一種用于微血栓檢測的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于微血栓檢測的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒及其應(yīng)用。所述的多模態(tài)納米顆粒包括磁共振探針、近紅外熒光探針、熒光染料、表面修飾分子和纖維蛋白靶向分子，所述磁共振探針為超順磁性四氧化三鐵納米顆粒；所述近紅外熒光探針為IR783；所述熒光染料為羅丹明；所述表面修飾分子為聚乙二醇；所述纖維蛋白靶向分子為歸巢肽。本發(fā)明的多模態(tài)納米顆粒聯(lián)合了磁共振探針和近紅外熒光探針，能夠?qū)崿F(xiàn)血栓的多模態(tài)同步無創(chuàng)檢測，同時(shí)保證檢測的空間分辨率和敏感性，且納米顆粒上分布有高密度的CREKA，進(jìn)一步保證了特異性和敏感性，因此尤其適用于體積小、分布彌散的微血栓檢測，同時(shí)納米顆粒上連接有熒光染料，便于離體檢測。
【專利說明】—種用于微血栓檢測的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及臨床診斷和分子顯像【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及一種具有纖維蛋白主動靶向作用的多功能納米顆粒的合成，用于微血栓的無創(chuàng)性多模態(tài)檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]血栓形成是急性缺血性心腦血管疾病(如不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死、腦卒中及肺栓塞等)的主要發(fā)病機(jī)制，最近研究表明微血栓形成在心血管疾病中同樣扮演著重要角色，參與冠脈無復(fù)流、心臟X綜合癥、冠脈微血管痙攣等疾病的發(fā)生。另外，在急性心肌梗死發(fā)病前一個(gè)月，不穩(wěn)定動脈粥樣斑塊上已經(jīng)出現(xiàn)微血栓。
[0003]臨床常用的影像學(xué)手段(如超聲、CTA、血管內(nèi)超聲(IVUS)、光學(xué)相干層析(OCT)及血管內(nèi)鏡等)可檢測大、中血管內(nèi)的血栓，卻無法檢測微循環(huán)血栓，也無法提供有關(guān)血栓分子及細(xì)胞成分的信息。這些信息的提供目前只能依靠活檢或尸檢的病理學(xué)檢測。
[0004]近年來，分子影像學(xué)的快速發(fā)展為微血栓的分子檢測提供了可能性。磁共振成像(MRI)組織空間分 辨率高、無電離輻射。隨著新型納米材料的研發(fā)(如超順磁性四氧化三鐵納米顆粒，SP10),多功能的納米材料可攜載分子探針使機(jī)體微血栓的多模態(tài)顯像成為可能。已經(jīng)有研究者將可靶向纖維蛋白分子的短肽EP-1873或纖維蛋白抗體用釓標(biāo)記后，成功采用MRI檢測體內(nèi)血栓甚至斑塊中沉積的纖維蛋白。但分子磁共振顯像存在敏感性不足的缺陷。光學(xué)成像作為新興影像技術(shù)具有高靈敏度、無電離輻射、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但由于低穿透率、漫反射和自發(fā)熒光等原因，光學(xué)成像空間分辨率較低。近年來，光學(xué)成像中近紅外突光(Near-1nfrared Fluorescence)探針的研究悄然興起。近紅外突光材料(如IR783)的最大吸收和發(fā)射波長為65(T900nm，作為近紅外熒光探針用于活體NIRF成像，具有穿透能力強(qiáng)、顯像背景低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，顯著優(yōu)于常規(guī)的光學(xué)成像。NIR技術(shù)已開始在生物成像領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，如手術(shù)中的實(shí)時(shí)熒光引導(dǎo)、組織學(xué)邊界狀態(tài)分析等。
[0005]微血栓因?yàn)轶w積小、分布彌散，需要高敏感性及高空間分辨率的成像方式。但單一成像技術(shù)難以符合要求:如MRI時(shí)間和空間分辨率高、解剖定位準(zhǔn)確，但敏感性相對不足；而光學(xué)成像敏感性高、可離體驗(yàn)證，但穿透深度及解剖分辨率有限。多模態(tài)顯像可解決單一技術(shù)和顯像模式的缺陷，兼顧敏感性和分辨率。聯(lián)合磁性探針與近紅外熒光探針，研發(fā)血栓靶向性高的多功能納米分子探針是實(shí)現(xiàn)微血栓活體多模態(tài)成像的有效途徑。
[0006]多功能分子探針不僅需要顯像劑，同時(shí)需要可與靶位點(diǎn)相結(jié)合的配體。作為凝血系統(tǒng)正反饋的最終產(chǎn)物，纖維蛋白在血栓形成部位含量豐富，是微血栓靶向顯像的理想靶點(diǎn)。在纖維蛋白靶向性配體選擇上，抗體是用于靶向檢測血栓纖維蛋白成分的的傳統(tǒng)配體。與抗體等其他技術(shù)相比，蛋白修飾技術(shù)具有純度高、可規(guī)?；苽?、制備成本低等優(yōu)點(diǎn)。因此，修飾性多肽可能是更好的選擇。通過體內(nèi)噬菌體展示得到的腫瘤歸巢短肽CREKA(cysteine-arginine-glutamic acid-lysine-alanine),可與腫瘤血管及基質(zhì)中的纖維蛋白特異性的結(jié)合，當(dāng)CREKA連接到膠簇表面后，可特異性的結(jié)合在動脈粥樣硬化斑塊肩部的纖維蛋白，識別斑塊易損部位。因此，特異性結(jié)合纖維蛋白的分子短肽CREKA可作為靶向微血栓成分的靶頭，應(yīng)用于微血栓的多模態(tài)成像。
