主動免疫治療慢性哮喘的呈遞il-33的vlp疫苗構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種主動免疫治療慢性哮喘的呈遞IL-33的VLP疫苗構(gòu)建方法，包括以下步驟：從小鼠提取IL-33總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄得到IL33總cDNA，用設計的特異性引物將得到的總cDNA通過PCR擴增，得到編碼IL-33成熟片段基因，將該基因插入到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78-79位氨基酸之間，得到重組質(zhì)粒pHBcAg33，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α或BL21感受態(tài)細胞上，用IPTG誘導、純化，得到呈遞IL-33的病毒樣顆粒疫苗。只需幾次免疫注射該疫苗即可誘導強的針對自身分子的、有持續(xù)作用的中和性抗體，以調(diào)控免疫應答，達到調(diào)控哮喘疾病進程的目的。
【專利說明】主動免疫治療慢性哮喘的呈遞IL-33的VLP疫苗構(gòu)建方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種抗細胞因子病毒樣顆粒疫苗——IL-33病毒樣顆粒疫苗的制備方法，及其在哮喘中的治療用途，屬于醫(yī)學生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0003]白細胞介素-33 (簡稱IL-33)是一個于2005年利用生物信息學技術(shù)發(fā)現(xiàn)的新細胞因子，屬于IL-1家族成員。豐富地表達于人平滑肌細胞和支氣管上皮細胞以及樹突狀細胞。主要功能是促進Th2型免疫應答，其作用在于IL-33具有很強的刺激Th2的分化與激活的功 能。通過刺激Th2細胞因子的表達，IL-33可促進B細胞合成IgE，促進肥大細胞募集，成熟和存活，刺激嗜酸性粒細胞與嗜堿性粒細胞的存活和效應功能等。
[0004]哮喘是一個嚴重的氣道炎性疾病，其病理機制沒有完全弄清楚。許多證據(jù)證明IL-33在過敏性氣道炎癥中有重要作用。全基因組關(guān)聯(lián)研究顯示IL-33的基因多態(tài)性與哮喘易感性有關(guān)。
[0005]在嚴重哮喘中IL-33水平增加。在動物模型中使用IL-33誘導出氣道高反應性和肺部杯狀細胞增生，加劇了嗜酸性粒細胞介導的氣道炎癥，增加了選擇性活化的巨噬細胞的極化從而促進了氣道炎癥。過敏原誘導的Th2細胞和相應的細胞因子以及相關(guān)的適應性免疫是促進過敏性哮喘發(fā)生的主要原因。IL-33通過激發(fā)Th2樣的免疫反應來體現(xiàn)它的病理效應。一些能對IL-33的刺激起反應的細胞也參與到哮喘的發(fā)病機理中。在激素抵抗型兒童哮喘患者中，IL-33促進了氣道重塑。因此，IL-33是治療哮喘的有效靶點。
[0006]雖然有藥物治療手段，但目前對哮喘的治療主要是對炎癥的抑制及支氣管擴張，如吸入糖皮質(zhì)激素和β 2受體激動劑，口服白三烯受體拮抗劑等。這類藥物能減少哮喘發(fā)作次數(shù)、減輕發(fā)作時的體征，患者需長期甚至終生按時用藥。然而，上述藥物并未對哮喘真正治愈，如果停止治療，病人將出現(xiàn)病情反復甚至惡化。氣道重塑及持續(xù)性肺功能損失一旦建立，目前的炎癥控制等醫(yī)療手段無法對其逆轉(zhuǎn)。
[0007]在治療一些過敏和自身免疫病中，抗細胞因子疫苗是一種新的和有希望的方法。疫苗策略可能戰(zhàn)勝單克隆抗體的一些功能，例如幾次免疫注射后就能提供持久的干預效果，對治療慢性病是很方便的。乙肝病毒核心抗原(簡稱HBcAg或載體)在大腸桿菌里能夠有效的組裝成病毒樣顆粒，具有極強的免疫原性并且已經(jīng)廣泛的應用于插入目的抗原的疫苗載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，針對現(xiàn)有技術(shù)手段不能有效治療哮喘的問題，構(gòu)建一種有效的包含了 IL-33成熟蛋白全分子的病毒樣顆粒疫苗，只需幾次免疫注射該疫苗即可誘導強的針對自身分子的、有持續(xù)作用的中和性抗體，以調(diào)控免疫應答，從而達到調(diào)控哮喘疾病進程的目的。
[0009]本發(fā)明所述的IL-33成熟蛋白病毒樣顆粒疫苗(簡稱HBcAg33或疫苗)，以IL-33成熟蛋白作為組成之一，選擇具有強免疫原性的乙肝病毒核心抗原作為載體(簡稱載體)，通過基因工程的方法，將編碼IL-33的成熟片段與乙肝病毒核心抗原連接并在大腸桿菌中高效表達。
