八肽膽囊收縮素在制藥中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及八肽膽囊收縮素在制藥領(lǐng)域中的新用途。該產(chǎn)品具有顯著改善長(zhǎng)期使用METH引起的行為變化，有利于預(yù)防和治療METH長(zhǎng)期使用所致神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展；還可以顯著減少M(fèi)ETH引起的神經(jīng)細(xì)胞的死亡，預(yù)防長(zhǎng)期使用METH引起的神經(jīng)損傷；還可抑制METH引起的小膠質(zhì)細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的生成，表明CCK-8發(fā)揮中樞抗炎作用，對(duì)改善長(zhǎng)期使用METH引起的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥具有重要意義。
【專利說(shuō)明】八肽膽囊收縮素在制藥中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及八肽膽囊收縮素(CCK-8)的用途，具體的說(shuō)是八肽膽囊收縮素在制藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK, PZ)，又稱縮膽囊素，是從豬小腸提取物中分離出來(lái)的、由33個(gè)氨基酸組成的多肽，于1928年、1943年被證明并提純。CCK廣泛存在于胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其通過(guò)與靶細(xì)胞膜上的特異性受體CCKR (cholecystokininreceptor，膽囊收縮素受體)結(jié)合而發(fā)揮細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。CCKR是細(xì)胞膜上的一類糖蛋白，屬于G蛋白偶聯(lián)超家族。不同結(jié)構(gòu)類型的CCKR組織分布不同，介導(dǎo)不同的細(xì)胞效應(yīng)。1980 年 Sankaran 等在膜腺腺泡中發(fā)現(xiàn)了 CCKlR (cholecystokinin I receptor,膽囊收縮素I受體)，同年在腦中又發(fā)現(xiàn)了一種藥理學(xué)性質(zhì)完全不同的CCK2R (cholecystokinin 2receptor,膽囊收縮素2受體)。CCKlR主要分布在外周組織，但也有部分在中樞神經(jīng)組織分布；CCK2R主要存在于中樞神經(jīng)組織，但也有部分在外周組織分布。
[0003]CCK與其受體結(jié)合后發(fā)揮多種生理功能。CCK在胃腸道的主要生理作用是刺激胰酶分泌與合成，增強(qiáng)胰碳酸氫鹽分泌和胃排空，刺激膽囊收縮與奧狄氏括約肌松弛，還可增加肝膽汁分泌，調(diào)節(jié)小腸、結(jié)腸運(yùn)動(dòng)等多方面功能；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)的作用，參與了痛覺(jué)感受、食欲調(diào)節(jié)、記憶等生理過(guò)程，亦有調(diào)節(jié)垂體激素釋放的作用，與驚恐、焦慮、癲癇等病理表現(xiàn)有關(guān)，同時(shí)，CCK還具有控制中樞呼吸節(jié)律及調(diào)節(jié)心血管緊張的作用。
[0004]用胰蛋白酶消化33肽的CCK，可使其羧基端8個(gè)氨基酸解裂出來(lái)，稱為八肽膽囊收縮素(CCK-8)，CCK-8具有整個(gè)CCK分子的全部活性，是膽囊收縮素-促胰酶素分子的最小活性片段。在CCK分子羧基端第7位的酪氨酸是硫酸鹽化的，其上的硫酸酯基團(tuán)的存在為發(fā)揮其生物活性所必需。CCK-8的氨基酸序列為H-Asp-Tyr (SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2，分子式為C49H62NltlO16S3，分子量為1143.27。已知可以用作膽囊收縮診斷試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供八肽膽囊收縮素的新用途，即在制藥中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
