microRNA-101抑制劑在制備預防或治療骨關節(jié)炎藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種microRNA-101抑制劑在制備預防或治療骨關節(jié)炎藥物中的應用，屬于生物醫(yī)學領域。在骨關節(jié)炎動物模型中，給予膝關節(jié)腔注射microRNA-101的模擬物能引起關節(jié)軟骨損傷加重，引起軟骨特異性的外基質基因II型膠原和蛋白聚糖的表達水平下降。而給予膝關節(jié)腔注射microRNA-101的抑制劑，則能顯著改善其軟骨損傷，延緩骨關節(jié)炎動物模型的軟骨損傷過程，起到軟骨保護的作用。所以，通過抑制microRNA-101的表達，即通過microRNA-101的抑制劑能夠減緩軟骨組織的降解，起到穩(wěn)定軟骨細胞表型的作用，從而控制關節(jié)軟骨破壞并促進軟骨修復。這表明microRNA-101的抑制劑可用于制備控制骨關節(jié)破壞并促進軟骨修復的藥物。
【專利說明】microRNA-101抑制劑在制備預防或治療骨關節(jié)炎藥物中 的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域，特別涉及一種microRNA-101抑制劑在制備預防或治 療骨關節(jié)炎的藥物中的應用。

【背景技術】
[0002] microRNA (簡稱miRNA)是一類內源性非編碼單鏈RNA，長度為21-25個核苷酸，在 進化上具有高度保守性、時序性和組織特異性，幾乎存在于所有多細胞生物體中。到目前為 止，專門收錄miRNA序列的數(shù)據庫miRBase涵蓋了包括植物、動物和病毒在內的超過8000 種miRNA，其中，有超過800個人類miRNA存在于miRBase數(shù)據庫中。據推測miRNA調節(jié)著 人類三分之一的基因，參與機體諸多生理病理過程。miRNA主要作用于靶基因的3'非翻譯 區(qū)直接引起靶基因 mRNA的降解或者抑制靶基因 mRNA的翻譯。
[0003] miRNA能夠參與調節(jié)細胞功能，在人類疾病的調控過程中具有重要的作用。目前初 步研究了與骨關節(jié)炎軟骨損傷相關的miRNA。Miyaki報道，白細胞介素（以下簡稱IL-1 β ) 刺激后的人軟骨細胞中，miRNA-140的表達下降，過表達miRNA-140可以抑制由IL-Ιβ引 起的軟骨細胞外基質降解酶表達的上調，使由IL-Ιβ引起的軟骨細胞外基質基因蛋白聚 糖表達的下降（參見 Miyaki S 等，MicroRNA_140is expressed in differentiated human articular chondrocytes and modulates interleukin-lresponses. Arthritis and rheumatism2009, 60(9) :2723-2730)。在 IL-1 β 刺激后的軟骨細胞中，miRNA-34a得到高表 達，抑制miRNA-34a的表達后能夠抵消IL-1 β引起的C〇12al蛋白和誘導型一氧化氮合酶 Nos2(iN0S)表達的下降，通過抑制miRNA_34a可以預防軟骨破壞（參見Abouheif MM等， Silencing microRNA_34a inhibits chondrocyte apoptosis in a rat osteoarthritis model in vitro. Rheumatology (Oxford) 2010, 49 (11) :2054-2060)。與之相反，IL-Ιβ 抑制 軟骨細胞中miRNA-27b的表達引起microRNA-27b的直接靶基因 MMP13 (軟骨細胞外基質降 解的另一種酶）表達的增加，導致軟骨細胞外基質降解（參見Akhtar N等，Micr〇RNA-27b regulates the expression of matrix metalloproteinasel3in human osteoarthritis chondrocytes.Arthritis and rheumatism2010,62(5):1361-1371)。還有研究表明， miRNA-675可以促進引起軟骨特異性的外基質基因 II型膠原的表達（Dudek KA等，Type II collagen expression is regulated by tissue-specific miR_675in human articular chondrocytes. J Biol Chem2010, 285(32):24381-24387)〇