[0010]本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實現(xiàn):一種主動免疫治療慢性哮喘的呈遞IL-33的VLP疫苗構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟:
1)、從小鼠提取IL-33總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄得到IL33總cDNA，用設計的特異性引物將得到的總cDNA通過PCR擴增，得到編碼IL-33成熟片段基因，所述特異性引物設計如下:
編碼IL-33成熟片段基因的上游引物(5，端):gtggatccagcatccaaggaacttcac 編碼IL-33成熟片段基因的下游引物(3’端):gtgaattcgattttcgagagcttaaac
2)、將編碼截斷的乙肝病毒核心抗原HBcAg克隆到pThioHisA載體，再將步驟I)得到的編碼IL-33成熟片段基因插入到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78-79位氨基酸之間，得到重組質(zhì)粒pHBcAg33 ；
3)、將步驟2)得到的重組質(zhì)粒PHBcAg33轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α或BL21感受態(tài)細胞上；
4)、用IPTG誘導步驟3)的轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒PHBcAg33的大腸桿菌DH5α或BL21，高效表達IL-33目的蛋白，并用飽和度為40%和30%的硫酸銨、體積比為39%、33%和27%的碘克沙醇，對IL-33目的蛋白進行密度梯度離心純化，最后用瓊脂糖凝膠CL-4B柱子純化IL-33目的蛋白，得到呈遞IL-33的病毒樣顆粒疫苗。
[0011]所述步驟2)的編碼截斷的乙肝病毒核心抗原HBcAg (1-149個氨基酸)的基因庫收錄號為:GQ377581。
[0012]所述步驟3)中的編碼IL-33成熟片段基因的基因庫收錄號為:ΑΥ905582。
[0013]所述步驟2)的重組質(zhì)粒構(gòu)建如下:
編碼截斷的HBcAg基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中5’端和3’端分別有BamH I和EcoR I的酶切位點，并用內(nèi)切酶Nde I和Pst I酶切后克隆到pThioHisA中，得到質(zhì)粒PHBcAg ;然后再用BamH I和EcoR I將編碼IL-33成熟片段基因的DNA插入到pHBcAg中，得到帶有目的蛋白的重組質(zhì)粒pHBcAg33，經(jīng)過測序，重組質(zhì)粒的目的基因與基因庫中的序列一致。
[0014]所述步驟4)中的目的蛋白的誘導和純化經(jīng)過下列步驟:
1)將25°C下IPTG誘導4小時的I升菌液離心后，收集菌體；
2)用0.02摩爾/升、pH 7.4的磷酸緩沖液20毫升，將步驟I)收集的菌體重新懸起來，用超聲波破碎菌體后離心分離，收集上清20毫升；在收集的20毫升上清中加入4.86克硫酸銨，室溫下放置30分鐘后離心，收集沉淀，所述硫酸銨在25°C條件下達到的飽和度為40% ;再用20毫升飽和度為30%的硫酸銨溶液洗滌收集的沉淀，共洗滌三次；最后用0.02摩爾/升、pH 7.4的磷酸緩沖液溶解洗滌后的沉淀，每次用500微升溶解，共溶解4次；再通過體積比為27%、33%和39%的碘克沙醇進行密度梯度離心，具體操作為；從5毫升離心管的底部到頂部依 次加入1.4毫升體積比為39%、33%和27%的碘克沙醇，加完后每個體積比的碘克沙醇之間形成明顯界限，室溫放置過夜；次日每個體積比的碘克沙醇之間的界限消失，向離心管中加入700微升磷酸緩沖液溶解樣品，在16°C，50000轉(zhuǎn)/分鐘條件下，離心4小時；之后每200微升取一次樣品，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定后，將目的蛋白較多的樣品用瓊脂糖凝膠CL-4B柱子純化，得到呈遞IL-33病毒樣顆粒疫苗。
[0015]所述步驟4)得到的呈遞IL-33病毒樣顆粒疫苗用于主動免疫治療哮喘。
[0016]所述編碼截斷的乙肝病毒核心抗原基因的核苷酸序列如下: catatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgactt
ctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctcagctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaatttggaagacggattcggtggcggtggcggaccagcatccagggaattagtagtcagctatgttaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactactgtggtttcacatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgaatatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcttacagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttt aa 。
[0017]所述編碼IL-33成熟片段基因的核苷酸序列如下: agcatccaaggaacttcacttttaacacagtctcctgcctccctgagtacatacaatgaccaatctgttagt
tttgttttggagaatggatgttatgtgatcaatgttgacgactctggaaaagaccaagagcaagaccaggtgctactacgctactatgagtctccctgtcctgcaagtcaatcaggcgacggtgtggatgggaagaaggtgatggtgaacatgagtcccatcaaagacacagacatctggctgcatgccaacgacaaggactactccgtggagcttcaaaggg gtgacgtctcgcctccggaacaggccttcttcgtccttcacaaaaagtcctcggactttgtttcatttgaatgcaagaatcttcctggcacttacataggagtaaaagataaccagctggctctagtggaggagaaagatgagagctgcaacaatattatgtttaagctctcgaaaatc。
[0018]所述截斷的乙肝病毒核心抗原與編碼IL-33成熟片段連接后的基因核苷酸序列如下:
catatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctcagctctgtatc gggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagct
attctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaatttggaagacggaagcatccaaggaacttcacttttaacacagtctcctgcctccctgagtacatacaatgaccaatctgttagttttgttttggagaatggatgttatgtgatcaatgttgacgactctggaaaagaccaagagcaagaccaggtgctactacgctactatgagtctccctgtcctgcaagtcaatcaggcgacggtgtggatgggaagaaggtgatggtgaacatgagtcccatcaaagacacagacatctggctgcatgccaacgacaaggactactccgtggagcttcaaaggggtgacgtctcgcctccggaacaggccttcttcgtccttcacaaaaagtcctcggactttgtttcatttgaatgcaagaatcttcctggcacttacataggagtaaaagataaccagctggctctagtggaggagaaagatgagagctgcaacaatattatgtttaagctctcgaaaatcttcggtggcggtggcggaccagcatccagggaattagtagtcagctatgttaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactactgtggtttcacatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgaatatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcttacagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgt ttaa。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點和效果如下:
1)制備簡單:利用基因工程技術(shù)在原核系統(tǒng)即可實現(xiàn)高水平的重組表達及易獲得有效純化；
2)免疫原性強:一個顆粒由180或240個亞基組成，因此允許插入的表位高拷貝的、高度有序的暴露在顆粒表面，這樣的結(jié)構(gòu)可破壞機體識別異與己的能力，有利打破耐受。
[0020]3)安全:乙肝核心抗原作為疫苗載體的安全性已在FDA批準的一項瘧疾疫苗的I/II期臨床試驗中獲得考察，無明顯的不良反應發(fā)現(xiàn)。
[0021]4)只需要有限的免疫次數(shù)和較低劑量的疫苗蛋白注射，即可以誘導強的可持續(xù)存在并作用的中和抗體。
[0022]5)本發(fā)明采用主動免疫的方法，通過基因重組的IL-33病毒樣顆粒疫苗，在小鼠中誘導強的、持續(xù)存在的中和性的自身抗體。
[0023]6)在哮喘模型中，HBcAg33誘導了從Th2偏向于Thl樣的應答。 [0024]7)顯著抑制了 BALF中的嗜酸性粒細胞、IL-33水平和杯狀細胞的粘液分泌從而抑制了氣道炎癥。
[0025]8)抑制了氣道對乙酰膽堿刺激所產(chǎn)生的氣道高反應性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1:重組質(zhì)粒pHBcAg33的構(gòu)建；
圖2:編碼IL-33成熟片段的誘導表達(左)和免疫印跡檢測(右)；
圖3:編碼IL-33成熟片段蛋白碘克沙醇密度梯度離心；
圖4:電鏡觀察到乙肝病毒核心抗原形成病毒樣顆粒；
圖5:電鏡觀察到編碼IL-33的成熟蛋白形成病毒樣顆粒；
圖6:沒有使用傳統(tǒng)佐劑的疫苗誘導了持續(xù)存在和高滴度的IL-33特異抗體；
圖7:疫苗滴鼻免疫誘導了系統(tǒng)的IgA反應；
圖8:疫苗滴鼻免疫和皮下免疫均能誘導IgG反應；
圖9-11:疫苗單獨使用以及和不同的佐劑聯(lián)合使用后的IgGl、IgG2a和IgGl/IgG2a反
應；
圖12:支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的嗜酸性粒細胞數(shù)目；
圖13:支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的IL-33水平；
圖14:肺組織病理切片，蘇木精一伊紅(H&E)染色和過碘酸雪夫染色；
圖15-17:疫苗免疫后，對粘液、血管周圍炎癥和支氣管周圍炎癥病理評分；
圖18-20:乙酰膽堿刺激后小鼠的呼吸道功能檢測，包括氣道阻力、組織阻力和組織彈性。
【具體實施方式】
[0027]下面通過實施例對本發(fā)明做進一步描述。
實施例
[0028]I)用RNAiso Plus從小鼠肺組織進行常規(guī)的總RNA提?。徊⒂媚孓D(zhuǎn)錄試劑盒通過常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄將得到的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA ;用設計的特異性引物將得到的總cDNA通過PCR擴增，得到編碼IL-33成熟片段基因，所述特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體如下:
編碼IL-33成熟片段基因的上游引物(5，端):gtggatccagcatccaaggaacttcac編碼IL-33成熟片段基因的下游引物(3’端):gtgaattcgattttcgagagcttaaac并在下列PCR體系(20微升)下:5’端引物:0.2微升，3’端引物:0.2微升，IOX PCRbuffer: 2微升，dNTP: 1.6微升，Taq酶:0.2微升，cDNA模板:1微升，雙蒸水:14.8微升，進行下列PCR擴增:94 °C預變性2min，94°C變性30S，52°C退火30S，72°C延伸45S，共30個循環(huán)，72 °C延伸lmin，得到PCR擴增產(chǎn)物，用常規(guī)純化回收試劑盒純化所得PCR擴增產(chǎn)物后，用BamH I和EcoR I酶切，酶切后再用試劑盒純化，得到編碼IL-33成熟片段基因；