本發(fā)明提供了八肽膽囊收縮素在制備治療或改善長(zhǎng)期使用甲基苯丙胺引起的行為異常藥中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供了八肽膽囊收縮素在制備治療或預(yù)防甲基苯丙胺引起神經(jīng)損傷藥中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明提供了八肽膽囊收縮素在制備治療或預(yù)防甲基苯丙胺引起的中樞炎癥損傷藥中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明通過(guò)如下藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了八肽膽囊收縮素在制藥領(lǐng)域中所具有的上述新用途。[0010]制備CCK-8注射液:從美國(guó)Sigma公司購(gòu)買硫酸化的CCK-8，用生理鹽水將33.7μ L、25%~28%氨水稀釋至10 mL,得0.05 mo I/L氨水(現(xiàn)用現(xiàn)配)。將5 mg CCK-8與0.05 mol/L氨水5 mL充分振蕩混勻，即得I mg/mL CCK-8溶液，50 μ L/管分裝，冰浴操作，_80°C保存，有效期半年。用前用生理鹽水稀釋至I mg/L濃度，避免反復(fù)凍融。
[0011]UCCK-8抑制甲基苯丙胺(METH)引起的C57BL/6J小鼠行為敏化 試驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備:
①試驗(yàn)動(dòng)物:C57BL/6J小鼠(SPF級(jí))，體重18~22g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。
[0012]②飼養(yǎng)條件:小鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，6只/籠,室溫22±1°C,濕度50%±10%，光照時(shí)間7:00-19:00，食水不限。
[0013]③40mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，將其固定在小鼠腦立體定位儀上，進(jìn)行側(cè)腦室埋管手術(shù)。手術(shù)后適應(yīng)性飼養(yǎng)(單籠飼養(yǎng))I周，然后隨機(jī)分組，每組12只。所有小鼠在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先預(yù)適應(yīng)3d，并觀察記錄30min內(nèi)自發(fā)行為活動(dòng)數(shù)據(jù)，以作為基礎(chǔ)值以及篩除離群個(gè)體的依據(jù)。
[0014]1.1、建立行為敏化模型
行為敏化模型的建立過(guò)程分為3個(gè)階段:行為敏化誘導(dǎo)期、行為敏化戒斷期與行為敏化檢測(cè)期。
[0015]取準(zhǔn)備好的試驗(yàn)動(dòng)物72只，隨機(jī)分為6組，每組12只，第I組為對(duì)照組，第2飛組為實(shí)驗(yàn)組，具體如下:
第I組:生理鹽水組(Saline組)；
第 2 組:METH (lmg/kg)組；
第 3 組:METH (2mg/kg)組；
第 4 組:CCK-8 (0.1yg)組;
第 5 組:CCK-8 (0.01yg)組；
第 6 組:CCK-8 (0.0Olyg)組。
[0016]其中，第廣3組小鼠采用腹腔注射(ip)方式給藥，每天早上同一時(shí)間測(cè)體重，實(shí)驗(yàn)中按10mL/kg給藥體積計(jì)算給藥量；第4飛組小鼠采用微量加樣器側(cè)腦室給藥，給藥體積為2 μ L/只。
[0017]1.1.1行為敏化誘導(dǎo)期(dl-d7):
第I組小鼠按I次/d腹腔注射給予生理鹽水，dl、d3、d5天給予生理鹽水后，立即將小鼠放入自發(fā)活動(dòng)箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動(dòng)數(shù)據(jù)。
[0018]第2組小鼠按lmg/kg、I次/d腹腔注射給予METH，dl、d3、d5天給予METH后，立即將小鼠放入自發(fā)活動(dòng)箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動(dòng)數(shù)據(jù)。
[0019]第3組小鼠按2mg/kg、l次/d腹腔注射給予METH，dl、d3、d5天給予METH后，立即將小鼠放入自發(fā)活動(dòng)箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動(dòng)數(shù)據(jù)。
[0020]第4、5、6 組小鼠分別按 0.1 μ g/2 μ L、0.01 μ g/2 μ L、0.001 μ g/2 μ L 的量側(cè)腦室注射給予CCK-8，dl、d3、d5天給予CCK-8后15min將小鼠放入自發(fā)活動(dòng)箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動(dòng)數(shù)據(jù)。
[0021] 1.1.2行為敏化戒斷期(d8_dl3):第I飛組小鼠正常條件下飼養(yǎng)6天，不進(jìn)行任何處理。
[0022]1.1.3行為敏化檢測(cè)期(dl4):