[0004] 可見，在骨關節(jié)炎軟骨損傷治療方面，尋求一種新的用于治療骨關節(jié)炎軟骨損傷 的miRNA具有重要的意義。


【發(fā)明內容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術的問題，本發(fā)明實施例提供了一種microRNA-ΙΟ?的抑制劑在 制備預防或治療骨關節(jié)炎的藥物中的應用。所述技術方案如下：
[0006] 第一方面，本發(fā)明實施例提供了一種microRNA-101的抑制劑在制備預防或治療 骨關節(jié)炎的藥物中的應用。
[0007] 具體地，所述 microRNA-101 的核苷酸序列為 5' -UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3'。
[0008] 具體地，作為優(yōu)選，所述microRNA-101進一步被修飾，修飾后的microRNA-101保 持所述microRNA-101的活性。
[0009] 具體地，所述修飾選自核糖修飾、堿基修飾、磷酸骨架修飾中的至少一種。
[0010] 具體地，作為優(yōu)選，所述microRNA-101中的核苷酸進一步被部分替換或增減，核 苷酸進一步被部分替換或增減后的microRNA-101保持所述microRNA-101的活性。
[0011] 第二方面，本發(fā)明實施例提供了一種用于預防或治療骨關節(jié)炎的藥物組合物，所 述藥物組合物包括有效量的microRNA-101的抑制劑。
[0012] 具體地，作為優(yōu)選，所述藥物組合物還包括與所述microRNA-101的抑制劑配伍的 其他藥類以及藥學上可接受的載體和/或輔料。
[0013] 具體地，作為優(yōu)選，所述藥物組合物的劑型選自溶液劑、懸液劑、乳劑、控制釋放劑 或持續(xù)釋放制劑。
[0014] 具體地，作為優(yōu)選，所述藥物組合物的給藥方式選自注射給藥或經口給藥。
[0015] 本發(fā)明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是：
[0016] 本發(fā)明實施例提供了一種microRNA-101的抑制劑在制備預防或治療骨關節(jié) 炎的藥物中的應用，在碘乙酸誘導的大鼠骨關節(jié)炎動物模型中，給予大鼠膝關節(jié)腔注射 microRNA-101的模擬物能引起大鼠骨關節(jié)炎軟骨損傷加重，引起軟骨特異性的外基質基 因 II型膠原和蛋白聚糖的表達水平下降。給予大鼠膝關節(jié)腔注射microRNA-101的抑制 劑則能顯著改善其軟骨損傷，延緩骨關節(jié)炎動物模型的軟骨損傷進程，起到軟骨的保護作 用。所以通過抑制microRNA-101的表達，即通過microRNA-101的抑制劑能夠減緩軟骨 組織的降解，起到穩(wěn)定軟骨細胞表型的作用，從而控制骨關節(jié)破壞并促進軟骨修復。上述 microRNA-101的抑制劑對穩(wěn)定軟骨細胞表型，預防軟骨細胞外基質降解的作用通過調控 軟骨細胞中與軟骨細胞分化，表型穩(wěn)定相關的關鍵轉錄因子Sox9基因得以實現(xiàn)。這表明 microRNA-101的抑制劑可用于制備控制骨關節(jié)破壞并促進軟骨修復的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于 本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他 的附圖。
[0018] 圖la是本發(fā)明實施例1提供的碘乙酸誘導的骨關節(jié)炎軟骨損傷模型中， microRNA-101表達水平示意圖；
[0019] 圖lb是本發(fā)明實施例1提供的碘乙酸誘導的骨關節(jié)炎軟骨損傷模型中，Sox9mRNA 的表達水平示意圖；
[0020] 圖lc是本發(fā)明實施例1提供的碘乙酸誘導的骨關節(jié)炎軟骨損傷模型中，Sox9蛋 白的表達水平不意圖；
[0021] 圖2a是本發(fā)明實施例1提供的各動物模型組的大鼠膝關節(jié)軟骨冷凍切片的共聚 焦顯微鏡觀察結果示意圖；
[0022] 圖2b是本發(fā)明實施例1提供的各動物模型組的miR-101a的表達水平示意圖；
[0023] 圖2c是本發(fā)明實施例1提供的各動物模型組的Sox9mRNA表達水平示意圖；
[0024] 圖2d是本發(fā)明實施例1提供的各動物模型組的Sox9蛋白的表達水平示意圖；