2)、將編碼截斷的乙肝病毒核心抗原HBcAg基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中5’端和3’端分別有BamH I和EcoR I的酶切位點，并用內(nèi)切酶Nde I和Pst I酶切后克隆到pThioHisA中，得到質(zhì)粒pHBcAg ;然后再用BamH I和EcoR I將步驟I)得到的編碼IL-33成熟片段基因的DNA插入(連接)到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78-79位氨基酸之間，得到帶有目的蛋白的重組質(zhì)粒pHBcAg33，經(jīng)過生工生物工程(上海)股份有限公司測序，該目的基因與基因庫中的序列一致，為陽性克隆，其中連接體系(10微升)如下:載體:I微升，IL-33DNA:1微升，T4連接酶:1微升，IOX T4酶buffer:1微升，雙蒸水:6微升，室溫連接3小時；
3)、將步驟2)所得連接產(chǎn)物——重組質(zhì)粒pHBcAg33轉(zhuǎn)化到100微升大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞上；
4)、用IPTG誘導步驟3)的轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒PHBcAg33的大腸桿菌DH5α，高效表達IL-33目的蛋白，并用飽和度為40%和30%的硫酸銨、體積比為39%、33%和27%的碘克沙醇，對IL-33目的蛋白進 行下列密度梯度離心純化:
4.1)將25°C下IPTG誘導4小時的I升菌液離心后，收集菌體；
4.2)用0.02摩爾/升、pH 7.4的磷酸緩沖液20毫升，將步驟4.1)收集的菌體重新懸起來，用超聲波破碎菌體后離心分離，收集上清20毫升；在收集的20毫升上清中加入4.86克硫酸銨，室溫下放置30分鐘后離心，收集沉淀，所用硫酸銨在25°C條件下達到的飽和度為40% ;再用20毫升飽和度為30%的硫酸銨溶液洗滌收集的沉淀，共洗滌三次；最后用0.02摩爾/升、pH 7.4的磷酸緩沖液溶解洗滌后的沉淀，每次用500微升溶解，共溶解4次；再通過體積比為27%、33%和39%的碘克沙醇進行下列密度梯度離心:從5毫升離心管的底部到頂部依次加入1.4毫升體積比為39%、33%和27%的碘克沙醇，加完后每個體積比的碘克沙醇之間形成明顯界限，室溫放置過夜后，每個體積比的碘克沙醇之間的界限消失，在所述離心管中加入700微升磷酸緩沖液進行溶解，在16°C、50000轉(zhuǎn)/分鐘條件下，離心4小時；之后每200微升取一次樣品，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定后，將目的蛋白較多的樣品用瓊脂糖凝膠CL-4B柱子純化，得到呈遞IL-33病毒樣顆粒疫苗，_70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0029]本發(fā)明實施例得到的疫苗經(jīng)下列動物實驗:
一、檢測實施例所得疫苗的免疫原性
O免疫原:單獨的實施例的IL-33病毒樣顆粒疫苗(2(^g)、實施例的IL-33病毒樣顆粒疫苗+弗氏佐劑、實施例的IL-33病毒樣顆粒疫苗+鋁佐劑。
[0030]2 )動物:6-8周Balb/c雌鼠，隨機分3組，4只/組。
[0031]3)方法:分別在對應組的小鼠背部皮下三點免疫I)的三種免疫原，每隔一周免疫一次,共三次；每一次免疫后一周大腿靜脈采血檢測抗體水平(血清稀釋度為1:1000)。
[0032]4)檢測結(jié)果顯示:與兩個佐劑組相比，單獨使用IL-33病毒樣顆粒疫苗也能誘導強的針對自身分子的中和性抗體。第二次激發(fā)后(第五周)，IL-33特異的抗體滴度達到256000。在免疫的小鼠中，IL-33特異的抗體持續(xù)存在至少三個月。其中有弗氏佐劑組的抗體水平更高、更強，持續(xù)的時間最長。
[0033]二、實施例的IL-33病毒樣顆粒疫苗單獨使用以及和兩種佐劑聯(lián)合使用的免疫應答特點
O免疫原:單獨的實施例的IL-33病毒樣顆粒疫苗(分為背部皮下免疫和滴鼻免疫兩組，2(^g)、實施例的IL-33病毒樣顆粒疫苗+弗氏佐劑、實施例的IL-33病毒樣顆粒疫苗+招佐劑。
[0034]2 )動物:6-8周Balb/c雌鼠，隨機分4組，4只/組。
[0035]3)方法:第一組小鼠背部皮下三點免疫IL-33病毒樣顆粒疫苗；第二組小鼠滴鼻免疫IL-33病毒樣顆粒疫苗；第三組小鼠背部皮下三點免疫IL-33病毒樣顆粒疫苗+弗氏佐劑；第四組小鼠背部皮下三點免疫IL-33病毒樣顆粒疫苗+鋁佐劑。每隔一周免疫一次，共三次；每一次免疫后一周大腿靜脈采血檢測抗體水平(血清稀釋度為1:1000)。
