維生素k2及其生物合成酶在制備抗膀胱癌藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種維生素K2及其生物合成酶在制備抗膀胱癌藥物中的應用。維生素K2及其醫(yī)學上可接受的鹽或維生素K2的生物合成酶應用于抗膀胱癌藥物的制備。由于維生素K2作為一種天然存在的物質可以直接通過細胞膜被人體吸收，直接發(fā)揮作用。同時，因為維生素K2是天然存在的，可以提取，使用成本較低，并且無其他副作用，對人體損傷很小，綜合考慮適合于作為治療膀胱癌的新藥物。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，更具體地，涉及維生素 Κ2及其生物合成酶在制備抗膀 胱癌藥物中的應用。 維生素 K2及其生物合成酶在制備抗膀胱癌藥物中的應用

【背景技術】
[0002] 據(jù)有關資料報道，膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，居惡性腫瘤第九 位。膀胱癌分為表淺性和浸潤性兩大分支，前者80%會出現(xiàn)局部復發(fā)，但轉移率低于10%， 后者有50 %-80 %會發(fā)生轉移。
[0003] 近年來，浸潤性膀胱癌的治療有很大的進展，目前對浸潤性膀胱癌的治療大多采 用根治性全膀胱切除及尿流改造術，部分膀胱癌切除等。以手術為主，放療和化療為輔，但 這些方法存在創(chuàng)傷較大、副作用明顯和患者耐受性低等問題。


【發(fā)明內容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術的以上缺陷或改進需求，本發(fā)明提供了一種維生素 Κ2及其生物合 成酶在制備抗膀胱癌藥物中的應用，其目的在于通過測定維生素 Κ2及其生物合成酶的細 胞毒性及抗膀胱癌活性，開發(fā)一種安全有效的抗膀胱癌藥物活性成分。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了維生素 Κ2及其醫(yī)學上可接受的 鹽或維生素 Κ2的生物合成酶應用于抗膀胱癌藥物的制備。
[0006] 優(yōu)選地，所述維生素 Κ2的生物合成酶為UBIAD1蛋白。
[0007] 總體而言，通過本發(fā)明所構思的以上技術方案與現(xiàn)有技術相比，由于維生素 Κ2作 為一種天然存在的物質可以直接通過細胞膜被人體吸收，直接發(fā)揮作用。同時，因為維生素 Κ2是天然存在的，可以提取，使用成本較低，并且無其他副作用，對人體損傷很小，綜合考慮 適合于應用于抗膀胱癌藥物的制備。維生素 Κ2醫(yī)學上可接受的鹽，經吸收后在體內形成維 生素 Κ2,作用效果相同，維生素 Κ2的生物合成酶，如UBIAD1蛋白，經吸收或轉染后，能將從 植物中吸取的維生素 Κ1轉化成為維生素 Κ2,因此具有相似的抗膀胱癌活性。因此維生素 Κ2醫(yī)學上可接受的鹽、維生素 Κ2的生物合成酶，均可應用于制備抗膀胱癌藥物

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1是實施例1維生素 Κ2抗膀胱癌活性ΜΤΤ檢測結果圖：
[0009] 其中，圖1Α是Τ24細胞在不同VK2劑量下24h培養(yǎng)細胞活性圖；圖1Β是Τ24細胞 在不同VK2劑量下48h培養(yǎng)細胞活性圖；圖1C是J82細胞在不同VK2劑量下24h培養(yǎng)細胞 活性圖；圖1D是J82細胞在不同VK2劑量下48h培養(yǎng)細胞活性圖；
[0010] 圖2是實施例1維生素 K2抗膀胱癌活性流式細胞儀分析結果圖：
[0011] 其中，圖2A是T24細胞在在未處理條件下48h培養(yǎng)細胞凋亡散點圖；圖2B是T24 細胞在25uM VK2劑量下48h培養(yǎng)細胞凋亡散點圖；圖2C是J82細胞在未處理條件下48h 培養(yǎng)細胞凋亡散點圖；圖2D是J82細胞在25uMVK2劑量下48h培養(yǎng)細胞凋亡散點圖；
[0012] 圖3是實施例2中L02細胞在不同VK2劑量下24h培養(yǎng)細胞活性
[0013] 圖4是實施例3中UBIAD1轉染膀胱癌T24細胞活性圖。
[0014] 圖5是實施例4中UBIAD1轉染hek293細胞的活性圖
[0015] 在所有附圖中，相同的附圖標記用來表示相同的元件或結構，其中：

【具體實施方式】
[0016] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術特征只要 彼此之間未構成沖突就可以相互組合。