[0007]而目前還未見將超順磁性四氧化三鐵納米顆粒、近紅外熒光材料IR783以及腫瘤歸巢短肽CREKA連接或結(jié)合，制備多模態(tài)納米探針的相關(guān)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒。
[0009]本發(fā)明的再一的目的是，提供所述纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒的制備方法。
[0010]本發(fā)明的另一的目的是，提供所述纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒的用途。
[0011]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
一種纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒，包括磁共振探針、近紅外熒光探針、熒光染料、表面修飾分子和纖維蛋白靶向分子， 所述磁共振探針為SPIO (超順磁性四氧化三鐵納米顆粒)；
所述近紅外熒光探針為IR783 ；
所述突光染料為Rhodamine (羅丹明)；
所述表面修飾分子為PEG (聚乙二醇)；
所述纖維蛋白靶向分子為CREKA (歸巢肽)。
[0012]所述SPIO為葡聚糖包裹、表面為氨基活性基團(tuán)的納米顆粒。
[0013]所述PEG 為 Mal-PEG34-SCM，所述 Mal_PEG34_SCM 為 3000-3800KD，優(yōu)選 3400KD。
[0014]所述CREKA為半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-賴氨酸-丙氨酸五肽。
[0015]所述IR783、Rhodamine均與SPIO連接，所述SPIO被PEG所修飾，所述CREKA通過PEG橋連在SPIO的氨基上。
[0016]每個(gè)SPIO表面平均連接有1800-2200個(gè)CREKA分子，優(yōu)選2000個(gè)CREKA分子。
[0017]所述PEG與CREKA的摩爾比為(2.5-3.5):1，優(yōu)選為3:1。
[0018]為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
如上所述的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒的制備方法，包括以下步驟:
a)納米顆粒的近紅外熒光標(biāo)記:將近紅外熒光探針I(yè)R783連接到磁共振探針SPIO表面，得至Ij IR783-SP10 ；
b)納米顆粒的熒光染料標(biāo)記:將熒光染料Rhodamine連接到步驟a)制備的IR783-SP10表面，得到 IR783-R-SP10 ；
c)PEG修飾納米顆粒:將PEG連接到步驟b)制備的IR783-R-SP10表面，得到IR783-R-SP10-PEG ；
d)纖維蛋白靶向分子CREKA偶聯(lián):通過步驟c)制備的IR783-R-SP10-PEG表面修飾的PEG與纖維蛋白靶向分子CREKA進(jìn)行偶聯(lián)。
[0019]所述的制備方法具體為:
a)將磁共振探針SPIO溶液和近紅外熒光探針I(yè)R783-NHS溶液25°C條件下50W超聲震蕩反應(yīng)2h獲得IR783-SP10溶液，其中所述SPIO與IR783-NHS的質(zhì)量比為100:1 ;
b)將Rhodamine 加入至 IR783-SP10 溶液中，25°C，50W 超聲 2h 獲得 IR783-R-SP10 溶液；
C)將Mal-PEG34-SCM加入到IR783-R-SP10溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，25°C 50prm反應(yīng)2h,然后4000prm超濾30分鐘獲得IR783-R-SPIO-PEG溶液，其中所述Mal_PEG34_SCM與IR783-R-SPIO 的質(zhì)量比為 1:1 ；
d)向IR783-R-SPIO溶液加入CREKA溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，25 °C 50prm反應(yīng)2h，然后4000rpm超濾30min，共3次，其中所述IR783-R-SPIO與CREKA質(zhì)量比為50:1。
[0020]為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
如上任一所述的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒的用途，用于制備血栓早期診斷和/或?qū)崟r(shí)示蹤的試劑，尤其是用于微血栓的早期診斷和/或?qū)崟r(shí)示蹤。