[0025] 圖3a是本發(fā)明實施例1提供的各動物模型組的軟骨組織的觀察結果示意圖；
[0026] 圖3b是本發(fā)明實施例1提供的各動物模型組7天后的組織學評分結果示意圖；
[0027] 圖3c是本發(fā)明實施例1提供的各動物模型組14天后的組織學評分結果示意圖；
[0028] 圖4是本發(fā)明實施例1提供的各動物模型組的軟骨組織的HE染色結果示意圖（放 大倍數(shù)10倍，標尺=400微米）；
[0029] 圖5是本發(fā)明實施例1提供的各動物模型組的軟骨組織的蛋白聚糖染色結果示意 圖（放大倍數(shù)10倍，標尺=400微米）；
[0030] 圖6是本發(fā)明實施例1提供的各動物模型組的II型膠原免疫組化染色結果示意 圖（放大倍數(shù)10倍，標尺=400微米）。

【具體實施方式】
[0031] 為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合附圖對本發(fā)明實施方 式作進一步地詳細描述。
[0032] 骨關節(jié)炎（osteoarthritis，簡稱0A)又稱骨關節(jié)病，退行性關節(jié)病，是由創(chuàng)傷、關 節(jié)畸形等多種原因引起的關節(jié)軟骨退行性變。臨床可產生關節(jié)疼痛、活動受限和關節(jié)畸形 甚至功能障礙。由于0A不易治愈，嚴重妨礙工作、影響生活質量，成為50歲以后喪失勞動 力的第二位常見原因，僅次于心臟病。對0A的臨床治療的主要是通過減輕疼痛、緩解癥狀、 延緩疾病為目的。舉例來說，藥物治療：使用緩解疼痛癥狀的藥物（如鎮(zhèn)痛藥、非留體抗炎 藥等）、激素、軟骨保護劑（如關節(jié)腔注射透明質酸鈉、口服氨基葡萄糖等）。手術治療：使 用關節(jié)鏡下關節(jié)沖洗、鉆孔術、微骨折術、骨軟骨移植、軟骨細胞或間充質干細胞移植。而對 于關節(jié)畸形嚴重者，需行截骨矯形術；關節(jié)破壞、功能障礙嚴重者需行人工關節(jié)置換術。上 述這些治療方法只能減輕骨關節(jié)已出現(xiàn)的病變癥狀，而無法逆轉或中止其病變癥狀。
[0033] 研究發(fā)現(xiàn)：0A的發(fā)生和發(fā)展包括幾個重要病理改變：關節(jié)軟骨退變、軟骨下骨硬 化、滑膜炎癥和骨贅形成。其中，關節(jié)軟骨退變是骨關節(jié)炎中最初產生，目前治療手段無 法逆轉的，也是最重要的病理改變。關節(jié)軟骨由軟骨細胞和細胞外基質（extracellular matrix，ECM)組成。軟骨細胞是關節(jié)軟骨中唯一的細胞類型，能夠合成及分解細胞外基質。 軟骨的細胞外基質主要由Π 型膠原（Collagen type II，C0L2A1)和蛋白聚糖（Aggrecan) 組成。軟骨細胞和細胞外基質共同維持關節(jié)軟骨的結構以及其細胞外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。當發(fā)生 0A時，這種穩(wěn)態(tài)被打破，表現(xiàn)為軟骨細胞外基質的降解、軟骨細胞的退變等。在0A過程中軟 骨細胞的退變及細胞外基質降解主要分兩個階段：生物合成階段和降解階段。在生物合成 階段，軟骨細胞嘗試去修復損傷的軟骨細胞外基質。但是，由于合成細胞外基質的基因表達 水平很低，不能有效地合成足夠的細胞外基質。在降解階段，在炎性因子的作用下，軟骨細 胞產生細胞外基質降解的相關酶類將消化細胞外基質，引起細胞外基質降解。同時，炎性因 子還可以引起合成細胞外基質的基因表達進一步下降，細胞外基質的合成更加不足，導致 惡性循環(huán)，引起軟骨的急劇破壞。因此，軟骨細胞外基質合成的不足以及軟骨細胞外基質的 降解是0A軟骨損傷中主要的病理變化。
[0034] 根據對0A病理過程的研究，為了減緩骨關節(jié)炎癥狀，并有效地逆轉或中止骨關節(jié) 炎，本發(fā)明進一步研究了在0A的病理過程中起重要作用的基因、基因調節(jié)網絡、表觀遺傳 學改變以及相關miRNA，提供了一種microRNA-101的抑制劑在制備預防或治療骨關節(jié)炎的 藥物中的應用。