[0017] 現(xiàn)今治療膀胱癌主要采取手術和化療，都會對人體產生重大損傷，且術后有復發(fā) 的危險。為了克服當前治療膀胱癌的傳統(tǒng)方法帶來的副作用，本發(fā)明提供了一種生物小分 子維生素 K2及其生物合成酶應用于抗膀胱癌藥物的制備，首先對維生素 K2及其生物合成 酶進行了抗膀胱癌活性實驗，然后對維生素 K2及其生物合成酶進行了細胞安全性實驗。并 經過后續(xù)研究，解讀了維生素 K2及其前體抗膀胱癌原理。
[0018] 維生素 K2及其前體抗膀胱癌活性實驗，包括以下步驟：
[0019] (1-1)將實驗用膀胱癌細胞進行體外培養(yǎng)；
[0020] (1-2)用不同濃度的維生素 K2或其前體處理步驟（1-1)中培養(yǎng)的細胞；
[0021] (1-3)統(tǒng)計經不同濃度維生素 K2或其生物合成酶處理的細胞的存活率；
[0022] (1-4)根據(jù)步驟（1-3)的結果，繪制維生素 K2或其生物合成酶的抗膀胱癌活性檢 測結果圖。
[0023] 維生素 K2及其生物合成酶細胞安全性實驗，包括以下步驟：
[0024] (2-1)將實驗用體細胞進行體外培養(yǎng)；
[0025] (2-1)用不同濃度的維生素 K2或其生物合成酶處理步驟（1-1)中培養(yǎng)的細胞；
[0026] (2-3)統(tǒng)計經不同濃度維生素 K2或其生物合成酶處理的細胞的存活率；
[0027] (2-4)根據(jù)步驟（2-3)的結果，繪制維生素 K2或其生物合成酶的細胞安全性檢測 結果圖。
[0028] 實驗證實維生素 K2及其生物合成酶的添加或轉染，對于實驗用膀胱癌細胞具有 明顯的抑制效果。同時維生素 K2作為一種天然存在的物質可以直接通過細胞膜被人體吸 收，直接發(fā)揮作用。因為維生素 K2是天然存在的，可以提取，使用成本較低，并且無其他副 作用，對人體損傷很小，綜合考慮適合于作為治療膀胱癌的新藥物。
[0029] 維生素 K2通過JNK通路促進抑癌基因 p53的表達，p53的大量表達會快速誘促并 產生有促進凋亡作用的PUMA蛋白。PUMA蛋白不僅能夠誘導多種腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤 細胞增殖，還能增加腫瘤細胞對放化療的敏感性，是非常有前景的腫瘤基因治療靶點。同 時會激活PARR修復酶，共同調節(jié)細胞凋亡。
[0030] 由于UBIAD1蛋白等維生素 K2的生物合成酶，其添加，能促進合成的維生素 K2,因 此具有抑制膀胱癌的效果。
[0031] 以下為實施例：
[0032] 實施例1維生素 K2抗膀胱癌活性實驗
[0033] (1-1)將膀胱癌細胞株J82和T24用含10 %胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸 液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul，培養(yǎng)至細胞貼壁。
[0034] (1-2)向步驟（1-1)中培養(yǎng)的細胞，分別加入5uM，10uM，25uM，50uM，100uM的維生 素 K2于細胞培養(yǎng)液中，并設計空白對照（untreated)，培養(yǎng)24小時和48小時后進行檢測。
[0035] (1-3)統(tǒng)計經不同濃度維生素 K2或其前體處理的細胞的存活率：
[0036] 采用MTT技術檢測細胞存活率：
[0037] 培養(yǎng)3-5天后，每孔加 MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH = 7. 4) 20ul，繼續(xù)孵育4 小時，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養(yǎng)上清 液。每孔加150ul DMS0 (二甲基亞砜），振蕩lOmin，使結晶物充分融解。比色檢測細胞濃 度：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。
[0038] 采用流式細胞儀技術檢測細胞存活率：
[0039] 將步驟（1-2)中培養(yǎng)的細胞其細胞懸液加入2ml圓底離心管中，轉速1500rpm離 心5分鐘，棄去上清液后加入PBS緩沖液lml離心洗滌1次，再加入2ml預冷的70%酒精， 4°C固定30min，或是-20°C固定過夜，獲得固定的細胞懸液。將固定的細胞懸液離心，棄去 上清液并洗滌后加入RnaseA (工作濃度20ug/ml)于500ul 1 X PBS中，37°C孵育30min，再次 洗滌1次后加入PI (工作濃度50ug/ml)于500ul 1 X PBS中，室溫避光孵育30min，混勻后過 300目篩網，置流式管中，4°C冰箱保存，及流式細胞儀待測樣品，用流式細胞儀進行分析。