第I組小鼠按I次/d腹腔注射給予生理鹽水，給予生理鹽水后立即將小鼠放入自發(fā)活動(dòng)箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動(dòng)數(shù)據(jù)。
[0023]第2組小鼠按lmg/kg、I次/d腹腔注射給予METH，給予METH后立即將小鼠放入自發(fā)活動(dòng)箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動(dòng)數(shù)據(jù)。
[0024]第3組小鼠按2mg/kg、I次/d腹腔注射給予METH，給予METH后立即將小鼠放入自發(fā)活動(dòng)箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動(dòng)數(shù)據(jù)。
[0025]第4、5、6 組小鼠分別按 0.1 μ g/2 μ L、0.01 μ g/2 μ L、0.001 μ g/2 μ L 的量側(cè)腦室注射CCK-8，注射CCK-8后15min后將小鼠放入自發(fā)活動(dòng)箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動(dòng)數(shù)據(jù)。
[0026]對(duì)小鼠的自發(fā)行為活動(dòng)進(jìn)行記錄的數(shù)據(jù)包括:總距離、活動(dòng)速度、活動(dòng)范圍。
[0027]對(duì)第f 3組小鼠自發(fā)行為活動(dòng)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，dl4天給予METH后，第2組、第3組小鼠的自發(fā)活動(dòng)距離明顯增高，另外通過(guò)比較第2組與第3組數(shù)據(jù)可以知道，METH時(shí)間、劑量依賴性的增高動(dòng)物的活動(dòng)距離，綜合以上分析，行為敏化模型制備成功。
[0028]對(duì)第1、4、5組小鼠自發(fā)行為活動(dòng)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，CCK-8側(cè)腦室給藥對(duì)動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)無(wú)顯著影響，CCK-8本身不能誘導(dǎo)動(dòng)物形成行為敏化。
[0029]1.2、METH (lmg/kg組)誘導(dǎo)的行為敏化模型建立過(guò)程中，CCK-8不同時(shí)期與METH伴隨給藥對(duì)長(zhǎng)期使用METH動(dòng)物行為變化的影響。
[0030]1.2.1、CCK-8誘導(dǎo)期給藥抑制METH誘導(dǎo)的行為敏化的形成:
1.2.1.1、行為敏化誘導(dǎo)期(dl-d7):
取準(zhǔn)備好的試驗(yàn)動(dòng)物48只，隨機(jī)分為4組，每組12只，第I組為對(duì)照組，第2~4組為實(shí)驗(yàn)組，具體如下:
第I組:METH (lmg/kg) +生理鹽水組；
第 2 組:METH (lmg/kg) +CCK-8 (0.1 μ g)組;
第 3 組:METH (lmg/kg) +CCK-8 (0.01 μ g)組；
第 4 組:METH (lmg/kg) +CCK-8 (0.001 μ g)組。
[0031]以上各組，METH采用腹腔注射方式給藥，每天早上同一時(shí)間測(cè)體重，實(shí)驗(yàn)中按10mL/kg計(jì)算給藥體積及給藥濃度；生理鹽水及CCK-8采用微量加樣器側(cè)腦室給藥，給藥體積為2 μ L/只。
[0032]各組每天同一時(shí)間分別給藥(第I組:生理鹽水2 μ L ;第2組:CCK_8 0.1 μ g ;第3組:CCK-8 0.01 μ g ;第4組:CCK-8 0.001 μ g)，給予生理鹽水(或給予CCK-8) 15 min后，各組小鼠按lmg/kg、l次/d腹腔注射給予METH，dl、d3、d5天給予METH后，立即將小鼠放入自發(fā)活動(dòng)箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的行為活動(dòng)數(shù)據(jù)。 [0033]1.2.1.2、行為敏化戒斷期(d8-dl3):
第1~4組小鼠正常條件下飼養(yǎng)6天，不進(jìn)行任何處理。
[0034]1.2.1.3、行為敏化檢測(cè)期(dl4):各組小鼠給予按lmg/kg、I次/d腹腔注射給予METH，給予METH后立即將小鼠放入自發(fā)活動(dòng)箱中，記錄30 min小鼠的自發(fā)行為活動(dòng)數(shù)據(jù)。
[0035]對(duì)f 4組小鼠自發(fā)行為活動(dòng)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，CCK-8 (0.1 μ g、0.01 μ g、0.0Olyg)誘導(dǎo)期與METH伴隨給藥，可以明顯抑制檢測(cè)期當(dāng)天動(dòng)物行為敏化的表達(dá)。
