一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法。本發(fā)明針對裸DGKα質粒易被體內的核酸酶、酸和堿等破壞的缺點，利用殼聚糖制備了DGKα基因-殼聚糖納米粒，能有效保護DGKα質粒，增強DGKα質粒在體內的活性，促進DGKα基因在體內更好地發(fā)揮作用。DGKα具有誘導T細胞無能的作用，能誘導免疫耐受。本發(fā)明制備的DGKα基因-殼聚糖納米粒能抑制卵蛋白誘發(fā)的哮喘小鼠的氣道炎癥，降低血清卵蛋白特異性IgE水平，有望應用于哮喘等變態(tài)反應性疾病的治療。
【專利說明】一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法
[0001]本發(fā)明為發(fā)明《一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒在制備治療過敏性哮喘藥物中應用》的分案申請。(原申請文件的申請日:2013年2月19日，原申請文件的申請?zhí)?201310053559.6，原申請文件的名稱:一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒在制備治療過敏性哮喘藥物中應用)
【技術領域】
[0002]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥制劑領域，特別涉及一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法。
【背景技術】
[0003]哮喘是一種慢性氣道變態(tài)反應性炎癥性疾病，CD4+T細胞的過度活化在哮喘的發(fā)病中具有重要作用。CD4+T細胞活化后向Th2細胞分化增多，Th2細胞的過度活化導致了 Th2反應為主的免疫反應，Th2型細胞因子IL (白細胞介素)-4、IL-5和IL-13等分泌增多，最終導致嗜酸性粒細胞等炎癥細胞在氣道聚集，引起氣道變態(tài)反應性炎癥。研究表明，正常人反復接觸過敏原后，過敏原的刺激不會導致抗原特異性T細胞過度活化而始動發(fā)病過程。而哮喘患者，氣道抗原呈遞細胞攝取和提呈過敏原給T細胞后，促使T細胞過度活化和增殖，始動哮喘的發(fā)生。因此免疫耐受機制的缺陷和障礙是哮喘的主要發(fā)病機制。誘導機體對抗原特異性免疫耐受目前已成為防治哮喘的新途徑。
[0004]近年來許多研究發(fā)現(xiàn)，DGK (甘油二酯激酶)在調節(jié)免疫細胞的免疫功能中起重要作用。甘油二酯和磷脂酸是重要第二信使，可直接或者分解為各種信號后參與多種免疫細胞的信號傳導。DGK能使甘油二酯磷酸化生成磷脂酸，調節(jié)甘油二酯和磷酸脂的平衡，在調節(jié)免疫功能中起重要作用。DGK α (甘油二酯激酶α )是DGK的一個亞型，為I型DGK，T細胞聞度表達DGK α。
[0005]T細胞無能是外周免疫耐受主要機制之一。T細胞無能是指T細胞的功能性無反應或者失活。無能T細胞不能分泌IL-2，不能增殖。Zha等[Zha Y，Marks R，Ho Aff,et al.T cell anergy is reversed by active Ras and is regulated by diacylglycerolkinase-a.Nat Immunol.2006 ；7 (11): 1166-1173.]研究組發(fā)現(xiàn)無能 T 細胞過度表達 DGK α，表達量為正常靜息 T 細胞 5 ~10 倍。Sanjuan 等[Sanjuan MA, Jones DR, Izquierdo M，etal.Role of diacylglycerol kinase alpha in the attenuation of receptor signaling.J Cell Biol.2001:153，207-220.Sanjuan MA, Pradet-Balade B，Jones DR, et al.T cellactivation in vivo targets diacylglycerol kinase to the membrane:a novel mechanismfor Ras attenuation.J Immunol，2003，170:2877-2883.]