[0040] (2-4)根據(jù)步驟（2-3)的結果，繪制維生素 K2或其生物合成酶的細胞安全性檢測 結果圖。
[0041] 繪制維生素 K2抗膀胱癌活性檢測結果圖，如圖1所示。用流式細胞儀進行分析該 樣品結果如圖2所示。
[0042] 由圖1可知，MTT檢測結果說明在細胞水平上能夠說明維生素 K2對于膀胱癌細胞 具有明顯強烈的抑制作用。流式細胞儀檢測結果如圖2所示，圖2的每個子圖中，第一象限 代表細胞收集過程中機械性損傷的細胞；第二象限代表晚期凋亡細胞；第三象限代表活細 胞；第四象限代表早期凋亡細胞。圖2B和圖2D中第二象限內的散點明顯多于圖2A和圖 2C，圖2B和圖2D中第三象限內的三點明顯少于圖2A和圖2C，說明對于T24細胞和J82細 胞，維生素 K2具有明顯的促進細胞凋亡的作用。綜上所述，維生素 K2在細胞水平上表現(xiàn)出 明顯的抗膀胱癌作用，可推知在個體水平上也能達到治療癌癥的效果。
[0043] 實施例2維生素 K2細胞安全性實驗
[0044] (2-1)將正常肝細胞L02細胞按照實施例1中步驟（1-1)的培養(yǎng)方法進行體外培 養(yǎng)；
[0045] (2-1)向步驟（2-1)中培養(yǎng)的細胞，分別加入5uM，10uM，25uM，50uM，100uM的維生 素 K2于細胞培養(yǎng)液中，并設計空白對照，培養(yǎng)24小時和48小時后進行檢測。
[0046] (2-3)采用ΜΤΤ技術檢測細胞存活率：培養(yǎng)3-5天后，每孔加 ΜΤΤ溶液（5mg/ml用 PBS配制，pH = 7. 4) 20ul，繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，對于懸浮 細胞需要離心后再吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMS0(二甲基亞砜），振蕩lOmin， 使結晶物充分融解。比色檢測細胞濃度：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光 吸收值，記錄結果。
[0047] (2-4)根據(jù)步驟（2-3)的結果，繪制維生素 K2或其生物合成酶的細胞安全性檢測 結果圖，如圖3所不。
[0048] 結果：由圖3可知，在100uM的劑量下，L02細胞活性幾乎沒有影響。據(jù)此，可以說 明維生素 K2的安全性是沒有問題的。說明維生素 K2在細胞水平上幾乎沒有毒性，可推論 在個體水平上安全性高。
[0049] 實施例3維生素 K2生物合成酶UBIAD1蛋白抗膀胱癌活性實驗
[0050] (1-1)將實驗用膀胱癌細胞進行體外培養(yǎng)；
[0051] 將膀胱癌細胞株T24細胞在孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)，向每孔中加入2ml含105個細胞的 培養(yǎng)基，37°C，18% C02培養(yǎng)基，培養(yǎng)至40% -60%匯合時。
[0052] (1-2)用UBIAD1基因轉染步驟（1-1)中培養(yǎng)的細胞；
[0053] 每孔細胞，按照如下操作轉染：配制轉染A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋UBIAD1基 因的DNA，使其濃度為在lug至10ug之間；配制轉染B液，用不含血清培養(yǎng)基稀釋脂質體， 使其濃度在2ug至50ug之間；取A轉染A液lOOul和轉染B液lOOul，輕輕混合，室溫下放 置10至15分鐘，出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，即制得轉染液；將多孔板中培養(yǎng)的一份細胞用2ml不含血 清培養(yǎng)基漂洗2次，再加入lml不含血清培養(yǎng)基后，緩慢加入轉染液搖勻，37°C下反應6至 24小時，吸除轉染液，置于培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0054] (1-3)統(tǒng)計經用UBIAD1基因轉染的細胞的存活率；
[0055] 采用MTT技術檢測細胞存活率：每孔加 MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH = 7. 4) 20ul，繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心 后再吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMS0(二甲基亞砜），振蕩10min，使結晶物充分 融解。比色檢測細胞濃度：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄 結果。