[0021]需要說明的是，所述的SPIO為磁共振顯像劑，同時(shí)為探針載體；IR783為近紅外熒光基團(tuán)，為光學(xué)成像劑；Rhodamine用于離體病理切片的熒光顯微鏡觀察；PEG為聚乙二醇，CREKA通過功能化PEG橋連到SPIO載體的氨基上；Mal為馬來酰亞胺，用于PEG的功能化，橋連SPIO納米顆粒和CREKA歸巢肽；標(biāo)記在納米顆粒上的CREKA歸巢肽可與腫瘤血管及基質(zhì)中的纖維蛋白特異性的結(jié)合，為靶向微血栓的分子探針。本文中，所述的“磁共振探針”、“磁共振顯像劑”可互換使用；所述的“近紅外熒光探針”、“近紅外熒光基團(tuán)”可互換使用。
[0022]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
本發(fā)明聯(lián)合磁共振探針SPIO與近紅外熒光探針I(yè)R783，將磁共振顯象、光學(xué)顯像融為一體，能夠?qū)崿F(xiàn)血栓的多模態(tài)同步無創(chuàng)檢測，同時(shí)保證了檢測的空間分辨率和敏感性，克服了以往單一顯像模式 的局限性。本發(fā)明在以下方面均具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn):
1、納米材料表面所連接配體的密度對于納米材料的靶向能力至關(guān)重要。納米材料表面配體密度越高，其通過循環(huán)時(shí)與對應(yīng)靶點(diǎn)的接觸機(jī)會越多，從而提高靶向能力及效率。本發(fā)明摸索出合適的CREKA投入量，可保證每個(gè)SPIO表面平均連接有約2000個(gè)CREKA分子，高密度的CREKA分布確保了 SPIO與靶位點(diǎn)纖維蛋白的結(jié)合力，進(jìn)一步保證了 SP10-CREKA對血栓檢測的特異性和敏感性。能夠獲得如此高密度配體的納米顆粒，主要原因在于本申請發(fā)明人在本領(lǐng)域廣泛而深入的研究，充分考慮并意識到影響配體連接效果的因素，進(jìn)而作出以下選擇:(I)本發(fā)明中使用的SPIO表面有足夠多的氨基活性基團(tuán)可用于連接PEG ; (2)本發(fā)明使用的PEG為3000-3800KD，可在SPIO表面形成“云霧狀”結(jié)構(gòu)，利于CREKA的共價(jià)連接；(3)配體連接過程中使用氮?dú)獗Ｗo(hù)，可有效保留Mal的活性，避免其被氧化失活。
[0023]2、本領(lǐng)域技術(shù)人員均知，利用納米顆粒進(jìn)行生物學(xué)檢測或治療時(shí)，納米顆粒將直接或間接釋放進(jìn)入血液，其良好的生物形容性是臨床應(yīng)用的前提。目前有關(guān)納米材料毒性的研究多集中于細(xì)胞毒性及組織毒性，較少涉及其致栓性。通過前期的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明使用的50nm葡聚糖包裹表面為氨基活性基團(tuán)的SPIO致栓性較弱，可安全的應(yīng)用于血栓性疾病的研究。
[0024]3、SPIO表面連接的熒光探針其密度至關(guān)重要，密度較低，不利于體內(nèi)示蹤及顯象，而密度過高，則容易淬滅。本發(fā)明中每個(gè)SPIO顆粒表面連接有約300個(gè)IR783分子及約1500個(gè)Rhodamine分子，具有較強(qiáng)的熒光顯像能力。
[0025]4、使用PEG修飾SP10，由于PEG鏈的立體屏障作用，能提高本發(fā)明的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒的生物相容性和血液循環(huán)時(shí)間，可使納米顆粒避免單核巨噬系統(tǒng)的吞噬，延長血漿中的半衰期。[0026]5、本發(fā)明的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒上標(biāo)記有羅丹明，用熒光顯微鏡觀察離體切片時(shí)，更方便追蹤納米顆粒。
[0027]綜上可知，本發(fā)明的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒尤其適用于體積小、分布彌散的微血栓檢測，可望應(yīng)用于臨床微血栓的早期診斷和實(shí)時(shí)示蹤。
[0028]【專利附圖】
【附圖說明】
圖1:多功能納米探針(IR783-R-SP10-PEG-CREKA，簡稱SP10-CREKA)的合成路線圖。
[0029]圖2:連接效率。A:1R783連接效率(IR783濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線)，每顆SPIO磁珠上連接約300個(gè)IR783分子。B =Rhodamine連接效率(Rhodamine濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線)，每個(gè)IR783-SP10上約連接1500個(gè)Rhodamine分子。C:PEG連接效率(PEG濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線)，每個(gè)IR783-R-SP10上約連接6000個(gè)PEG分子。D =CREKA連接效率(CREKA濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線)，每個(gè)IR783-R-SP10-PEG約連接2000個(gè)CREKA分子。
