于120°C下高溫滅菌30分鐘。
[0024](2)粗酶液的制備液
[0025]將棲土曲霉3.942菌種按培養(yǎng)基8%的重量接種后，在250r/min振蕩器中30°C下培養(yǎng)72小時。終止培養(yǎng)后，將發(fā)酵培養(yǎng)物于離心機(jī)中3000r/min離心10分鐘，取上清液即為粗酶液。
[0026](3)棲土曲霉蛋白酶的分離
[0027]粗酶液過濾，濾液調(diào)節(jié)pH至7.0。加入20%質(zhì)量濃度的單寧酸，邊加邊攪拌。單寧酸用量為粗酶液重量的I %。待沉淀完全后離心，收集沉淀。沉淀用pH7.2,0.02M磷酸緩沖液溶解。使用聚乙二醇(PEG)洗脫單寧酸。在攪拌下加入10%質(zhì)量濃度的PEG，使PEG (ml)與單寧酸(g)之比值達(dá)到3:1。離心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，靜置過夜，離心，收集沉淀。沉淀再浸泡于冷丙酮，靜置過夜，然后過濾，沉淀用乙醚再洗滌一次，干燥即得棲土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制劑。
[0028](4)棲土曲霉蛋白酶的純化
[0029]上述丙酮粉粗酶用少量pH8.4,0.05Μ Tris - HCL緩沖液溶解，上DEAE - SephadexA-25柱，然后用平衡緩沖液洗滌。層析共分離出7個峰，酶活力存在于Ρ2峰內(nèi)。收集Ρ2峰，對水于低溫下透析至無鹽止，再用PEG脫水濃縮后，冷凍干燥。
[0030](5)蛋白酶活力的測定
[0031]采用福林酚法測定蛋白酶活力。酶活定義為在40°C，適當(dāng)?shù)腜H條件下，I分鐘內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生I微克酪氨酸所需的酶量為I個蛋白酶活力單位。測得棲土曲霉蛋白酶冷干粉的酶活力為1.lX105U/g。
[0032]實施例1:燒傷組織體外酶清創(chuàng)效果
[0033]將豬耳皮片燒傷并將其經(jīng)受棲土曲霉蛋白酶蛋白水解作用，監(jiān)測由棲土曲霉蛋白酶對組織的裂解時間。根據(jù)如下方法進(jìn)行分析:通過將皮膚與軟骨分離并去除多余脂肪制備豬耳皮膚。煮沸豬耳皮片(約直徑lcm) 20分鐘模擬燒傷皮膚。將0.1g棲土曲霉蛋白酶粉與水相5ml混合，調(diào)節(jié)PH為7.0,并使用裝配有塑料管的注射器或吸量管將其應(yīng)用于細(xì)胞底部。在37°C的環(huán)境下孵育，檢測豬耳皮膚的裂解時間。結(jié)果顯示棲土曲霉蛋白酶于63.2±10.2分鐘內(nèi)對燒傷的豬耳皮膚進(jìn)行了清創(chuàng)。結(jié)果詳見表1。
[0034]表1:棲土曲霉蛋白酶的燒傷組織體外清創(chuàng)活性
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種棲土曲霉蛋白酶在制備傷口清創(chuàng)、促進(jìn)傷口愈合的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棲土曲霉蛋白酶在制備傷口清創(chuàng)、促進(jìn)傷口愈合的藥物中的應(yīng)用，其特征是:所述傷口為燒傷傷口、壓瘡傷口、慢性感染傷口或糖尿病足傷口。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的棲土曲霉蛋白酶在制備傷口清創(chuàng)、促進(jìn)傷口愈合的藥物中的應(yīng)用，其特征是:所述棲土曲霉蛋白酶由下列步驟制得: (1)培養(yǎng)基的制備 發(fā)酵培養(yǎng)基配比為:麩皮3%、米糠1%、玉米粉1%、KH2P04 0.4%，加水至100%，并于120°C下高溫滅菌30分鐘； (2)粗酶液的制備液 將棲土曲霉3.942菌種按培養(yǎng)基8%的重量接種后，在250r/min振蕩器中30°C下培養(yǎng)72小時；終止培養(yǎng)后，將發(fā)酵培養(yǎng)物于離心機(jī)中3000 r/min離心10分鐘，取上清液即為粗酶液； (3)棲土曲霉蛋白酶的分離 粗酶液過濾，濾液調(diào)節(jié)pH至7.0，加入20 %濃度的單寧酸，邊加邊攪拌；單寧酸用量為粗酶液重量的1% ;待沉淀完全后離心，收集沉淀；沉淀用pH 7.2,0.02M磷酸緩沖液溶解；使用聚乙二醇洗脫單寧酸，在攪拌下加入10%濃度的PEG，使PEG與單寧酸之比值達(dá)到3: lml/g ;離心，收集 上清液，加人2倍重量的冷丙酮，靜置過夜，離心，收集沉淀；沉淀再浸泡于冷丙酮，靜置過夜，然后過濾，沉淀用乙醚再洗滌一次，干燥即得棲土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制劑； (4)棲土曲霉蛋白酶的純化 上述丙酮粉粗酶用pH8.4,0.05Μ Tris-HCL緩沖液溶解，上DEAE-S^hadex Α-25柱，然后用平衡緩沖液洗滌；層析共分離出7個峰，酶活力存在于Ρ2峰內(nèi)；收集Ρ2峰，對水于低溫下透析至無鹽止，再用PEG脫水濃縮后，冷凍干燥。
【文檔編號】A61K38/48GK103977398SQ201410243456
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月3日
【發(fā)明者】陳宏林, 朱昌來 申請人:南通大學(xué)