研究發(fā)現(xiàn)轉染 DGKa 基因的 T細胞過度表達DGKa，抑制甘油二酯依賴的T細胞受體(TCR)信號，從而減弱Ras激活信號和抑制ERK磷酸化，抑制了 IL-2啟動子的活性，減弱T細胞活化信號CD69表達，導致T 細胞無能。Olenchock 等[Olenchock BA，Guo R，Carpenter JH, et al.Disruption ofdiacylglycerol metabolism impairs the induction of T cell anergy.Nat Immunol.2006 ；7(11):1174-1181.]研究發(fā)現(xiàn)DGKa缺陷的T細胞在誘導T細胞無能的條件下仍能增殖并分泌IL-2，RAS活性、ERK磷酸化等細胞增殖信號表達增強。因此，DGKa能將甘油二酯磷酸化為磷脂酸，抑制甘油二酯介導的TCR信號活化，抑制T細胞過度活化，誘導T細胞無能，在T細胞免疫耐受中起重要作用。DNA疫苗是治療哮喘的常用方法，DGK α基因的DNA疫苗是否可通過誘導免疫耐受治療哮喘尚不清楚。
[0006]殼聚糖是一種從甲殼類動物提取制備的生物可降解性多糖，是自然界唯一的帶正電荷的堿性氨基陽離子多糖，無毒，無致突性，毒副作用小。殼聚糖溶于弱酸水溶液后具有高粘性且?guī)д?，可與帶負電荷的DNA相互作用形成殼聚糖-DNA納米粒，DNA被封入殼聚糖內，不被體內的酸、堿和核酸酶所破壞，提高DNA生物利用性[Mao HQ, Roy K, Troung-Le VL,et al.Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers:synthesis，characterization andtransfection efficiency.J Control Release.2001 ；70 (3):399-421.]。同時，殼聚糖-DNA納米粒表面帶正電，而機體細胞表面帶負電，殼聚糖納米粒可粘附在細胞表面，從而促使DNA在細胞攝取作用下進入細胞，可以實現(xiàn)安全有效的靶向性基因治療[Lavertu M，M6thotS, Tran-Khanh N, et al.High efficiency gene transfer using chitosan/DNA nanoparticleswith specific combinations of molecular weight and degree of deacetylation.Biomaterials.2006；27(27):4815-4824.]。而且，殼聚糖具有緩釋作用，在體內可以緩慢釋放所包封的DNA或者藥物，殼聚糖本身可以完全降解并代謝，其分解產物和降解產物均對人體健康無害。因此，殼聚糖是一種優(yōu)良的基因載體，可增強DNA疫苗等基因藥物的治療作用。目前尚未見有關DGKa基因-殼聚糖納米粒的制劑的相關報道，以及殼聚糖包裹DGKa基因應用于哮喘治療的報道。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明提供了一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒在制備治療過敏性哮喘藥物中應用以及甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法。
[0008]本發(fā)明提供的技術方案為:
[0009]一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒在制備治療過敏性哮喘藥物中應用，所述甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒作為唯一有效成分在制備治療過敏性哮喘藥物中的應用。
[0010]甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒在制備減輕哮喘氣道炎癥藥物中的應用。
[0011]甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒在制備降低哮喘血清中過敏原特異性IgE和支氣管肺泡灌洗液中白細胞介素-4和白細胞介素-5藥物中的應用。
[0012]一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法，包括:
[0013]步驟1、制備甘油二酯激酶a質粒:全基因合成小鼠白細胞介素-2信號肽序列和小鼠甘油二酯激酶α基因的融合基因，克隆到PEGFP-N3載體而制備得甘油二酯激酶α質粒;
[0014]步驟2、將殼聚糖溶解于I %醋酸水溶液，配制成濃度為0.5~2.5mg/ml的殼聚糖醋酸溶液，用NaOH將其pH值調節(jié)在5.5~5.7之間，無菌膜過濾，其中所述殼聚糖的分子量在2~60萬道爾頓之間，其 脫乙酰度在90%~95%之間，所述無菌膜的孔徑為0.22μπι;
[0015]步驟3、將所述甘油二酯激酶α質粒溶解在濃度為10~25mM的經孔徑為0.22 μ m的無菌膜過濾的無水硫酸鈉溶液中，制備得濃度在100~360 μ g/ml之間的甘油二酯激酶α質粒溶液。其中，步驟2中所述殼聚糖醋酸溶液中的氨基摩爾數與所述甘油二酯激酶α溶液中的磷酸酯基摩爾數之比> 5 ；
[0016]步驟4、所述的甘油二酯激酶α質粒溶液和所述殼聚糖醋酸溶液在溫度在55°C~57°C之間的水浴中加熱10~15min ；
[0017]步驟5、在漩渦震蕩的條件下，按體積比1:1的比例，將經水浴加熱后的所述甘油二酯激酶α溶液緩慢勻速加入到經水浴加熱后的所述殼聚糖醋酸溶液中，旋渦振蕩30~60s，室溫靜置，既得甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒溶液。
[0018]優(yōu)選的是，所述的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法中，所述步驟5中的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒溶液的保存溫度為4°C。
[0019]優(yōu)選的是，所述的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法中，本方法制備得的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒溶液中的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的粒徑在150nm~500nm之間，其中粒徑在150nm~300nm之間的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒占60%以上。
[0020]過敏性哮喘是臨床常見病和多發(fā)病，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，它是一種慢性氣道變態(tài)反應性炎癥性疾病，CD4+T細胞的過度活化在哮喘的發(fā)病中具有重要作用。CD4+T細胞活化后向Th2細胞分化增多，Th2細胞的過度活化導致了 Th2反應為主的免疫反應，Th2型細胞因子IL(白細胞介素)_4、IL-5和IL-13等分泌增多，最終導致嗜酸性粒細胞等炎癥細胞在氣道聚集，引 起氣道變態(tài)反應性炎癥。研究表明，正常人反復接觸過敏原后，過敏原的刺激不會導致抗原特異性T細胞過度活化而始動發(fā)病過程。而哮喘患者，氣道抗原呈遞細胞攝取和提呈過敏原給T細胞后，促使T細胞過度活化和增殖，始動哮喘的發(fā)生。因此，免疫耐受機制的缺陷和障礙是哮喘的主要發(fā)病機制。
[0021]誘導機體對抗原的免疫耐受是目前防治哮喘的新途徑。DGKa (甘油二酯激酶a )具有誘導T細胞無能的作用，能誘導免疫耐受。若將DGKa質粒疫苗注入體內，體內的免疫細胞攝取DGK α質粒并長期表達DGK α蛋白，可能通過誘導機體對變應原的免疫耐受，從而達到治療哮喘的作用。但裸DGKa質粒進入體內后易被組織內的核酸酶、酸和堿等降解，且機體對吸收差，導致其免疫活性顯著降低。構建能有效保護DNA疫苗并能被組織更好吸收的DNA疫苗運載體系是非常重要的。
[0022]本發(fā)明建立一種過敏性哮喘小鼠的模型，此模型驗證了 DGKa基因-殼聚糖納米粒可降低哮喘小鼠的氣道炎癥，為DGKa基因-殼聚糖納米粒可應用于哮喘等變態(tài)反應性疾病的治療提供了有力的實驗1?型。