[0035] 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，在碘乙酸誘導的骨關節(jié)炎軟骨破壞的大鼠模型中，大鼠軟 骨組織中microRNA-101 (即microRNA-lOla)水平顯著升高。給予大鼠膝關節(jié)腔注射 microRNA-101的模擬物，能引起大鼠骨關節(jié)炎軟骨損傷加重。給予大鼠膝關節(jié)腔注射 microRNA-101的抑制劑則能顯著改善其軟骨損傷，起到軟骨的保護作用。所以通過抑制 microRNA-101的表達，即通過microRNA-101的抑制劑能夠減緩軟骨組織的降解，起到穩(wěn)定 軟骨細胞表型的作用，從而控制骨關節(jié)破壞并促進軟骨修復。上述microRNA-101的抑制劑 對穩(wěn)定軟骨細胞表型，預防軟骨細胞外基質降解的作用通過調控軟骨細胞中與軟骨細胞分 化，表型穩(wěn)定相關的關鍵轉錄因子Sox9基因得以實現(xiàn)?？梢?，microRNA-101的抑制劑能夠 用于制備預防或治療骨關節(jié)炎的藥物。
[0036] 可以理解的是，microRNA-101的抑制劑具有本領域公知含義。microRNA-101的抑 制劑的設計和制備方法也為本領域所公知。舉例來說，本領域技術人員根據microRNA-101 設計其反義RNA，或者將microRNA-101與特定的物質接觸，檢測microRNA-101的表達，并選 擇特異抑制microRNA-101表達的候選物質，以得到microRNA-101的抑制劑。可以理解的 是，microRNA-101的抑制劑可以是能夠特異抑制microRNA-101對靶基因的調控作用的任 何物質，也可以是在細胞中特異抑制microRNA-101表達的物質，還可以是與microRNA-101 具有特異性相互作用的物質，例如與microRNA-101特異性結合的物質，或者特異抑制 microRNA-101與DICER相互作用的物質。具體地，microRNA-101的抑制劑可以為一種小分 子核酸，其能夠有效抑制microRNA-101的表達。
[0037] 具體地，microRNA-101 的核苷酸序列為 5' -UACAGUACU⑶GAUAACUGAA-3'。
[0038] 由于microRNA-101核苷酸序列在各物種間（如小鼠、大鼠、豬等）十分保守，所 以本發(fā)明實施例中，microRNA-101選自人的microRNA-101，其在miRbase中的序列號為： MI0000103,核苷酸序列為5' -UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3'，其具有加重骨關節(jié)炎癥狀的特 異性生物活性。
[0039] 本發(fā)明實施例中，microRNA-101既指含有5' -UACAGUACU⑶GAUAACUGAA-3'序列的 內生的、非編碼的微小RNA，也可以指能行使microRNA-101功能的核心序列的microRNA分 子，還可以指體外合成的具有5' -UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3'序列的微小RNA分子（也可 稱之為microRNA-ΙΟ?的模擬物）。其中上述微小RNA分子的體外合成方法為本領域公知。 因此，microRNA-ΙΟ?的抑制劑可以為根據上述microRNA-ΙΟ?得到的microRNA-ΙΟ?的抑制 劑。
[0040] 具體地，作為優(yōu)選，microRNA-ΙΟ?進一步被修飾，修飾后的microRNA-ΙΟ?保持該 microRNA-ΙΟ? 的活性。
[0041] 本發(fā)明實施例中，為了保持microRNA-101在體外操作時的穩(wěn)定性，可以對其進行 進一步地修飾，但是，修飾后的microRNA-101保持該microRNA-101的活性?？梢岳斫獾氖牵?microRNA-101的抑制劑可以為根據上述的、修飾后的microRNA-101得到的抑制劑。
[0042] 其中，"microRNA-101的活性"指的是microRNA-101能夠引起軟骨特異性的外基 質基因 II型膠原（Col2Al)和蛋白聚糖（Aggrecan)的表達水平下降、引起軟骨損傷加重的 特異性生物活性。具體地，上述修飾選自核糖修飾、堿基修飾、磷酸骨架修飾中的至少一種。
[0043] 具體地，作為優(yōu)選，microRNA-101中的核苷酸進一步被部分替換或增減，核苷酸進 一步被部分替換或增減后的microRNA-101保持microRNA-101的活性。
[0044] 其中，"microRNA-101的活性"同樣指的是microRNA-101能夠引起軟骨特異性的 外基質基因 II型膠原（Col2Al)和蛋白聚糖（Aggrecan)的表達水平下降、引起軟骨損傷加 重的特異性生物活性。