[0036]結(jié)論:CCK_8伴隨給藥可以降低動(dòng)物對(duì)METH的敏感性，改善長(zhǎng)期使用METH引起的行為異常。
[0037]1.2.2、CCK-8檢測(cè)期給藥抑制METH引起的行為敏化的表達(dá):
1.2.2.1、行為敏化誘導(dǎo)期(dl-d7):
取準(zhǔn)備好的試驗(yàn)動(dòng)物48只，所有小鼠每天同一時(shí)間采用腹腔注射給予METH(lmg/kg、l次/d)，dl、d3、d5天給藥后立即將小鼠放入自發(fā)活動(dòng)箱中，記錄小鼠在30min內(nèi)的自發(fā)行為活動(dòng)。d7天給藥之后，將小鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，第I組為對(duì)照組，第2~4組為實(shí)驗(yàn)組。
[0038]1.2.2.2、行為敏化戒斷期(d8_dl3):
第1~4組小鼠正常條件下飼養(yǎng)6天，不進(jìn)行任何處理。
[0039]1.2.2.3、行為敏化檢測(cè)期(dl4):
第I組:METH (lmg/kg) +生理鹽水組；
第 2 組:METH (lmg/kg) +CCK-8 (0.1 μ g)組;
第 3 組:METH (lmg/kg) +CCK-8 (0.01 μ g)組；
第 4 組:METH (lmg/kg) +CCK-8 (0.001 μ g)組。
[0040]以上各組，METH采用腹腔注射方式給藥，每天早上同一時(shí)間測(cè)體重，實(shí)驗(yàn)中按10mL/kg計(jì)算給藥體積及給藥濃度；生理鹽水及CCK-8采用微量加樣器側(cè)腦室給藥，給藥體積為2 μ L/只。
[0041]各組分別給藥(第I組:生理鹽水2yL ;第2組:CCK-8 0.1 μ g ;第3組:CCK-8
0.01 μ g ;第4組:CCK-8 0.001 μ g)，給予生理鹽水(或給予CCK-8) 15 min后，各組小鼠按lmg/kg、I次/d腹腔注射給予METH，給予METH后立即將小鼠放入自發(fā)活動(dòng)箱中，記錄30 min內(nèi)小鼠自發(fā)行為活動(dòng)數(shù)據(jù)。
[0042]對(duì)f 4組小鼠的自發(fā)行為活動(dòng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，CCK-8 (0.1 μ g、0.01 μ g、0.001 μ g)檢測(cè)期當(dāng)天給藥,可以明顯抑制METH lmg/kg引起的動(dòng)物行為敏化。
[0043]結(jié)論:CCK_8改善長(zhǎng)期使用METH引起的行為異常，具有保護(hù)功能。
[0044]2、CCK-8對(duì)甲基苯丙胺引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
PC-12細(xì)胞來(lái)源于褐家鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，具神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究。
[0045]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-12細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為IO5/ml，以IO4/100 μ L/孔接種于96孔板。
[0046]實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組及METH (0.1,0.5、1.0,2.0,4.0mmoI/L)組、CCK-8 (0.1,0.5、
1.0 μ mol/L)組。CCK-8 和 METH 共處理細(xì)胞組；實(shí)驗(yàn)分組為 METH 2 mmol/L 組；METH 2 mmol/L+CCK-8 (0.1、0.5、1.0 μ mol/L) ; METH I mmol/L 組;METH I mmol/L+ CCK-8 (0.1、0.5、1.0μ mol/L)組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)只加培養(yǎng)基的空白孔為調(diào)零孔。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合后加藥。24 h后加MTT 20 μ I/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加DMSO 150 μ I/孔，置于搖床上震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解后，置酶標(biāo)儀λ =490處測(cè)各孔吸光度。細(xì)胞存活率按公式計(jì)算:細(xì)胞存活率=D490 (處理組一空白)/D490 (對(duì)照組一空白)X 100%。