[0030]圖3:多功能納米探針的粒徑分布圖和電位圖。
[0031]圖4:熒光顯微鏡下觀察納米探針與血栓纖維蛋白的體外靶向結(jié)合。第一行為血栓圖片明場下圖像，第二行為N3通道下觀察納米材料與血栓圖片的結(jié)合情況，紅色熒光為納米材料，第三行為上述二者的融合圖像。
[0032]圖5:納米探針對血栓的體外光學(xué)顯像。A:血栓在活體成像中的顯像；B:各組納米材料熒光值的半定量分析。*SP10-CREKA組與SPIO-PEG組及PBS組比較代0.001。
[0033]圖6:納米探 針對血栓的磁共振T2加權(quán)顯像。A:MRI T2加權(quán)像上的血栓顯像。B:各組納米材料MRI T2加權(quán)像上信號值。*SP10-CREKA組與SPIO-PEG組及PBS組比較代0.001。
[0034]圖7:免疫熒光檢測大鼠心肌缺血再灌注24h后纖維蛋白微血栓的表達(dá)。左室前壁fibrin沉積明顯增加,而左室后壁及右室未見fibrin表達(dá)。
[0035]圖8:透射電鏡檢測大鼠心肌缺血再灌注24h后纖維蛋白微血栓形成。PLT:血小板；RBC:紅細(xì)胞，EC:內(nèi)皮細(xì)胞；箭頭:纖維蛋白。
[0036]圖9:基于多功能納米探針的大鼠心臟微血栓磁共振成像。A為各組的MRI T2加權(quán)代表性圖像，B為LVAW相對信號值。*SP10-CREKA組與SPIO-PEG組及PBS組比較代0.01。
[0037]圖10:基于多功能納米探針的大鼠心臟微血栓的光學(xué)成像。A:離體心臟成像檢測SP10-CREKA對大鼠心臟微血栓的光學(xué)成像能力；B:各組大鼠心臟熒光半定量強(qiáng)度。*spio-creka 組與 spio-peg 組及 pbs 組比較代ο.οοι。
[0038]圖11:納米探針的組織分布。A:SP10_CREKA經(jīng)尾靜脈注射后在各器官組織中的分布情況:各組織器官的熒光半定量強(qiáng)度。
[0039]圖12:納米探針靶向定位心臟微血栓的激光共聚焦觀察。藍(lán)色熒光為細(xì)胞核染色；綠色熒光為大鼠心肌M/R后血管內(nèi)纖維蛋白沉積；紅色為相應(yīng)SPIO ;第四列為前三者的融合圖。箭頭表示SP10-CREKA與纖維蛋白共定位。
[0040]圖13:納米探針靶向定位心臟微血栓的電鏡圖。RBC:紅細(xì)胞；PLT:血小板；En:血管內(nèi)皮細(xì)胞；LUMEN:血管腔。
[0041]【具體實(shí)施方式】
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0042]實(shí)施例中，所述的Rhodamine-NHS為若丹明-NHS，分子式=C29H25N3O7,分子量:527.53。所用的Mal-PEG34-SCM為馬來酰亞胺_聚乙二醇_琥珀酰亞胺乙酸酯(MW 3400KD)。所用的SPIO是micromod廠家生產(chǎn)的商品化的粒徑為50nm葡聚糖包裹的表面為氨基活性基團(tuán)的SPIO納米顆粒。
[0043]實(shí)施例1多功能納米探針I(yè)R783-R-SP10-PEG-CREKA的合成(一)
合成過程示意圖見附圖1。將熒光染料攜載于SPIO表面，再采用PEG修飾SP10，Mal-PEG 與 CREKA 共價(jià)結(jié)合，得到 IR783-R-SP10-PEG-CREKA(簡稱 SP10-CREKA)。具體步驟如下:
(I) IR783-SP10 的合成:取 20mg SPIO 即 4ml SPIO 溶液(5mg/ml)超濾后置換成 ρΗ7.4的PBS緩沖液;取20 μ I IR783-NHS (10mg/ml)加入至SPIO溶液中，25°C，50W超聲2h ;將反應(yīng)所得物通過預(yù)先用PH7.4的PBS緩沖液平衡的Hitrap柱，去除未連接的IR783 ;并測量IR783-NHS連接效率。見附圖2A。
[0044](2) IR783-R-SP10 的合成:將 40 μ I rhodamine-NHS 加入至 IR783-SP10 溶液中，25°C，50W超聲2h ;取反應(yīng)所得物通過預(yù)先用pH7.4的PBS緩沖液平衡的Hitrap柱，去除未連接的rhodamine-NHS ;并測量rhodamine-NHS連接效率。見附圖2B。
[0045](3) IR783-R-SP10-PEG 的合成:取 IR83-R-PEG 20mg 加入 20mg Mal_PEG34_SCM(3400KD)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，25°C 50pr反應(yīng)2h ;反應(yīng)物置于超濾管中，4000prm超濾30分鐘，分離游離的P EG ;反復(fù)超濾3次，收集超濾液；測量PEG連接效率。見附圖2C。
[0046](4) IR783-R-SP10-PEG-CREKA 的合成:取 20mg IR783-R-SP10-PEG PBS 溶液加入CREKA 溶液 400 μ I (lmg/ml);在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，25°C，50prm 反應(yīng) 2h ;4000rpmX 30min，超濾 3次，分離游離CREKA ;計(jì)算CREKA連接效率。見附圖2D。
[0047]實(shí)施例2多功能納米探針的粒徑分布及Zeta電位