[0045] 第二方面，本發(fā)明實施例提供了一種用于預防或治療骨關節(jié)炎的藥物組合物，該 藥物組合物包括有效量的microRNA-101的抑制劑。
[0046] 含有有效量的microRNA-101的抑制劑的藥物組合物，其同樣具有microRNA-101 的抑制劑的特異性作用，即穩(wěn)定軟骨細胞表型，預防軟骨細胞外基質降解。
[0047] 其中，"有效量"是指對人或動物體產生功能或活性，且可被人或動物所接受的量。
[0048] 當microRNA-101的抑制劑為一種小分子核酸時，其能夠有效抑制microRNA-101 的表達。進一步地，該microRNA-101抑制劑中的核苷酸進一步被部分替換或增減，核苷酸 進一步被部分替換或增減后的microRNA-101的抑制劑保持抑制microRNA-101表達的活 性。
[0049] 具體地，作為優(yōu)選，該藥物組合物還包括與microRNA-101的抑制劑配伍的其他藥 類以及藥學上可接受的載體和/或輔料。
[0050] 當microRNA-101的抑制劑用于預防或治療骨關節(jié)炎時，其可以單獨使用，也可以 與其他可配伍的藥類以及藥學上可接受的載體和/或輔料配合使用。其中，"藥學上可接受 的載體和/或輔料"指的是適用于人活動物而無過度不良副反應（如毒性、刺激和變態(tài)反 應）的，即具有合理的效益/風險比的載體和/或輔料。
[0051] 具體地，該載體可以為納米顆粒、脂質體、膽固醇、殼聚糖及病毒等。
[0052] 具體地，作為優(yōu)選，該藥物組合物的劑型選自溶液劑、懸液劑、干粉劑、乳劑、控制 釋放劑或持續(xù)釋放制劑。該藥物組合物的給藥方式選自注射給藥（例如，靜脈注射、關節(jié)腔 局部注射或肌肉注射等）或經口給藥。
[0053] 以下將通過具體的實施例進一步地說明本發(fā)明。
[0054] 在以下具體實施例未注明條件者，均按照常規(guī)條件或者制造商建議的條件進行。 所用試劑或儀器未注明生產廠商者均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品。
[0055] 其中，microRNA-101的模擬物合成自上海吉凱公司，產品編號：G⑶950817。
[0056] microRNA-101的抑制劑合成自上海吉凱公司，產品編號：G⑶950818。
[0057] 實施例1
[0058] 1)碘乙酸誘導骨關節(jié)炎動物模型建立
[0059] 將SD大鼠仰臥位固定在助手手中，術者左手觸摸大鼠的關節(jié)間隙，髕韌帶。然后 用26號針頭穿過大鼠的髕韌帶，感覺到有一種破空感，證明針頭進入關節(jié)腔，用微量進樣 器注射碘乙酸（2mg的碘乙酸溶解至50μ1 PBS(磷酸鹽緩沖溶液）中）。正常飲食，讓大鼠 在籠中自由活動。
[0060] 2)動物分組
[0061] 將32只（共64膝）體質量150g的SD大鼠平均分為4組，分別包括：第一組（只 注射碘乙酸不進行miRNA干預）；第二組（注射碘乙酸，并利用對照miRNA進行干預；第三 組（注射碘乙酸，進行microRNA-101的模擬物干預，即過表達microRNA-101組）；第四組 (注射碘乙酸，進行microRNA-101的抑制劑干預，即抑制microRNA-101表達組）。同一只 大鼠的兩個膝關節(jié)分別造成不同的處理組。
[0062] 3)實驗動物進行miRNA干預治療
[0063] 在注射碘乙酸3天后，對SD大鼠開始進行miRNA干預，每3天一次，直至實驗中止。
[0064] 4)動物處死、取材
[0065] 分別在注射碘乙酸后的第7天及第14天，過量麻醉法處死SD大鼠，取其膝關節(jié)， 經修整后放入固定液中。
[0066] 5)組織學評價
[0067] SD大鼠處死后，股骨（每個組中有8個樣品）的前端部被切斷，然后在4%多聚甲 醛（PH7. 4)中固定48小時，4°C下然后將樣品在快速脫鈣液中脫鈣2天。脫鈣標本進行修 整，梯度乙醇脫水，包埋在石蠟中。切成5 μ m厚矢狀切片并進行蘇木精-伊紅染色（簡稱HE 染色）和甲苯胺藍染色，II型膠原抗體進行免疫組化分析。組織學評分采用改良的mankin 評分方法° (參見 Mankin, H. J.，Dorfman，H.，Lippiello, L. &Zarins，A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. The Journal of bone and joint surgery. American volume53, 523-537 (1971).)