[0023]本發(fā)明還提供了一種DGK α基因-殼聚糖納米粒的制備方法。該制備方法中采用了殼聚糖作為載體，包裹DGK α，保護了 DGKa在生物體內不被酸、堿和核酸酶所破壞，制備出高活性和高穩(wěn)定性的DGK α基因-殼聚糖納米粒，提高了 DGK α的生物利用性，實現(xiàn)安全有效的靶向性基因治療。其中，目前，采用復凝聚法，根據殼聚糖的陽離子特性與DNA的陰離子特性，將兩者直接結合形成納米粒子。但是多以低濃度殼聚糖(0.05-0.5mg/ml)與低濃度DNA溶液(40-100 μ g/ml)相互作用。本發(fā)明將殼聚糖和DNA溶液濃度均顯著提高，t匕較而言，本發(fā)明顯著提高DGK α基因-殼聚糖納米粒的得率，且尺寸仍在納米級范圍?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0024]圖1為DGK α基因-殼聚糖納米粒的粒徑檢測結果。
[0025]圖2為DGK α基因-殼聚糖納米粒的Zeta電位檢測結果。
[0026]圖3為DGK α基因-殼聚糖納米粒的透射電鏡圖。
[0027]圖4為DGK α基因-殼聚糖納米粒的DNase I的酶解反應結果。
[0028]圖5為過敏性哮喘小鼠的構建流程圖和治療干預流程圖。
[0029]圖6為治療過敏性哮喘小鼠模型中各組支氣管肺泡灌洗液細胞總數計數。
[0030]圖7為治療過敏性哮喘小鼠模型中各組支氣管肺泡灌洗液細胞分類計數。
[0031]圖8為治療過敏性哮喘 小鼠模型中各組支氣管肺泡灌洗液IL-4水平。
[0032]圖9為治療過敏性哮喘小鼠模型中各組支氣管肺泡灌洗液IL-5水平。
[0033]圖10為治療過敏性哮喘小鼠模型中各組血清卵蛋白特異性IgE水平。
[0034]圖11為治療過敏性哮喘小鼠的動物模型中正常組肺組織切片顯微圖(蘇木素-伊紅X 400)。
[0035]圖12為治療過敏性哮喘小鼠模型中哮喘組肺組織切片顯微圖(蘇木素-伊紅 X 400)
[0036]圖13為治療過敏性哮喘小鼠模型中DGKa基因-殼聚糖納米粒干預組肺組織切片顯微圖(蘇木素-伊紅X 400)。
[0037]圖14為治療過敏性哮喘小鼠模型中DGKa基因干預組肺組織切片顯微圖(蘇木素-伊紅X 400)。
[0038]圖15為治療過敏性哮喘小鼠模型中空白PEGFP-N3質粒對照組肺組織切片顯微圖(蘇木素-伊紅X 400)。
[0039]圖16為治療過敏性哮喘小鼠模型中殼聚糖納米粒對照組肺組織切片顯微圖(蘇木素-伊紅X 400)。
【具體實施方式】
[0040]下面結合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
[0041]實施例
[0042]UDGKa (甘油二酯激酶a )基因-殼聚糖納米粒的制備:
[0043]步驟1、全基因合成小鼠IL-2信號肽序列和小鼠DGK α基因的融合基因，克隆到PEGFP-N3載體，即獲得DGK α質粒。經測序證實小鼠IL-2信號肽和小鼠DGK α基因序列均與 GenBank 的 IL-2 (NM_008366.3)和 DGKa 基因(NM_016811.2)完全相符；
[0044]步驟2、將殼聚糖溶解于醋酸濃度為I %的溶液中，制備得濃度為1.5mg/ml的殼聚糖醋酸溶液，將其PH值用氫氧化鈉調節(jié)到5.5，再用孔徑為0.22 μ m的無菌膜過濾殺菌，其中殼聚糖的分子量為10萬道爾頓，脫乙酰度為95% ；
[0045]步驟3、將所述DGK α質粒溶解在IOmM的0.22 μ m的無菌膜過濾的無水硫酸鈉溶液中，制備得濃度為360 μ g/ml的DGK α溶液，其中步驟2中所述殼聚糖醋酸溶液中的氨基摩爾數與所述DGK α溶液中的磷酸酯基摩爾數之比為8.3 ；
[0046]步驟4、將DGK α溶液和殼聚糖醋酸溶液在溫度為55°C的水浴中加熱15min ；[0047]步驟5、將Iml的360 μ g/ml DGK α溶液繼續(xù)保持在55 V的水浴中，將Iml的1.5mg/ml殼聚糖醋酸溶液取出置于旋渦振蕩器上，邊振蕩邊用吸頭向殼聚糖醋酸溶液中緩慢勻速加入DGKa質粒溶液，兩者比例為1: l，DGKa質粒溶液全部加入后繼續(xù)振蕩60s。室溫靜置lOmin，既獲得2ml淡藍色乳光的DGK α基因-殼聚糖納米粒的溶液，將DGK α基因-殼聚糖納米粒的溶液在4°C的條件下保存。
[0048]2、DGK α基因-殼聚糖納米粒的檢測結果及討論:
[0049]2.1、納米粒度儀檢測DGK α基因-殼聚糖納米粒的粒徑和Zeta電位，透射電鏡觀察DGK α基因-殼聚糖納米粒的形態(tài)。