分別取 800 μ I SP10、IR783-R-SP10、IR783-R-SP10-PEG 及 IR783-R-SP10-PEG-CREKA溶液，采用粒徑/Zeta電位測量儀，測定其光散射粒徑和粒子分布寬度。分別取Iml SP10、IR783-R-SP10、IR783-R-SP10-PEG 及 IR783-R-SP10-PEG-CREKA 溶液，分別通過事先用
0.001Μ的NaCl溶液平衡后的Hitrap柱置換緩沖液，采用粒徑/Zeta電位測量儀，測定其Zeta電位。
[0048]結(jié)果顯示，用動態(tài)光散射的方法測定納米探針的流體動力學(xué)粒徑為103.6±4.7nm，平均 Zeta 電位-2.2±0.7mV。見附圖 3。
[0049]實(shí)施例3多功能納米探針對體外血栓的結(jié)合能力檢測
分別采用熒光顯微鏡、光學(xué)成像系統(tǒng)和MRI成像系統(tǒng)檢測多功能納米探針對血栓纖維蛋白的體外結(jié)合能力。具體步驟如下:
(I)熒光顯微鏡檢測:玻片上加入20μ I人新鮮血漿、2μ I CaCl2 (0.4mol/L)溶液及2μ I凝血酶(0.1U/μ I);將玻片置于37°C恒溫箱，孵育60分鐘；分別加入20 μ I PBS、SPIO-PEG (5mg/ml SP10)及 SP10-CREKA (5mg/ml SP10)后，置于 37°C恒溫箱，孵育 15 分鐘；PBS清洗5minX3次后熒光顯微鏡下觀察(N3通道，激發(fā)546±6nm，激發(fā)600±20nm)。
[0050]結(jié)果顯示，SP10-CREKA組在纖維蛋白栓子表面可觀察到紅色熒光，而PBS組及SPIO-PEG組均無明顯紅色熒光。見附圖4。
[0051](2)活體光學(xué)成像系統(tǒng)檢測:96孔板中加入90 μ I人新鮮血漿，5 μ I CaCl2溶液及5μ I凝血酶(0.1 U/μ I);將96孔板置于37°C恒溫箱，孵育90分鐘；分別加入相應(yīng)納米材料 50 μ 1，即 PBS,SPIO-PEG (5mg/ml)及 SPIO-CREKA (5mg/ml)，37°C恒溫箱，孵育 30 分鐘；PBS清洗5minX 3次后小動物活體成像儀檢測(激發(fā)波長783nm，發(fā)射波長840nm)。
[0052]結(jié)果顯示，SP10-CREKA組熒光強(qiáng)度為(1.29 土 0.25) X 101CI，而對照組SP10-PEG組為(0.17±0.07) X101Q，SP10-CREKA 組熒光強(qiáng)度為 SPIO-PEG 組的 7.5 倍，/7 < 0.001，實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組。見附圖5。
[0053](3) MRI檢測:活體成像檢測完畢后，在96孔板中血凝塊加入100 μ I 2%瓊脂糖凝膠，等待其冷卻凝固，包埋血凝塊；3.0T MR成像，參數(shù)設(shè)置:T2 fl2d, TR = 800 ms ；TE = 26ms ；flip angle = 25° ;層厚 2 mm, F0V=90 mm，矩陣 256X 160，空氣信號強(qiáng)度設(shè)置為 O。
[0054]結(jié)果顯示，SPIO-CREKA組在MRI顯示為低信號，信號值為(66.4±13.7)，而SPIO-PGE組信號改變不明顯，為(201.8± 11.0)，PBS組信號值為(210.9± 17.2)，SPIO-CREKA 組與 SPIO-PEG 組及 PBS 組比較，/7 < 0.001。見附圖 6。
[0055]實(shí)施例4多功能納米探針對大鼠心臟微血栓的多模態(tài)成像
(I)心肌缺血再灌注(I/R)法建立大鼠心臟微血栓模型。大鼠開胸后，在左心耳下方2mm處6-0 Prolene線縫針進(jìn)針，冠脈與結(jié)扎線間墊一橡皮筋后將無創(chuàng)傷絲線打活結(jié)阻斷前降支，在缺血60 min后松開活結(jié)，再灌注24h。進(jìn)行纖維蛋白抗體法免疫熒光染色和心肌透射電鏡檢測，以驗(yàn)證心臟微血栓形成。
[0056]大鼠心臟缺血再灌注后24h后，在左室前壁可觀察到纖維蛋白在微血管內(nèi)沉積(綠色熒光)，形成纖維蛋白微血栓，而左室后壁、右室未見纖維蛋白免疫熒光(附圖7)。透射電鏡觀察到大鼠心肌缺血再灌注24h后，再灌注區(qū)域的毛細(xì)血管內(nèi)分布著數(shù)量不等的血小板及紅細(xì)胞，血小板周圍可 見纖維蛋白形成(附圖8)。
[0057](2)實(shí)驗(yàn)分組。實(shí)驗(yàn)動物分為 I/R+PBS、I/R+SPIO-PEG、I/R+SP10-CREKA 及Sham+SPIO-CRKEA組，每組11大鼠。I/R+PBS組:SD大鼠接受I/R手術(shù)操作，再灌注24h后尾靜脈注射0.2ml PBS,作為對照。I/R +SPIO-PEG組:SD大鼠接受I/R手術(shù)操作，再灌注 24h 后尾靜脈注射 0.2ml SPIO-PEG 溶液(20mg SPIO/kg)。I/R+SP10-CREKA 組:SD 大鼠接受I/R手術(shù)操作，再灌注24h后尾靜脈注射0.2ml SPIO-CREKA溶液(20mg SPIO/kg)。Sham+SP IO-CRKEA組:SD大鼠接受假手術(shù)操作，術(shù)后24h靜脈注射0.2ml SPIO-CREKA溶液(20mg SPIO/kg)。