[0068] 6)免疫熒光法分析大鼠膝關節(jié)軟骨中microRNA-lOl的表達
[0069] 大鼠的膝關節(jié)軟骨（第1天注射后）在PBS中漂洗，并包埋在0CT化合物。利用 冰凍切片機切成8微米厚的冷凍切片于載玻片上。然后，將切片用H 〇echst33342染液染色 5分鐘。PBS洗滌3次，將載玻片于共聚焦顯微鏡下觀察。
[0070] 7) RNA 抽提以及 Real-time PCR 分析
[0071] 用TRIzol試劑在抽提MIA大鼠膝關節(jié)軟骨中提取總RNA。分離的RNA進行反轉 錄，和實時使用ABI步驟一加 QPCR系統(tǒng)進行PCR分析儀（ABI，福斯特城，加利福尼亞州，美 國）用SYBR選擇主混合物（ABI)。Real-time PCR的條件如下：50°C 2分鐘，95°C下進行2 分鐘，隨后95°C 15秒，進行40個循環(huán)的，60°C 30秒。添加溶解曲線以確定沒有非特異性擴 增。Real-time PCR的引物如下：
[0072] Sox9 (FW)，5' - AGGAAGCTGGCAGACCAGTA-3' 和（RV)， 5'-ACGAAGGGTCTCTTCTCGCT-3' ；
[0073] 1 8 S RNA FW，5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT_3'，和 RV， 5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3' 。
[0074] 對于microRNA-101的逆轉錄、表達分析，采用Bulge-loop?miRNA試劑盒根據說明 書進行操作（購于廣州銳博生物）。使用2- Λ Λ CT方法測定Sox9和miR-101的表達。
[0075] 8)蛋白質分離和免疫印跡
[0076] 用裂解緩沖液提取蛋白質（50mM的Tris-鹽酸，pH為7.4，150mM氯化鈉，1%ΝΡ-40 和0. 1 %十二烷基硫酸鈉），濃度測定使用BCA蛋白測定試劑盒（Pierce公司），使用牛血清 白蛋白作為標準品。蛋白質在SDS-PAGE凝膠（10% )中1. 5小時，然后在4°C下電轉移至硝 酸纖維素膜2小時。一抗（II型膠原）1 :4000稀釋后4°C過夜；辣根過氧化物酶標記的二 抗1 :1000稀釋室溫下孵育1小時。通過化學發(fā)光法檢測蛋白表達水平。β-actin(Sigma 公司，1:10000稀釋）用作內參。
[0077] 統(tǒng)計分析
[0078] 組間差異的顯著性用方差分析（AN0VA)分析計算。同一組的結果采用Student-t 檢驗進行評價。P值小于0.05被認為具有顯著統(tǒng)計學差異。所有數(shù)據以均數(shù)土標準差表 /_J、1 〇
[0079] 研究結果
[0080] microRNA-101和Sox9基因在第一組大鼠膝關節(jié)軟骨中的表達
[0081] 為了檢查microRNA-101是否參與第一組大鼠軟骨退化的進程，大鼠膝關節(jié)軟骨 在注射碘醋酸一天后取材作進一步分析。如圖la所示，與正常大鼠（即未經碘醋酸處理的 大鼠）相比，對第一組的Real-time PCR結果顯示，microRNA-101表達水平在注射碘乙酸 后顯著上升。然而，Sox9的RNA及蛋白水平顯著下降（參見圖lb和圖lc)?？梢?Sox9的 是microRNA-101的一個靶標，并在軟骨細胞外基質降解過程中Sox9受microRNA-101的調 控。綜上所述，microRNA-101參與MIA大鼠的軟骨退化過程，其功能通過調控Sox9的表達 來實現(xiàn)。
[0082] microRNA-101的模擬物及microRNA-101的抑制劑表達載體對關節(jié)軟骨的作用
[0083] 為了測試腺病毒介導的microRNA-101的載體是否能滲透到軟骨并發(fā)揮作用，首 先，將注射microRNA-101的模擬物（第三組）及microRNA-101的抑制劑（第四組）的 大鼠膝關節(jié)軟骨的冷凍切片在共聚焦顯微鏡下進行免疫熒光法分析并觀察。對待檢測 的軟骨細胞的細胞核進行熒光標記（參見圖2a)，在microRNA-101的模擬物的載體及 microRNA-101的抑制劑的載體中設有綠色熒光蛋白標記，則綠色熒光蛋白的表達與否可以 表明microRNA-101的模擬物及microRNA-101的抑制劑是否表達。