[0036]4)結(jié)果顯示:檢測滴鼻免疫和使用不同佐劑的皮下免疫的IgGJP IgG2a反應,其中使用了不同佐劑的皮下免疫組中，誘導的IgG1A平相似；而滴鼻免疫顯著降低了 IgG1水平；在4個組中，誘導了不同的IgG2a水平。這些結(jié)果顯示，滴鼻免疫和弗氏佐劑免疫組產(chǎn)生了最強的IgG2a反應，而鋁佐劑和IgG2a水平最低。滴鼻免疫組和鋁佐劑組有顯著差異。滴鼻免疫組的IgG1AgG2a比例顯著低于皮下免疫。
[0037]三、實施例的IL-33病毒樣顆粒疫苗用于過敏性氣道炎癥的動物模型
O免疫原:實施例的IL-33病毒樣顆粒疫苗20 μ g、20 μ g載體、磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS, 0.02摩爾/升，0.15摩爾/升氯化鈉，pH 7.4)對照。
[0038]2)動物:6-8周Balb/c雌鼠，隨機分3組，8只/組。
[0039] 3)方法:分別在對應組的小鼠背部皮下三點免疫I)的三種免疫原，每隔一周免疫一次,共三次；每一次免疫后一周,大腿靜脈采血檢測抗體水平(血清稀釋度為1:1000)。第三次免疫后一周，每一只鼠用500微升的雞卵清白蛋白溶液腹腔注射致敏，其中雞卵清白蛋白溶液是用10微克雞卵清白蛋白與2毫克鋁佐劑溶解在500微升磷酸鹽緩沖液中得到的溶液，腹腔注射致敏后2周，每一只鼠用50微克的雞卵清白蛋白溶液滴鼻致敏，每天一次，連續(xù)三天，該滴鼻用的雞卵清白蛋白溶液是用50微克的雞卵清白蛋白溶解在40微升的磷酸鹽緩沖液中得到的溶液；第三天滴鼻致敏后24小時殺小鼠，并從心臟采血，分離血清用于抗體水平檢測；再用I毫升冰冷的0.15摩爾/升氯化鈉，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液灌洗肺，得到支氣管肺泡灌洗液(簡稱BALF)用于檢測IL-33水平；再將肺組織保存在福爾馬林中，用于組織病理分析。
[0040]4)結(jié)果顯示:實施例的IL-33病毒樣顆粒疫苗顯著抑制了氣道炎癥和粘液分泌。在OVA哮喘小鼠動物模型中，與載體組和PBS模型對照組相比，實施例的IL-33病毒樣顆粒疫苗免疫組的小鼠支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞和IL-33水平明顯降低；在肺組織中，H&E染色顯示疫苗免疫組的小鼠肺組織炎癥和杯狀細胞增生明顯降低。
[0041]四、實施例的IL-33病毒樣顆粒疫苗用于乙酰膽堿刺激的小鼠檢測肺組織和氣道功能
O免疫原:實施例的IL-33病毒樣顆粒疫苗、乙肝病毒核心抗原載體、磷酸鹽緩沖液(0.02摩爾/升即0.15摩爾/升氯化鈉，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液)。
[0042]2) fIexiVent小動物呼吸機檢測氣道活性。
[0043]3)動物:6-8周Balb/c雌鼠，隨機分3組，3-4只/組。
[0044]4)方法:第一組小鼠背部皮下三點免疫實施例的IL-33病毒樣顆粒疫苗；第二組小鼠用乙肝病毒核心抗原載體免疫；第三組小鼠用磷酸鹽緩沖液免疫；每隔一周免疫一次，共三次。麻醉小鼠，通過在氣管內(nèi)插入一個套管霧化，三組小鼠分別接受一系列的乙酰膽堿稀釋液的刺激。
[0045]5)結(jié)果顯示:IL_33病毒樣顆粒疫苗抑制了對乙酰膽堿刺激產(chǎn)生的氣道高反應性。呼吸功能檢測包括氣道阻力、組織阻力和組織彈性。在載體對照組中所有這些指標都增加；而疫苗免疫組中，所有這些指標都被明顯抑制。
[0046]本發(fā)明提供的疫苗，經(jīng)主動免疫，即通過疫苗的方式誘導針對自身蛋白的抗體來調(diào)控靶細胞、靶分子功能，只需要有限的免疫次數(shù)和較低劑量的疫苗蛋白注射，即可以誘導強的可持續(xù)存在并作用的中和抗體；產(chǎn)生的中和抗體是自身蛋白，不存在被動給予的異源拮抗物對機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的不良作用，也不需要單克隆抗體同源化處理。實現(xiàn)主動免疫策略的關(guān)鍵是打破免疫耐受，誘導中和性自身抗體。外源性T細胞表位的引入是重要的環(huán)節(jié)。常規(guī)手段是把自身蛋白與異源性蛋白或表位化學偶聯(lián)或基因重組，這樣的疫苗能誘導自身抗體，但免疫原性常較弱，需使用強的免疫佐劑。