[0058](3)大鼠心臟微血栓的MRI成像:大鼠接受尾靜脈注射相應(yīng)納米材料4小時(shí)后進(jìn)行3T小動物線圈磁共振顯像。MRI成像參數(shù):T2 fl2d，重復(fù)時(shí)間(TR)750 ms，回波時(shí)間(TE)2，8ms，層厚2mm，偏轉(zhuǎn)角20。，視野(FOV) 90mm，矩陣400 X 400，26個(gè)心動周期；使用ImageJ software 1.37v軟件分析左室心肌信號強(qiáng)度，計(jì)算左室前壁相對信號強(qiáng)度=左室前壁信
號強(qiáng)度/左室后壁信號強(qiáng)度。
[0059]結(jié)果顯示，SPIO-CREKA組大鼠心臟左室前壁左前降支供血區(qū)在T2加權(quán)像是顯示為低信號，LVAM相對信號強(qiáng)度為(0.65±0.07)，SP10-PEG組為(0.95±0.08)，PBS組為(0.99 ±0.11)，SPIO-CREKA 組與其相比，P<Q.01, sham 組接受 SP10-CREKA 其 LVAM 相對信號強(qiáng)度為(0.92±0.06)。見附圖9。
[0060](4)心臟及主要器官離體光學(xué)成像:腹腔注射氯胺酮麻醉后，打開大鼠胸腔，剪開右心耳，沿心尖部注射生理鹽水20ml心臟灌流；取下心臟及主要器官:肝臟、脾臟、肺、腎臟及腦，用生理鹽水充分洗滌后，濾紙吸干；將心臟及主要器官置于小動物活體成像儀中檢測，激發(fā)波長為783nm,發(fā)射波長為840nm。[0061]結(jié)果顯示SP10-CREKA組心臟局部熒光強(qiáng)度是SP10-PEG組的1.95倍(1.88±0.5X107 vs.0.96±0.09Χ107，P<Q.001)，PBS 組熒光強(qiáng)度為 0.99±0.IXlO7，sham+SPIO-CREKA 組熒光強(qiáng)度為 0.94±0.I X 107(附圖 10)。SPIO-CREKA 及 SPIO-PEG 主要分布在肝臟及腎臟內(nèi)，連接CREKA并未改變SPIO組織分布(附圖11)。
[0062](5)SPIO-CREKA靶向微血栓的激光共聚焦和電鏡檢測:為進(jìn)一步證實(shí)SP10-CREKA對微血栓的靶向性，激光共聚焦顯微鏡和透射電鏡檢測大鼠心臟微血栓與SP10-CREKA的共定位。
[0063]共聚焦觀察大鼠I/R后組織切片可發(fā)現(xiàn)，SP10-CREKA組心臟血管內(nèi)可觀察到SPIO-CREKA (紅光)結(jié)合在微血栓(綠色)表面，而PBS組及SPIO-PEG組未見明顯紅色熒光(附圖12)。Steffen等研究表明在缺血再灌注的微循環(huán)中，纖維蛋白與血小板共同沉積在微血管表面。本研究結(jié)果顯示，血小板直接粘附在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，同時(shí)在血管壁、血小板及紅細(xì)胞等表面可見密度較大的SP10-CREKA顆粒，結(jié)果表明SP10-CREKA對微血栓有較好的靶向能力。見附圖13。
[0064]實(shí)施例5多功能納米探針I(yè)R783-R-SP10-PEG-CREKA的合成(二)
(I)IR783-SP10 的合成:取 20mg SPIO 即 4ml SPIO 溶液(5mg/ml)超濾后置換成 ρΗ7.4的PBS緩沖液；取20 μ I IR783-NHS (10mg/ml)加入至SPIO溶液中，25°C，50W超聲2h ;將反應(yīng)所得物通過預(yù)先用PH7.4的PBS緩沖液平衡的Hitrap柱，去除未連接的IR783 ;并測量IR783-NHS連接效率，每顆SPIO磁珠上連接約300個(gè)IR783分子。
[0065](2) IR783-R-SP10 的合成:將 40 μ I Rhodamine-NHS 加入至 IR783-SP10 溶液中，25°C，50W超聲2h ;取反應(yīng)所得物通過預(yù)先用pH7.4的PBS緩沖液平衡的Hitrap柱，去除未連接的Rhodamine-NH S ;并測量rhodamine-NHS連接效率，每個(gè)IR783-SP10上約連接1500個(gè) Rhodamine 分子。
[0066](3) IR783-R-SP10-PEG 的合成:取 IR83-R-PEG 20mg 加入 22mg Mal_PEG34_SCM(3000KD)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，25°C 50pr反應(yīng)2h ;反應(yīng)物置于超濾管中，4000prm超濾30分鐘，分離游離的PEG ;反復(fù)超濾3次，收集超濾液；測量PEG連接效率，每個(gè)IR783-R-SP10上約連接7700個(gè)PEG分子。
[0067](4) IR783-R-SP10-PEG-CREKA 的合成:取 20mg IR783-R-SP10-PEG PBS 溶液加入CREKA 溶液 500 μ I (lmg/ml);在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，25°C，50prm 反應(yīng) 2h ;4000rpmX 30min，超濾3次，分離游離CREKA ;計(jì)算CREKA連接效率，每個(gè)IR783-R-SP10-PEG約連接2200個(gè)CREKA分子。