[0047]結(jié)果:如圖5~8所示。由圖5可以看出，]\^1'!1(0.1、0.5、1.0、2.0、4.0臟01/1)劑量依賴性的降低PC12細(xì)胞的存活率，表現(xiàn)為對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的直接損傷作用。由圖6可以看出，CCK-8 (0.1,0.5、1.0 μ mol/L)單獨(dú)處理細(xì)胞對(duì)PC12細(xì)胞存活率沒(méi)有影響，表明CCK-8本身對(duì)神經(jīng)細(xì)胞沒(méi)有損傷作用。由圖7、8可以看出，CCK-8(0.1、0.5、1.0 μ mol/L)與METH(lmmol/L、2 mmol/L)共處理細(xì)胞，可以明顯減輕METH對(duì)細(xì)胞的損傷，具有保護(hù)功能。
[0048]結(jié)論:CCK_8本身對(duì)神經(jīng)細(xì)胞無(wú)損害，但可以明顯減輕METH對(duì)細(xì)胞的損傷。
[0049]3、CCK_8對(duì)甲基苯丙胺引起的促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1 β、IL-6和MCPl)的抑制作用
大量研究表明長(zhǎng)期使用METH引起神經(jīng)損傷的原因之一，是激活小膠質(zhì)細(xì)胞，使其分泌的促炎因子水平升高。Ν9細(xì)胞為小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系，具備小膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)功能。
[0050]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ν9細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為105/ml，然后接種至6孔板，每孔2mL，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合，撤血清，放置6h，加藥處理細(xì)胞。
[0051]實(shí)驗(yàn)劑量分對(duì)照組、METH(0.1,0.5、1.0,2.0mmol/L)組和 LPS (I μ g/mL)組，處理時(shí)間3h。實(shí)驗(yàn)時(shí)間分為METH ImM處理lh、3h、6h、12h組。之后加CCK-8和METH共處理細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為METH 2 mmol/L組、METH 2 mmol/L+CCK-8 (0.01,0.1、1.0 μ mol/L)組、CCK_8(1.0μ mol/L)組;METH I mmol/L 組、METH I mmol/L+CCK-8 (0.1、0.5、1.0 μ mol/L), CCK-8 (1.0μ mol/L)組,處理時(shí)間3h。
[0052]收取各孔細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)熒光定量PCR。結(jié)果以GAPDH作為內(nèi)參基因，AACt法分析基因的相對(duì)表達(dá)。將對(duì)照組看作100%，其余各組均與之比較，將各組與對(duì)照組的比值作為統(tǒng)計(jì)值。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。
[0053]結(jié)果:如圖9~20所示。從圖9~12可以看出ImM METH處理N9細(xì)胞3h會(huì)引起促炎癥因子TNF-a、IL-1 β、IL-6和MCPl表達(dá)明顯升高。從圖13~16可以看出ImM METH處理N9細(xì)胞l~12h會(huì)引起促炎因子TNF-a、IL-1 β , IL-6和MCPl表達(dá)明顯升高。從圖17~20可以看出，CCK-8與METH共處理細(xì)胞，可以明顯抑制METH引起的促炎癥因子表達(dá)升高，而CCK-8單獨(dú)處理細(xì)胞對(duì)促炎癥因子表達(dá)無(wú)明顯作用。
[0054]結(jié)論:CCK_8本身對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)無(wú)影響，可以明顯抑制METH引起的促炎癥因子表達(dá)升高。
[0055]從以上結(jié)果，可以得出本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
1、八肽膽囊收縮素(CCK-8)具有顯著改善長(zhǎng)期使用METH引起的行為變化，有利于預(yù)防和治療METH長(zhǎng)期使用所致神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。
[00562、CCK-8可以顯著減少M(fèi)ETH引起的神經(jīng)細(xì)胞的死亡，預(yù)防長(zhǎng)期使用METH引起的神經(jīng)損傷。