[0050]如圖1所示，經納米粒度儀檢測，DGK α基因-殼聚糖納米粒的粒徑為283.4nm,多分散度為0.227 ;圖2所示，DGKa基因-殼聚糖納米粒的Zeta電位為+22.1mV;圖3所示透射電鏡圖可見DGK α基因-殼聚糖納米粒的粒徑大小較均一、分布均勻，無明顯凝聚現(xiàn)象，而且包裹DGKa的殼聚糖納米粒的中心染色更深，表明DGKa質粒被包裹在殼聚糖內部，而未包裹DGK α的殼聚糖納米粒粒徑顯著更小，顏色均勻，無深染區(qū)。
[0051]2.2、DNase I型保護實驗:向含I μ g裸DGK α質粒的溶液和含I μ gDGK α質粒的DGKa基因-殼聚糖納米粒的溶液加入I型DNaselU，37°C反應15min，冰浴放置30min，中止消化反應，用含溴化乙錠的I %瓊脂糖凝膠進行電泳分析，凝膠成像分析儀成像。
[0052]如圖4所示，DGKa質粒與殼聚糖形成DGK α基因-殼聚糖納米粒后，DGKa基因-殼聚糖納米粒被阻滯在加樣孔中，未被I型DNase降解，殼聚糖可保護DGK α質粒免受核酸酶破壞。而A孔中裸DGK α質粒被I型DNase降解為小片段。
[0053]其中，在圖4 中，A:裸DGKa質粒+I型DNase ；Β:裸DGKa質粒；C:DGKa基因-殼聚糖納米粒+I型DNase ；D:DGK α基因-殼聚糖納米粒。
[0054]3、治療過敏性哮喘小鼠模型
[0055]3.1、實驗分組:SPF(無特定病原體)級BALB/c雄性小鼠，5_6周齡，隨機分為正常組(Normal)、哮喘組(Asthma)、DGK α基因-殼聚糖納米粒干預組(CS-DGK a )、DGK α基因干預組(DGKa )、空白pEGFP-N3質粒對照組(Control plasmid)、殼聚糖納米粒對照組(CS)，共6組，每組10只。過敏性哮喘小鼠的構建流程和治療干預流程如圖5所示。
[0056]3.2、過敏性哮喘小鼠模型的構建:除正常組外，其余5組按以下方法構建模型。將OVA (卵蛋白，Sigma公司)溶于生理鹽水中，配制濃度為400 μ g/ml的溶液。將400 μ g/mlOVA溶液與氫氧化鋁凝膠以1: 3比例混合，混勻后靜置I小時后可用于腹腔注射小鼠致敏。在第0，7，14天腹腔注射與氫氧化鋁凝膠(Sigma公司)混合的0VA，劑量為200 μ I/鼠，即20μ g OVA/鼠。第28、29、30、31天采用空氣壓縮霧化器霧化吸入10mg/ml OVA溶液(0VA溶于生理鹽水)激發(fā)小鼠，每天35分鐘。采用同樣的處理方法，以不含OVA的生理鹽水與氫氧化鋁凝膠溶液1: 3混合后以同樣體積腹腔注射致敏小鼠，以生理鹽水霧化吸入激發(fā)小鼠，作為正常組。
[0057]3.3、給藥方法
[0058]給藥時間:于致敏前第-13，-4天給藥。
[0059]DGK α基因干預組:將裸DGK α質粒溶于生理鹽水，配制成2000 μ g/ml，每只小鼠肌肉注射50 μ I (含100 μ gDGK α質粒)。
[0060]DGK α基因-殼聚糖納米粒干預組:將制備的DGK α基因-殼聚糖納米粒的溶液，腹腔注射200 μ I/只小鼠，含36 μ g DGK α質粒。
[0061 ] 空白pEGFP-N3質粒對照組:將空白pEGFP_N3質粒溶于生理鹽水，配制成2000 μ g/ml，每只小鼠肌肉注射50 μ I (含100 μ g空白pEGFP-N3質粒)。
[0062]殼聚糖納米粒對照組:將1.5mg/ml殼聚糖醋酸溶液與不含質粒的IOmM的經孔徑為0.22 μ m的無菌膜過濾的無水硫酸鈉溶液在55°C的水浴中加熱15min，不含質粒IOmM的經孔徑為0.22 μ m的無菌膜過濾的無水硫酸鈉溶液繼續(xù)保持在55°C的水浴中，將Iml的
1.5mg/ml殼聚糖醋酸溶液取出置于旋潤振蕩器上,邊振蕩邊用吸頭向Iml的1.5mg/ml殼聚糖醋酸溶液加入到Iml的不含質粒IOmM的經孔徑為0.22 μ m的無菌膜過濾的無水硫酸鈉溶液中，腹腔注射200 μ I/只小鼠。
[0063]3.4、指標測定及其結果
[0064]3.4.1、BALF(支氣管肺泡灌洗液)中細胞總數以及嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞數量