[0068]實(shí)施例6多功能納米探針I(yè)R783-R-SP10-PEG-CREKA的合成(三)
(I)IR783-SP10 的合成:取 20mg SPIO 即 4ml SPIO 溶液(5mg/ml)超濾后置換成 ρΗ7.4的PBS緩沖液；取20 μ I IR783-NHS (10mg/ml)加入至SPIO溶液中，25°C，50W超聲2h ;將反應(yīng)所得物通過預(yù)先用PH7.4的PBS緩沖液平衡的Hitrap柱，去除未連接的IR783 ;并測量IR783-NHS連接效率，每顆SPIO磁珠上連接約300個(gè)IR783分子。
[0069](2) IR783-R-SP10 的合成:將 40 μ I Rhodamine-NHS 加入至 IR783-SP10 溶液中，25°C，50W超聲2h ;取反應(yīng)所得物通過預(yù)先用pH7.4的PBS緩沖液平衡的Hitrap柱，去除未連接的Rhodamine-NHS ;并測量rhodamine-NHS連接效率，每個(gè)IR783-SP10上約連接1500個(gè) Rhodamine 分子。[0070](3) IR783-R-SP10-PEG 的合成:取 IR83-R-PEG 20mg 加入 17mg Mal_PEG34_SCM(3800KD)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，25°C 50pr反應(yīng)2h ;反應(yīng)物置于超濾管中，4000prm超濾30分鐘，分離游離的PEG ;反復(fù)超濾3次，收集超濾液；測量PEG連接效率，每個(gè)IR783-R-SP10上約連接4500個(gè)PEG分子。
[0071](4) IR783-R-SP10-PEG-CREKA 的合成:取 20mg IR783-R-SP10-PEG PBS 溶液加入CREKA 溶液 300 μ I (lmg/ml);在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，25°C，50prm 反應(yīng) 2h ;4000rpmX 30min，超濾3次，分離游離CREKA ;計(jì)算CREKA連接效率，每個(gè)IR783-R-SP10-PEG約連接1800個(gè)CREKA分子。
[0072]對比例I多功能納米探針I(yè)R783-R-SP10-PEG-CREKA的合成(四)
(I)IR783-SP10 的合成:取 20mg SPIO 即 4ml SPIO 溶液(5mg/ml)超濾后置換成 ρΗ7.4的PBS緩沖液；取20 μ I IR783-NHS (10mg/ml)加入至SPIO溶液中，25°C，50W超聲2h ;將反應(yīng)所得物通過預(yù)先用PH7.4的PBS緩沖液平衡的Hitrap柱，去除未連接的IR783 ;并測量IR783-NHS連接效率，每顆SPIO磁珠上連接約300個(gè)IR783分子。
[0073](2) IR783-R-SP10 的合成:將 40 μ I Rhodamine-NHS 加入至 IR783-SP10 溶液中，25°C，50W超聲2h ;取反應(yīng)所得物通過預(yù)先用pH7.4的PBS緩沖液平衡的Hitrap柱，去除未連接的Rhodamine-NHS ;并測量rhodamine_NHS連接效率，每個(gè)IR783-SP10上約連接1500個(gè) Rhodamine 分子。
[0074](3) IR783-R-SP10-PEG 的合成:取 IR83-R-PEG 20mg 加入 15mg Mal_PEG34_SCM(3800KD)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，25°C 50pr反應(yīng)2h ;反應(yīng)物置于超濾管中，4000prm超濾30分鐘，分離游離的PEG ;反 復(fù)超濾3次，收集超濾液；測量PEG連接效率，每個(gè)IR783-R-SP10上約連接3800個(gè)PEG分子。
[0075](4) IR783-R-SP10-PEG-CREKA 的合成:取 20mg IR783-R-SP10-PEG PBS 溶液加入CREKA 溶液 200 μ I (lmg/ml);在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，25°C，50prm 反應(yīng) 2h ;4000rpmX 30min，超濾3次，分離游離CREKA ;計(jì)算CREKA連接效率，每個(gè)IR783-R-SP10-PEG約連接1600個(gè)CREKA分子。
[0076]實(shí)施例7實(shí)施例5-6及對比例I制備的多功能納米探針對體外血栓的結(jié)合能力檢測按照實(shí)施例3的方法分別采用熒光顯微鏡、光學(xué)成像系統(tǒng)和MRI成像系統(tǒng)檢測實(shí)施例5-6及對比例I制備的多功能納米探針對血栓纖維蛋白的體外結(jié)合能力。熒光顯微鏡檢測結(jié)果顯示各組在纖維蛋白栓子表面可觀察到紅色熒光?；铙w光學(xué)成像系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示實(shí)施例5、實(shí)施例6、對比例I組熒光強(qiáng)度分別為:(1.01 ± 0.15) X 10'(1.08 ± 0.19) X 10'(058 ± 0.09)X101CI，實(shí)施例5、實(shí)施例6分別與對比例I組熒光強(qiáng)度比較，/7 < 0.001。MRI檢測結(jié)果顯示，實(shí)施例5、實(shí)施例6、對比例I組信號值分別為(78.6±12.5)、(82.5± 12.9)、(120.3±16.1)，實(shí)施例5、實(shí)施例6分別與對比例I組MRI信號值比較，產(chǎn)< 0.01。以上結(jié)果表明CREKA連接效率以及Mal-PEG與CREKA的摩爾比對于多功能納米探針光學(xué)成像和磁共振顯象會產(chǎn)生顯著影響。