[0057]3、CCK_8可抑制METH引起的小膠質(zhì)細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的生成，表明CCK-8發(fā)揮中樞抗炎作用，對(duì)改善長(zhǎng)期使用METH引起的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥具有重要意義?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0058]圖1為METH lmg/kg、2mg/kg能夠誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠行為敏化的形成(Mean土 SD，n=12)。*表示與對(duì)照組比較，/X0.05 ；**表示與對(duì)照組比較，/X0.01 ；***表示與對(duì)照組比較，P<Q.001。
[0059]圖2為CCK-8 0.1,0.01,0.001 μ g不能誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠形成行為敏化(Mean土SD, η=12)。
[0060]圖3為CCK-8 0.1,0.01,0.001 μ g誘導(dǎo)期給藥，能夠抑制C57BL/6J小鼠行為敏化的形成和表達(dá)(Mean土SD，n=12) Z表示與對(duì)照組比較/X0.05廣表示與對(duì)照組比較/X0.01 ；***表示與對(duì)照組比較/X0.001。
[0061]圖4為CCK-8 0.1,0.01,0.001 μ g檢測(cè)期給藥，能夠抑制C57BL/6J小鼠行為敏化的表達(dá)(Mean土SD，n=12)。*表示與對(duì)照組比較/X0.05 ；***表示與對(duì)照組比較/X0.001。
[0062]圖5為METH 0.1,0.5、L 0,2.0,4.0 mM劑量依賴性抑制PC12細(xì)胞存活率(Mean土SD，n=3)。_表示與對(duì)照組比較/X0.001。
[0063]圖6 為 CCK-8 0.1,0.5,1.0 μ M 對(duì) PC12 細(xì)胞存活率沒(méi)有影響(Mean土SD，n=3)。
[0064]圖7為CCK-8 0.5、1.0 μ M能夠改善METH ImM引起的PC12細(xì)胞存活率的降低(Mean土SD，n=3)。*** 表示與對(duì)照組比較/X0.001，### 表示與 METH ImM 組比較7X0.001。 [0065]圖8為CCK-8 0.5、1.0 μ M能夠改善METH 2mM引起的PC12細(xì)胞存活率的降低(Mean土SD，n=3)。_表示與對(duì)照組比較/X0.001 ；##表示與METH 2 mM組比較/X0.01，表示與METH 2 mM組比較7X0.001。
[0066]圖9為METH不同劑量2.0、1.0,0.5,0.1 mM處理細(xì)胞3h引起的TNF-α分泌水平變化廣表示與對(duì)照組比較/X0.01 ；***表示與對(duì)照組比較/X0.001。LPS組為陽(yáng)性對(duì)照藥物組，可以明顯引起細(xì)胞炎癥因子分泌增高。
[0067]圖10為METH不同劑量2.0、1.0、0.5、0.1mM處理細(xì)胞3h引起的IL-1 β分泌水平變化，***表示與對(duì)照組比較/X0.001。LPS組為陽(yáng)性對(duì)照藥物組，可以明顯引起細(xì)胞炎癥因子分泌增高。
[0068]圖11為METH不同劑量2.0,1.0,0.5,0.1 mM處理細(xì)胞3h引起的IL-6分泌水平變化，*表示與對(duì)照組比較/X0.05 ；***表示與對(duì)照組比較/X0.001。LPS組為陽(yáng)性對(duì)照藥物組，可以明顯引起細(xì)胞炎癥因子分泌增高。
[0069]圖12為METH不同劑量2.0、1.0、0.5、0.1 mM處理細(xì)胞3h引起的MCP-1分泌水平變化，***表示與對(duì)照組比較/X0.001。LPS組為陽(yáng)性對(duì)照藥物組，可以明顯引起細(xì)胞炎癥因子分泌增高。
[0070]圖13為分泌水平變化廣*表示與對(duì)照組比較/X0.001。
[0071]圖14為METH I mM處理lh、3h、6h、12h引起的IL-1 β分泌水平變化，*表示與對(duì)照組比較/X0.05 ；**表示與對(duì)照組比較/X0.01 ；***表示與對(duì)照組比較/X0.001。
[0072]圖15為METH I mM處理lh、3h、6h、12h引起的IL-6分泌水平變化，***表示與對(duì)照組比較/X0.001。
[0073]圖16為METH I mM處理lh、3h、6h、12h引起的MCP-1分泌水平變化，***表示與對(duì)照組比較/X0.001。[0074]圖 17 為 CCK-8 (0.01,0.1、1.0 μ Μ)對(duì) I mM METH 處理 3h 引起的 TNF-α 分泌水平變化的影響(Mean土 SD，n=3)，*表示與對(duì)照組比較/X0.05 ；#表示與METH組比較7X0.05。