[0056] (1-4)根據(jù)步驟（1-3)的結果，UBIAD1基因抗膀胱癌活性檢測結果圖。
[0057] 分別檢測正常組、副對照組（不加 UBIAD1基因 DNA，其他轉染步驟相同的實驗組） 和轉染組的細胞存活率，制作對比圖如圖4所示。由圖4可知：采用MTT分析轉染UBIAD1 后膀胱癌細胞的活性，在細胞水平上能夠說明UBIAD1對于膀胱癌細胞具有明顯強烈的抑 制作用。
[0058] 實施例4維生素 K2生物合成酶UBIAD1蛋白細胞安全性實驗
[0059] (2-1)將正常體細胞hek293受體細胞進行體外培養(yǎng)；
[0060] 將正常體細胞hek293受體細胞在孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)，向每孔中加入2ml含105個 細胞的培養(yǎng)基，37°C，18% C02培養(yǎng)基，培養(yǎng)至40% -60%匯合時。
[0061] (2-2)用UBIAD1基因轉染步驟（2-1)中培養(yǎng)的細胞；
[0062] 每孔細胞，按照如下操作轉染：配制轉染A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋UBIAD1基 因的DNA，使其濃度為在lug至10ug之間；配制轉染B液，用不含血清培養(yǎng)基稀釋脂質體， 使其濃度在2ug至50ug之間；取A轉染A液lOOul和轉染B液lOOul，輕輕混合，室溫下放 置10至15分鐘，出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，即制得轉染液；將多孔板中培養(yǎng)的一份細胞用2ml不含血 清培養(yǎng)基漂洗2次，再加入lml不含血清培養(yǎng)基后，緩慢加入轉染液搖勻，37°C下反應6至 24小時，吸除轉染液，置于培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0063] (2-3)統(tǒng)計經用UBIAD1基因轉染的細胞的存活率；
[0064] 采用MTT技術檢測細胞存活率：每孔加 MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH = 7. 4) 20ul，繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心 后再吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO(二甲基亞砜），振蕩lOmin，使結晶物充分 融解。比色檢測細胞濃度：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄 結果。
[0065] (2-4)根據(jù)步驟（2-3)的結果，UBIAD1蛋白抗膀胱癌活性檢測結果圖。
[0066] 如圖5所示，相對于空白對照組（untreated,不進行轉染操作），質粒單獨使用對 照（pcdna3. 1，轉染操作步驟僅使用A液，且A液僅含pcdna3. 1質粒，不帶有UBIAD1蛋白）、 脂質體單獨使用對照（lipo,轉染操作僅使用B液）以及轉染組（ubiadl)無明顯抑制作用。 結論：采用MTT分析轉染UBIAD1后hek293細胞的活性，在細胞水平上能夠說明UBIAD1對 于正常細胞沒有抑制作用。
[〇〇67] 本領域的技術人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以 限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含 在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1. 維生素 K2及其醫(yī)學上可接受的鹽或維生素 K2的生物合成酶應用于抗膀胱癌藥物的 制備。
2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述維生素 Κ2的生物合成酶為UBIAD1蛋 白。
【文檔編號】A61K31/122GK104107423SQ201410246465
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權日:2014年6月5日
【發(fā)明者】紅凌 申請人:華中科技大學