[0047]本發(fā)明所述的IL-33病毒樣顆粒疫苗是疫苗研究的一個熱點，尤其對于自身抗體的誘導，病毒樣顆粒具有獨特的優(yōu)勢。其特點為:1)制備簡單:利用基因工程技術(shù)在原核系統(tǒng)即可實現(xiàn)高水平的重組表達及易獲得有效純化；2)免疫原性強:一個顆粒由180或240個亞基組成，因此允許插入的表位高拷貝的、高度有序的暴露在顆粒表面，這樣的結(jié)構(gòu)可破壞機體識別異與己的能力，有利打破耐受。此外，乙肝核心抗原的特異序列可直接激活B細胞的抗原呈遞功能，其能力是常規(guī)抗原呈遞細胞的IO5倍。這樣的病毒樣顆粒疫苗可誘導高強度的、持續(xù)的自身抗體應答，而不需要常規(guī)的免疫佐劑；3)安全:乙肝核心抗原作為疫苗載體的安全性已在FDA批準的一項瘧疾疫苗的I/II期臨床試驗中獲得考察，無明顯的不良反應發(fā)現(xiàn)；此外，利用乙肝核心抗原的大量動物實驗也未發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)明顯不良病征。
[0048]本發(fā)明采用主動免疫的方法，通過基因重組的病毒樣顆粒疫苗，在小鼠中誘導中和性的自身抗體，以抑制哮喘疾病機理中重要的細胞因子如IL-13，TNFa和IL-33的功能，探討對過敏原反復刺激所引起的慢性哮喘特征的發(fā)展所產(chǎn)生的影響。通過對關(guān)鍵疾病指標的發(fā)展及相關(guān)的調(diào)控和效應細胞與分子的研究，本發(fā)明對揭示慢性哮喘疾病機理以及IL-13, TNFa和IL-33在其中的作用具有重要意義，同時為哮喘的臨床治療提供新的思路。
[0049]序列表
編碼IL-33成熟片段基因的上游引物(5，端):gtggatccagcatccaaggaacttcac編碼IL-33成熟片段基因的下游引物(3’端):gtgaattcgattttcgagagcttaaac編碼截斷的乙肝病毒核心抗原基因的核苷酸序列:catatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctcagctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaatttggaagacggattcggtggcggtggcggaccagcatccagggaattagtagtcagctatgttaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactactgtggtttcacatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgaatatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcttacagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttt aa
編碼 IL-33 成熟片段基因的核苷酸序列:agcatccaaggaacttcacttttaacacagtctcctgcctccctgagtacatacaatgaccaatctgttagttttgttttggagaatggatgttatgtgatcaatgttgacgactctggaaaagaccaagagcaagaccaggtgctactacgctactatgagtctccctgtcctgcaagtcaatcaggcgacggtgtggatgggaagaaggtgatggtgaacatgagtcccatcaaagacacagacatctggctgcatgccaacgacaaggac tact ccgt ggagcttcaaaggg gtgacgtctcgcctccggaacaggccttcttcgtccttcacaaaaagtcctcggactttgtttcatttgaatgcaagaatcttcctggcacttacataggagtaaaagataaccagctggctctagtggaggagaaagatgagagctgcaacaatattatgtttaagctctcgaaaatc
編碼截斷的乙肝病毒核心抗原與編碼IL-33成熟片段基因連接后的基因的核苷酸序
列:
catatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctcagctctgtatc gggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagct
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【權(quán)利要求】