[0075]圖 18 為 CCK-8(0.01、0.1、1.0 μ M)對(duì) I mM METH 處理 3h 引起的 IL-1 β 分泌水平變化的影響(Mean土SD，n=3)，_表示與對(duì)照組比較/X0.001 表示與METH組比較7X0.05 ；表示與METH組比較7X0.001。
[0076]圖19 為 CCK-8(0.01,0.1、1.0 μ Μ)對(duì) I mM METH 處理 3h 引起的 IL-6 分泌水平變化的影響(Mean土SD，n=3)，***表示與對(duì)照組比較/X0.001 ；##表示與METH組比較/X0.01 ；漏表示與METH組比較P < 0.001。
[0077]圖20 為 CCK-8 (0.01、0.1、1.0 μ M)對(duì) I mM METH 處理 3h 引起的 MCP-1 分泌水平變化的影響(Mean土SD，n=3)，**表示與對(duì)照組比較/X0.01 ；##表示與METH組比較/X0.01 ；表示與METH組比較7X0.001。
【具體實(shí)施方式】
[0078]下面將描述本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。
[0079]實(shí)施例1:配制CCK-8注射液
從美國(guó)Sigma公司購(gòu)買硫酸化的CCK-8 ;用生理鹽水將33.7 μ L 25%~28%氨水稀釋至10 mL,得0.05 mol/L氨水(現(xiàn)用現(xiàn)配)。
[0080]將5 mg CCK-8與0.05 mol/L氨水5 mL充分振蕩混勻，即得I mg/mL CCK-8溶液，50 μ L/管分裝，冰浴操作，_80°C保存，有效期半年。用前用生理鹽水稀釋至I mg/L濃度，避免反復(fù)凍融。
[0081]細(xì)胞給藥按摩爾濃度計(jì)算好濃度，進(jìn)行稀釋。加入到無(wú)血清無(wú)雙抗細(xì)胞培養(yǎng)基中。
[0082]實(shí)施例2:動(dòng)物側(cè)腦室給藥方法
I mg/mL CCK-8溶液用無(wú)菌注射用水稀釋20倍至0.05 μ g/ μ L，再10倍稀釋至0.005、
0.0005 μ g/ μ L,給藥體積 2 μ L。
[0083]注射時(shí)將套管針芯拔出，插入內(nèi)注射管(外徑0.67 mm，內(nèi)徑0.3 mm),連接PE管和微量注射器進(jìn)行注射。側(cè)腦室的注射套管定位數(shù)據(jù):前因后0.22 mm,前因旁0.94 mm ;顱骨外表面下2.20 mm，(AP，-0.22 ； ML, ±0.94 ； DV, -2.20)，內(nèi)注射管定位前囟后0.22 _，前囟旁 0.94 mm ;顱骨外表面下 2.40 mm (AP，-0.22 ； ML, ± 0.94 ; DV, -2.40)。側(cè)腦室注射體積2 μ 1，注射速度I μ 1/min，注射完后留針5 min。
[0084]CCK-8屬于多肽類藥物，多肽和蛋白質(zhì)類藥物穩(wěn)定性差，在胃腸道中易被水解，且存在能否被吸收的問(wèn)題，故多使用注射劑，使用方法為靜脈給藥。
[0085]但是由于此類藥物的生物半衰期短，臨床應(yīng)用時(shí)常常需要重復(fù)注射給藥，給患者帶來(lái)痛苦和負(fù)擔(dān)。為了減少給藥次數(shù)，減少事故發(fā)生率和重復(fù)注射引起的副反應(yīng)，近年來(lái)多肽類藥物的注射用緩釋或控釋給藥系統(tǒng)，CCK-8可按現(xiàn)有常規(guī)方法制備成緩釋劑，也可以制成微粒給藥系統(tǒng)，還可以制成可注射的凝膠劑，也能起到緩釋作用。
[0086]療程根據(jù)一般藥物治療周期，7天為一個(gè)周期。但具體治療時(shí)間長(zhǎng)短，應(yīng)根據(jù)患者腦損傷程度以及患者濫用METH用藥量進(jìn)行確定。
[0087]可能存在的禁忌癥及注意事項(xiàng):CCK_8在外周具有收縮膽囊的功能，可能會(huì)引起消化功能異常等副作用。因此，在使用本藥物的同時(shí)，應(yīng)注意監(jiān)測(cè)膽囊收縮功能及消化功能。
【權(quán)利要求】
1.八肽膽囊收縮素在制備治療或改善長(zhǎng)期使用甲基苯丙胺引起的行為異常藥中的應(yīng)用。
2.八肽膽囊收縮素在制備治療或預(yù)防甲基苯丙胺引起神經(jīng)損傷藥中的應(yīng)用。
3.八肽膽囊收縮素在制備治療或預(yù)防甲基苯丙胺引起的中樞炎癥損傷藥中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K38/08GK103990106SQ201410257237
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】叢斌, 馬春玲, 文迪, 茍紅艷, 安美玲 申請(qǐng)人:河北醫(yī)科大學(xué)