[0065]末次激發(fā)后48小時，腹腔注射麻醉小鼠，處死小鼠，摘眼球取血。切開氣管，插管，PBS (磷酸鹽緩沖液)0.8ml/次，灌洗3次，灌洗液回收率> 80%。回收BALF，1500r/min離心lOmin，留取上清，_80°C保存。細胞沉淀用Iml PBS重懸，取少許滴于血細胞計數板，行細胞總數計數，算出每毫升的細胞數。剩余細胞溶液，1500r/min離心10min,棄上清,用50 μ IPBS重懸細胞沉淀后涂片，晾干后行HE (蘇木素-伊紅)染色。油鏡下進行細胞分類計數，計數600個細胞，計算嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞各占的百分比，計算各類細胞數量。
[0066]如圖6和7所示，哮喘組的BALF中細胞總數、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞數量均顯著高于正常組。腹腔注射DGKa基因-殼聚糖納米粒和肌肉注射裸DGK α質粒均能降低哮喘小鼠BALF中細胞總數、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞數量，腹腔注射DGK α基因-殼聚糖納米粒作用顯著優(yōu)于肌肉注射裸DGK α質粒。殼聚糖納米粒對照組和空白pEGFP-N3質粒對照組BALF中細胞總數、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞數量與哮喘組無顯著差異。以上結果表明DGKa質粒能降低氣道炎癥，而DGK α基因-殼聚糖納米粒能夠顯著增強DGK α基因的治療效果。
[0067]其中，在圖6和7中，Normal:正常組；Asthma:哮喘組；CS_DGKa:DGKa基因-殼聚糖納米粒干預組；DGKa:DGK α基因干預組！Control plasmid:空白pEGFP_N3質粒對照組；CS:殼聚糖納米粒對照組。EOS:嗜酸性粒細胞；LYM:淋巴細胞；NEU:中性粒細胞；MAC:巨噬細胞。與Asthma組相比*p < 0.05 ;與CS-DGK α組相比#ρ < 0.05。
[0068]3.4.2> BALF 炎性指標
[0069]取BALF上清液，采用ELISA (酶聯(lián)免疫吸附試驗)法檢測BALF中IL-4和IL-5水平，ELISA試劑盒購自eBioscience公司，按說明書操作。
[0070]Th2細胞因子水平增高是哮喘的重要特征之一。如圖8和9所示，哮喘組BALF中IL-4和IL-5水平較正常組明顯增高。腹腔注射DGKa基因-殼聚糖納米粒能顯著降低BALF中IL-4和IL-5水平，而肌肉注射裸DGK α質粒不能降低IL-4和IL-5水平。殼聚糖納米粒對照組和空 白pEGFP-N3質粒對照組BALF中IL_4、IL-5水平與哮喘組無顯著差異。
[0071]其中，在圖8和9中，Normal:正常組；Asthma:哮喘組；CS-DGK a:DGKa基因-殼聚糖納米粒干預組；DGKa:DGK α基因干預組！Control plasmid:空白pEGFP_N3質粒對照組；CS:殼聚糖納米粒對照組。與Asthma組相比*p < 0.05。[0072]3.4.3、血清OVA特異性IgE水平檢測
[0073]小鼠處死后，摘眼球取血，室溫靜置I小時后，1000Og,離心10min,留取血清，-80°C保存。采用ELISA法檢測血清OVA特異性IgE水平，ELISA試劑盒購自Chondrex公司，按說明書操作。
[0074]圖10所示，正常組不能檢測到血清OVA特異性IgE，而哮喘組血清OVA特異性IgE明顯增高。給予DGK α基因-殼聚糖納米粒和裸DGK α質粒干預均能顯著降低血清OVA特異性IgE水平，且DGKa基因-殼聚糖納米粒干預組作用顯著優(yōu)于裸DGKa質粒干預組。而殼聚糖納米粒對照組和空白PEGFP-N3質粒對照組血清OVA特異性IgE水平與哮喘組無顯
著差異。
[0075]其中，在圖10中，Normal:正常組；Asthma:哮喘組；CS-DGKa:DGKa基因-殼聚糖納米粒干預組；DGKa:DGK α基因干預組！Control plasmid:空白pEGFP_N3質粒對照組；CS:殼聚糖納米粒對照組。與Asthma組相比*p < 0.05 ;與CS-DGK α組相比#ρ < 0.05。
[0076]3.4.4、肺組織病理檢查
[0077]取小鼠肺組織放入4%甲醛固定液中固定過夜。常規(guī)取材后，進行梯度酒精脫水，組織透明處理，浸蠟，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察肺組織炎性細胞浸潤，水腫和氣道上皮損傷情況。