[0077]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒，其特征在于，包括磁共振探針、近紅外熒光探針、熒光染料、表面修飾分子和纖維蛋白靶向分子， 所述磁共振探針為SPIO ； 所述近紅外熒光探針為IR783 ； 所述突光染料為Rhodamine ； 所述表面修飾分子為PEG ； 所述纖維蛋白靶向分子為CREKA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒，其特征在于，所述SPIO為葡聚糖包裹、表面為氨基活性基團(tuán)的納米顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒，其特征在于，所述PEG為Mal-PEG34-SCM,所述 Mal_PEG34_SCM 為 3000-3800KD，優(yōu)選 3400KD。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒，其特征在于，所述CREKA為半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-賴氨酸-丙氨酸五肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒，其特征在于，所述IR783、Rhodamine均與SPIO連接，所述SPIO被PEG所修飾，所述CREKA通過PEG橋連在SPIO的氨基上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒，其特征在于，每個(gè)SPIO表面平均連接有1800-2200個(gè)CREKA分子，優(yōu)選2000個(gè)CREKA分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒，其特征在于，所述PEG與CREKA的摩爾比為(2.5-3.5):1，優(yōu)選為3:1。
8.權(quán)利要求1所述的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: a)納米顆粒的近紅外熒光標(biāo)記:將近紅外熒光探針I(yè)R783連接到磁共振探針SPIO表面，得至Ij IR783-SP10 ； b)納米顆粒的熒光染料標(biāo)記:將熒光染料Rhodamine連接到步驟a)制備的IR783-SP10表面，得到 IR783-R-SP10 ； c)PEG修飾納米顆粒:將PEG連接到步驟b)制備的IR783-R-SP10表面，得到IR783-R-SP10-PEG ； d)纖維蛋白靶向分子CREKA偶聯(lián):通過步驟c)制備的IR783-R-SP10-PEG表面修飾的PEG與纖維蛋白靶向分子CREKA進(jìn)行偶聯(lián)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的制備方法具體為: a)將磁共振探針SPIO溶液和近紅外熒光探針I(yè)R783-NHS溶液25°C條件下50W超聲震蕩反應(yīng)2h獲得IR783-SP10溶液，其中所述SPIO與IR783-NHS的質(zhì)量比為100:1 ; b)將Rhodamine 加入至 IR783-SP10 溶液中，25°C，50W 超聲 2h 獲得 IR783-R-SP10 溶液； c)將Mal-PEG34-SCM加入到IR783-R-SP10溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，25°C50prm反應(yīng)2h,然后4000prm超濾30分鐘獲得IR783-R-SP10-PEG溶液，其中所述Mal_PEG34_SCM與IR783-R-SP10 的質(zhì)量比為 1:1 ； d)向IR783-R-SP10溶液加入CREKA溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，25°C 50prm反應(yīng)2h，然后4000rpm超濾30min，共3次，其中所述IR783-R-SP10與CREKA質(zhì)量比為50:1。
10.權(quán)利要求1-7任一所述的纖維蛋白靶向多模態(tài)納米顆粒的用途，其特征在于，用于制備血栓早期診斷和 /或?qū)崟r(shí)示蹤的試劑。
【文檔編號】A61K49/00GK104013977SQ201410248305
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】葛均波, 錢菊英, 黃浙勇, 宋亞楠, 龐志清 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院