[0084] 共聚焦顯微鏡結果顯示，綠色熒光蛋白可在軟骨、半月板、甚至滑膜中表達（參見 圖2a)。這表明microRNA-101、及其模擬物或抑制劑的載體能夠滲入軟骨。其次，為了檢測 表達載體能否在軟骨中發(fā)揮作用，大鼠膝關節(jié)軟骨組織的RNA，通過Real-time PCR方法檢 測注射過表達載體的軟骨組織中microRNA-101的表達水平，結果表明，注射microRNA-101 的模擬物的樣品（第三組）及microRNA-101的抑制劑的樣品（第四組）中，microRNA-101 的表達水平相對于第二組顯著增加（參見圖2b)。而注射microRNA-101的模擬物的樣品 (第三組）中，Sox9的mRNA表達水平下降（參見圖2c和2d);而注射microRNA-101的抑 制劑的樣品（第四組）中，Sox9的mRNA的表達水平得到明顯提高（參見圖2c和2d)?？?見，腺病毒介導的microRNA-101的模擬物和microRNA-101的抑制劑能滲透到軟骨，并能發(fā) 揮作用，調節(jié)其祀點Sox9的表達。
[0085] 各組膝關節(jié)滑車軟骨觀察
[0086] 大鼠關節(jié)腔注射后及治療過程中無一例死亡，無一例感染，上述四組大鼠分別在 注射碘乙酸后7天和14天取材。觀察表明，7天時，上述四組大鼠中，膝關節(jié)滑車部分軟骨破 壞比較明顯，有輕微的軟骨下骨暴露的表現(xiàn)。但是四個組的軟骨退變的程度差別不大（參 見圖3a)。14天時，四個組中，膝關節(jié)滑車部位的軟骨退變出現(xiàn)了不同，具體來說第一組和 第二組軟骨退變情況類似，有輕微的軟骨下骨暴露的現(xiàn)象（參見圖3a);而第三組滑車面的 軟骨退變比較明顯，軟骨下骨暴露明顯（參見圖3a);第四組，軟骨退變很輕微，軟骨退變的 程度比第一組和第二組小，軟骨面比較光滑，沒有出現(xiàn)軟骨下骨暴露（參見圖3a)。
[0087] 各組膝關節(jié)滑車軟骨組織學評分
[0088] 各組的膝關節(jié)評分主要根據改良的mankin評分系統(tǒng)來評估的，主要從三大方面 來評估軟骨退變程度：軟骨的結構（包括軟骨表面不規(guī)整、裂縫至放射層、血管翳、表層消 失、輕微組織破壞、裂隙至軟骨下骨、組織破壞等）、軟骨細胞的異常（包括軟骨細胞增多、 肥大、簇集）、基質染色（包括表層染色減少、胞內基質染色減少、僅僅細胞外基質染色、無 染色）。分數(shù)低說明軟骨退變較輕，而分數(shù)高說明軟骨退變重。
[0089] 從組織評分來看，7天時，各組評分差異不明顯。但是，與其他組相比，第四組評分 低，與其他組的組織學評分之間比較有統(tǒng)計學差異，說明第四組軟骨損傷?。▍⒁妶D3b)。 14天時，各組的總體的組織學評分之間差異明顯，主要表現(xiàn)在第四組的評分與第一組和第 二組相比有統(tǒng)計學意義；第三組的評分與第一組和第二組相比也有統(tǒng)計學意義（參見圖 3c)。可見，第三組的評分低，說明軟骨退變少；而第四組的評分高，說明軟骨退變多，說明 microRNA-101的模擬物加重骨關炎，microRNA-101的抑制劑改善骨關炎。
[0090] 各組動物膝關節(jié)滑車軟骨組織HE染色結果
[0091] 如附圖4所示，從HE染色來看，具體的動物模型軟骨退變包括：軟骨表面的凹凸 不平和裂隙，軟骨鈣化層變薄，潮線不清晰。7天時，各組的總體的HE染色之間比較沒有明 顯差異。14天時，各組軟骨的厚度與7天相比均變薄，但是，第四組變薄的程度比較輕。第 一組、第二組和第三組的關節(jié)軟骨與軟骨下骨的連接不甚緊密，同時軟骨面有裂隙深達軟 骨下骨，而第四組沒有軟骨面光滑，沒有裂隙。可見，關節(jié)腔注射microRNA-101的模擬物后 軟骨損傷加重，結構紊亂，軟骨層變?。欢⑸鋗icroRNA-101的抑制劑后，軟骨結構較為正 堂 巾。
[0092] 各組動物膝關節(jié)滑車軟骨細胞外基質的甲苯胺藍染色和II型膠原免疫組化染色 結果
[0093] II型膠原和蛋白聚糖是軟骨組織細胞外基質的主要組成成分，也是軟骨的特異性 標志物。在軟骨組織退變時軟骨組織細胞外基質逐漸降解，II型膠原和蛋白聚糖的量逐漸 減少；甲苯胺藍染色可以反映軟骨細胞外的蛋白聚糖含量，而II型膠原免疫組化染色主要 反映 II型膠原量的變化。因此，II型膠原和蛋白聚糖也是軟骨退變的主要檢測指標。
[0094] 如附圖5及附圖6所示，甲苯胺藍染色和II型膠原免疫組化染色結果顯示，各組 在蛋白聚糖和II型膠原的表達量上面沒有明顯差異。
[0095] 14天時，各組在甲苯胺藍染色和II型膠原免疫組化染色結果方面出現(xiàn)差異，具體 表現(xiàn)在：第四組的甲苯胺藍染色和II型膠原免疫組化染色與其他三組相比，染色深，說明 第四組的軟骨組織細胞外基質退變的少（參見圖5及圖6)。同時，其他三組在甲苯胺藍染 色和II型膠原免疫組化染色方面相比，沒有明顯差異。
[0096] 綜上所述，關節(jié)腔注射microRNA-101的模擬物后，軟骨細胞外基質：蛋白聚糖染 色變淡，說明軟骨細胞外基質降解；注射microRNA-101的抑制劑后，軟骨組織甲苯胺藍染 色相比其他組染色深，說明注射microRNA-101的抑制劑能夠預防軟骨細胞外基質降解。 [0097] 關節(jié)腔注射microRNA-101的模擬物后，軟骨的另外一種細胞外基質：11型膠原的 染色變淡，說明軟骨細胞外基質降解；注射microRNA-101的抑制劑后，軟骨組織II型膠原 免疫組化染色相比其他組染色深，說明注射microRNA-101的抑制劑能夠預防軟骨細胞外 基質降解。