[0078]如圖11~16所示，正常組氣道和肺組織均未見明顯炎癥改變。哮喘組出現(xiàn)氣道嗜酸性粒細胞等炎性細胞浸潤，氣道上皮破壞、氣道水腫。DGKa基因-殼聚糖納米粒干預組幾乎未見嗜酸性粒細胞浸潤，較哮喘組明顯減輕。DGKa基因干預組氣道炎癥較輕，與哮喘組相比氣道炎癥減輕較明顯。而殼聚糖納米粒對照組和空白PEGFP-N3質粒對照組氣道炎癥與哮喘組相似。
[0079]綜上所述，我們成功制備了 DGK α基因-殼聚糖納米粒，粒徑大小為283.4nm，多分散度為0.227，Zeta電位為+22.lmV，殼聚糖能保護DGKa質粒不被核酸酶所降解。
[0080]而且，根據DGK α具有誘導T細胞無能的作用，我們通過治療過敏性哮喘小鼠的動物模型可以很好的驗證，DGKa基因-殼聚糖納米粒能減少哮喘小鼠BALF中細胞總數、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞數量，明顯降低BALF中IL-4、IL-5和血清OVA特異性IgE水平，顯著改善氣道炎癥。DGKa基因-殼聚糖納米粒在體內降低哮喘小鼠氣道炎癥作用顯著優(yōu)于裸DGK α質粒，而且殼聚糖價格低廉，來源豐富，DGKa基因-殼聚糖納米粒的制備方法簡單，重現(xiàn)性好等優(yōu)點，DGKa基因-殼聚糖納米?？蛇m用于過敏性哮喘的治療。
[0081] 盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【權利要求】
1.一種甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于，包括: 步驟1、制備甘油二酯激酶α質粒:全基因合成小鼠白細胞介素-2信號肽序列和小鼠甘油二酯激酶α基因的融合基因，克隆到PEGFP-N3載體而制備得甘油二酯激酶α質粒； 步驟2、將殼聚糖溶解于I %醋酸水溶液，配制成濃度為0.5~2.5mg/ml的殼聚糖醋酸溶液，用NaOH將其pH值調節(jié)在5.5~5.7之間，無菌膜過濾，其中所述殼聚糖的分子量在2~60萬道爾頓之間，其脫乙酰度在90%~95%之間，所述無菌膜的孔徑為0.22 μ m ; 步驟3、將所述甘油二酯激酶α質粒溶解在濃度為10~25mM的經孔徑為0.22 μ m的無菌膜過濾的無水硫酸鈉溶液中，制備得濃度在100~360 μ g/ml之間的甘油二酯激酶α質粒溶液。其中，步驟2中所述殼聚糖醋酸溶液中的氨基摩爾數與所述甘油二酯激酶α溶液中的磷酸酯基摩爾數之比≥5 ； 步驟4、所述的甘油二酯激酶α質粒溶液和所述殼聚糖醋酸溶液在溫度在55°C~57°C之間的水浴中加熱10~15min ； 步驟5、在漩渦震蕩的條件下，按體積比1:1的比例，將經水浴加熱后的所述甘油二酯激酶α溶液緩慢勻速加入到經水浴加熱后的所述殼聚糖醋酸溶液中，旋渦振蕩30~60s，室溫靜置，既得甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒溶液。
2.如權利要求1所述的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于，所述步驟5中的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒溶液的保存溫度為4°C。
3.如權利要求1所述的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于，本方法制備得的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒溶液中的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒的粒徑在150nm~500nm之間，其中粒徑在150nm~300nm之間的甘油二酯激酶α基因-殼聚糖納米粒占60%以上。
【文檔編號】A61K48/00GK104001187SQ201410244407
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月19日 優(yōu)先權日:2013年2月19日
【發(fā)明者】王彥, 王長征, 林科雄, 程曉明 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院