一種山油柑堿的提取分離方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種山油柑堿的提取分離方法與應用，提取分離方法包括以下步驟：（1）將山油柑根粉碎，加入乙醇水溶液，進行負壓空化混懸固液萃取，得到萃取液，萃取液回收試劑得總生物堿浸膏；（2）總生物堿浸膏加入大孔樹脂，拌勻、干燥后裝柱，醇水溶液洗脫，收集山油柑堿流分，濃縮得山油柑堿粗品；（3）將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化得山油柑堿。本發(fā)明方法具有所得產(chǎn)品含量高，操作簡單，提率高等優(yōu)點。本發(fā)明方法所制化合物為開發(fā)應用新一代天然來源的抗腫瘤藥物開拓了新徑。
【專利說明】—種山油柑堿的提取分離方法與應用

【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種山油柑堿的提取分離方法與應用，具體是涉及一種應用高速逆流色譜技術從山油柑根中分離純化山油柑堿的方法，還涉及山油柑堿在抗腫瘤藥物中的應用。

【背景技術】
[0002]山油柑堿(Acronycine),分子式C2tlH19NO3,分子量32L 36,難溶于水，可溶于乙醇、氯仿等有機溶劑。
[0003]山油甜堿是從蕓香科棺物山油甜Acronychia pedunculata (L.)Miq.根中提取分離的一種生物堿類化合物。實驗研究表明，山油柑堿具有能抑制細胞的有絲分裂和降低吉田腹水瘤細胞分裂指數(shù)。能影響癌細胞核酸的生成，顯著降低L615小顯脾中RNA的含量，而對正常動物組織中RNA和DNA的含量無顯著影響。抗動物癌譜較廣，在17種瘤譜中，對其中12種瘤譜有顯著抑制作用，對目前臨床使用的化療藥物不敏感的髓性白血病C-1498，漿細胞骨髓瘤X_5563(接近人體腫瘤)和Shingi癌-115均有抑制作用。
[0004]現(xiàn)有提取山油柑堿的報道并不多見，市場上也尚未有山油柑堿對照品的出售，因此提供一種山油柑堿的提取分離方法與應用則很有必要，可以為其后續(xù)研究提供支持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種山油柑堿的提取分離方法與應用，本發(fā)明方法制得的山油柑堿質(zhì)量好，純度高。
[0006]為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案:
一種山油柑堿的提取分離方法，其特征在于包括以下步驟:
Cl)提取:將山油柑根粉碎，加入7-12倍藥材重量的70-90%乙醇水溶液，空化混懸20-40min,進行負壓空化混懸固液萃取1_2次,得到萃取液；
(2)大孔樹脂富集:萃取液回收乙醇得總生物堿浸膏，加入大孔樹脂，拌勻、干燥后裝柱，醇水溶液洗脫，收集山油柑堿流分，濃縮得山油柑堿粗品；
(3)純化:將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化，以氯仿-甲醇-水為兩相溶劑系統(tǒng)，ELSD檢測器監(jiān)測，收集目標流分，回收試劑，真空干燥得產(chǎn)品。
[0007]步驟(1)所述乙醇水溶液濃度為75%，用量為10倍藥材重量。
[0008]步驟(1)所述混懸時間為30min，萃取2次。
[0009]步驟(2)所述萃取液濃縮至密度1.1-1.2g/ml。
[0010]步驟(2)所述大孔樹脂為DlOl型，醇水溶液為85%的乙醇溶液。
[0011]步驟(3)所述氯仿-甲醇-水體積比為(5-9): (15-17): (6_8)。
[0012]本發(fā)明提取分離方法制得的化合物在抗腫瘤藥物中的應用。
[0013]本發(fā)明提取分離方法制得的化合物進行抗腫瘤活性實驗表明:該化合物具有較強的抗腫瘤活性，在天然新藥開發(fā)中具有良好的應用前景。
[0014]本發(fā)明提取分離方法制得的山油柑堿采用MTT法(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法)進行抗腫瘤活性測試。
[0015]試驗用細胞株:
HeLa:人子宮頸癌細胞株；HEC_1:人子宮內(nèi)膜癌細胞株；T_98和U251-SP:人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株；HLE:人肝癌細胞株和HMV-1:人黑色素瘤細胞株。
[0016]方法:(1)0.25%胰酶消化對數(shù)生長期細胞，10%NBS的RPMI 1640調(diào)細胞濃度50000個/ml。96孔板10ul/孔。設溶劑對照，每組3平行孔。37°C，5%C0 2、95%空氣的培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24h，棄上清。
[0017](2)加藥物5個10倍稀釋的濃度(溶劑為有二甲亞砜和水)，為10 _4 mol/L。
[0018](3)細胞連續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加入10 μ I 5mg/ml的MTT溶液(以無血清培養(yǎng)基配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。
[0019](4)吸去上清。加入200μ1 DMS0，輕輕振蕩以使甲臜完全溶解。570nm處用酶標儀測定OD值。
[0020](5)計算抑制率(%)=(對照OD-藥物0D) /對照0D*100%
實驗結果:本發(fā)明化合物的抑制率以相對于對照(添加DMS0)的結果如下表1:
表1山油柑堿的腫瘤細胞增值抑制率％_ __

【權利要求】
1.一種山油柑堿的提取分離方法，其特征在于包括以下步驟: (1)提取:將山油柑根粉碎，加入7-12倍藥材重量的70-90%乙醇水溶液，空化混懸20-40min,進行負壓空化混懸固液萃取1_2次,得到萃取液； (2)大孔樹脂富集:萃取液回收乙醇得總生物堿浸膏，加入大孔樹脂，拌勻、干燥后裝柱，醇水溶液洗脫，收集山油柑堿流分，濃縮得山油柑堿粗品； (3)純化:將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化，以氯仿-甲醇-水為兩相溶劑系統(tǒng)，ELSD檢測器監(jiān)測，收集目標流分，回收試劑，真空干燥得產(chǎn)品。
2.如權利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟(1)所述乙醇水溶液濃度為75%，用量為10倍藥材重量。
3.如權利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟(1)所述混懸時間為30min，萃取2次。
4.如權利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟(2)所述萃取液濃縮至密度.1.1-1.2g/ml。
5.如權利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟(2)所述大孔樹脂為DlOl型，醇水溶液為85%的乙醇溶液。
6.如權利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟(3)所述氯仿-甲醇-水體積比為(5-9): (15-17): (6-8)。
7.如權利要求1飛所述提取分離方法制得的化合物在抗腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】A61K31/4741GK104072503SQ201410266748
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月16日 優(yōu)先權日:2014年6月16日
【發(fā)明者】劉東鋒, 楊成東 申請人:南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司