[0098] 實施例2
[0099] 制備microRNA-101的抑制劑藥物：
[0100] l)microRNA_101的抑制劑的設計：根據microRNA-101的序列，根據互補 原則設計microRNA-101的反義寡核苷酸，microRNA-101的反義寡核苷酸序列為： 5' ATGTCATGACACTATTGACTT3'。
[0101] 2)利用鎖核酸技術修飾microRNA-101抑制劑：將microRNA-101的反義寡核苷 酸序列中 5' ATGTCATGACACTATTGACTT3'，自 5'端起第 1-21 位中的 1、2、3、4、5、6、7 或更 多個核苷酸被鎖核苷酸（LNA)修飾。該鎖核苷酸選自β-D-氧-鎖核苷酸，（還可以用 β -D-硫-鎖核苷酸、β -D-氨基-鎖核苷酸和/或a -L-氧-鎖核苷酸進行替代）。該鎖核 苷酸根據如下方法（參見國際專利：W099/14226，W000/56746，W000/56748，W000/66604 等） 來制備。從而制備得到修飾后的microRNA-101的抑制劑藥物。該制備得到的microRNA-101 的抑制劑藥物的穩(wěn)定性提高，能夠特異地結合抑制細胞內源成熟的microRNA分子
[0102] IL-Ιβ和TNF-α作用于人軟骨組織后能夠引起軟骨細胞退變，細胞外基質降 解，造成軟骨損傷。將有效量的所制備的microRNA-ΙΟ?的抑制劑藥物加入人軟骨細胞的 培養(yǎng)液中，再進行IL-1 β和TNF- a的刺激后，發(fā)現(xiàn)microRNA-101的抑制劑藥物能夠逆轉 IL-Ιβ和TNF-a引起的人軟骨細胞退變，細胞外基質降解，起到保護軟骨細胞，使其免受 炎性因子引起的軟骨損傷?？梢?，本發(fā)明實施例提供的microRNA-ΙΟ?的抑制劑藥物具有保 護關節(jié)軟骨細胞，利于軟骨修復的作用。
[0103] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0001] 序列表 <110>北京大學第三醫(yī)院 <120> microRNA-101的抑制劑在制備預防或治療骨關節(jié)炎藥物中的應用 <130> 14SG1F0691 <160> 1 <170> Palcntln version 3.4 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uacaguacug ugauaacuga a 21
【權利要求】
1. microRNA-101的抑制劑在制備預防或治療骨關節(jié)炎藥物中的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述microRNA-101的核苷酸序列為 5'-UACAGUACU⑶GAUAACUGAA-3' 。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述microRNA-101進一步被修飾，修飾后 的 microRNA-101 保持所述 microRNA-101 的活性。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述修飾選自核糖修飾、堿基修飾、磷酸 骨架修飾中的至少一種。
5. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述microRNA-101中的核苷酸進一 步被部分替換或增減，核苷酸進一步被部分替換或增減后的microRNA-101保持所述 microRNA-101 的活性。
6. -種用于預防或治療骨關節(jié)炎的藥物組合物，所述藥物組合物包括有效量的 microRNA-101 的抑制劑。
7. 根據權利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物還包括與所述 microRNA-101的抑制劑配伍的其他藥類以及藥學上可接受的載體和/或輔料。
8. 根據權利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物的劑型選自溶液 齊?、懸液劑、干粉劑、乳劑、控制釋放劑或持續(xù)釋放制劑。
9. 根據權利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物的給藥方式選自 注射給藥或經口給藥。
【文檔編號】A61P19/02GK104083761SQ201410290697
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月25日 優(yōu)先權日:2014年6月25日
【發(fā)明者】敖英芳, 代嶺輝, 周春燕, 張辛, 胡曉青 申請人:北京大學第三醫(yī)院