1.一種主動免疫治療慢性哮喘的呈遞IL-33的VLP疫苗構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟: 1)、從小鼠提取IL-33總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄得到IL-33總cDNA，用設計的特異性引物將得到的總cDNA通過PCR擴增，得到編碼IL-33成熟片段基因，所述特異性引物設計如下: 編碼IL-33成熟片段基因的上游引物(5，端):gtggatccagcatccaaggaacttcac 編碼IL-33成熟片段基因的下游引物(3’端):gtgaattcgattttcgagagcttaaac 2)、將編碼截斷的乙肝病毒核心抗原HBcAg克隆到pThioHisA載體，再將步驟I)得到的編碼IL-33成熟片段基因插入到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78-79位氨基酸之間，得到重組質(zhì)粒pHBcAg33 ； 3)、將步驟2)得到的重組質(zhì)粒PHBcAg33轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α或BL21感受態(tài)細胞上； 4)、用IPTG誘導步驟3)的轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒PHBcAg33的大腸桿菌DH5α或BL21，高效表達IL-33目的蛋白，并用飽和度為40%和30%的硫酸銨、體積比為39%、33%和27%的碘克沙醇，對IL-33目的蛋白進行密度梯度離心純化，最后用瓊脂糖凝膠CL-4B柱子純化IL-33目的蛋白，得到呈遞IL-33的病毒樣顆粒疫苗。
2.如權(quán)利要求1所述的主動免疫治療慢性哮喘的呈遞IL-33的VLP疫苗構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟2)的 重組質(zhì)粒構(gòu)建如下: 編碼截斷的HBcAg基因由專業(yè)公司合成，其中5’端和3’端分別有BamH I和EcoR I的酶切位點，并用內(nèi)切酶Nde I和Pst I酶切后克隆到pThioHisA中，得到質(zhì)粒pHBcAg ;然后再用BamH I和EcoR I將編碼IL-33成熟片段基因的DNA插入到pHBcAg中，得到帶有目的蛋白的重組質(zhì)粒pHBcAg33。
3.如權(quán)利要求1所述的主動免疫治療慢性哮喘的呈遞IL-33的VLP疫苗構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟4)中的目的蛋白的誘導和純化經(jīng)過下列步驟: 1)將25°C下IPTG誘導4小時的I升菌液離心后，收集菌體； 2)用0.02摩爾/升、pH 7.4的磷酸緩沖液20毫升，將步驟I)收集的菌體重新懸起來，用超聲波破碎菌體后離心分離，收集上清20毫升；在收集的20毫升上清中加入4.86克硫酸銨，室溫下放置30分鐘后離心，收集沉淀，所述硫酸銨在25°C條件下達到的飽和度為40% ;再用20毫升飽和度為30%的硫酸銨溶液洗滌收集的沉淀，共洗滌三次；最后用0.02摩爾/升、pH 7.4的磷酸緩沖液溶解洗滌后的沉淀，每次用500微升溶解，共溶解4次；再通過體積比為27%、33%和39%的碘克沙醇進行密度梯度離心，具體操作為；從5毫升離心管的底部到頂部依次加入1.4毫升體積比為39%、33%和27%的碘克沙醇，加完后每個體積比的碘克沙醇之間形成明顯界限，室溫放置過夜；次日每個體積比的碘克沙醇之間的界限消失，向離心管中加入700微升磷酸緩沖液溶解樣品，在16°C，50000轉(zhuǎn)/分鐘條件下，離心4小時；之后每200微升取一次樣品，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定后，將目的蛋白較多的樣品用瓊脂糖凝膠CL-4B柱子純化，得到呈遞IL-33病毒樣顆粒疫苗。
4.如權(quán)利要求1所述的主動免疫治療慢性哮喘的呈遞IL-33的VLP疫苗構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟4)得到的呈遞IL-33病毒樣顆粒疫苗用于主動免疫治療哮喘。
【文檔編號】A61K39/385GK104001168SQ201410248884
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月7日
【發(fā)明者】馬雁冰, 龍瓊, 黃惟巍, 姚宇峰, 楊旭, 孫文佳, 金曉媚, 李楊, 褚曉杰, 劉存寶 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所