一種豬流行性腹瀉疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種豬流行性腹瀉疫苗組合物，該疫苗組合物含有豬流行性腹瀉病毒亞單位抗原和載體；本發(fā)明還提供了一種豬流行性腹瀉疫苗組合物，該疫苗組合物包括豬流行性腹瀉病毒亞單位抗原、豬流行性腹瀉全病毒滅活抗原和載體。本發(fā)明還公開了含該疫苗組合物的制備方法以及其在制備預(yù)防和/或治療豬流行性腹瀉的藥物中的應(yīng)用。該疫苗組合物中的S1蛋白可通過基因工程手段對疫苗組合物的組分進行大量重組表達，不僅耗時短，還可便于大規(guī)模生產(chǎn)；當該疫苗組合物含S1蛋白及豬流行性腹瀉全病毒滅活抗原時，比單獨使用全病毒滅活抗原免疫時，免疫效果更優(yōu)，能夠有效預(yù)防豬流行性腹瀉病毒變異株和普通株導(dǎo)致的疾病。CCTCC NO： V2013412013.09.16
【專利說明】一種豬流行性腹瀉疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬流行性腹瀉疫苗組合物及其 制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhoea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起豬腹瀉的一種重要急性、接觸性、病毒性腸 道傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和食欲下降為特征。該病最早于上世紀70年代發(fā)生在英 國和比利時，1973年先后在我國上海、遼寧、吉林等地分離到PEDV。PEDV可在豬群中持續(xù)存 在，各種年齡段的豬均易感。哺乳仔豬、架子豬和育肥豬的發(fā)病率可達1〇〇%，尤以哺乳仔豬 嚴重，病死率達100%。目前，還沒有特效藥物可抵抗PEDV，由于該病發(fā)病急，流行快，豬群 一旦感染，就會給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟損失。
[0003] 中國于1980年首次分離到PEDV，以后許多地區(qū)相繼報道有本病發(fā)生，并主要在 冬春季節(jié)散發(fā)，造成的危害巨大。從2010年至今，在我國華南、華北部分省份暴發(fā)了嚴 重的豬流行性腹瀉，已超過100萬只的豬死亡（Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets,China. Emerging infectious diseases, 2012, 18(1) :161-162)。豬流行性腹瀉表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、脫水，可發(fā)生于任何年 齡的豬，年齡越小，癥狀越重，死亡率越高，特別地，7日齡內(nèi)新生仔豬發(fā)生腹瀉后3-4天，呈 現(xiàn)嚴重脫水而死亡，死亡率高達50%，最高的死亡率達100%。此外，最新的研究表明還可 能通過乳汁進行垂直傳播。
[0004] 目前，對于該病的防控主要采取傳統(tǒng)的滅活苗、弱毒苗免疫接種。弱毒苗免疫 存在潛在的生物風(fēng)險，全病毒滅活疫苗病毒滴度低，導(dǎo)致抗原含量不足，有PEDV難以分 離培養(yǎng)，即使營養(yǎng)液中加入胰酶促使其在Vero細胞中繁殖傳代，但病毒滴度只能維持在 1 X lO^TCID^/mL左右。如采用細胞濃縮的方法使雜蛋白含量增加從而造成副反應(yīng)。因此， 如何解決疫苗免疫效果的問題是豬流行性腹瀉本領(lǐng)域急需解決的技術(shù)問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種豬流行性腹瀉疫苗組合物及其應(yīng) 用。該豬流行性腹瀉疫苗組合物可有效預(yù)防和治療豬流行性腹瀉病毒變異株和豬流行性腹 瀉病毒普通株導(dǎo)致的疾病。
[0006] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種豬流行性腹瀉疫苗組合物，其特征在于，所述疫 苗組合物包括豬流行性腹瀉病毒亞單位抗原和載體，所述豬流行性腹瀉病毒亞單位抗原包 括豬流打性腹?與病毒S蛋白、S1蛋白、Μ蛋白、N蛋白。
[0007] 術(shù)語"豬流行性腹瀉病毒亞單位抗原"是指具有免疫原性的豬流行腹瀉病毒蛋白 片段，包括但不限于豬流行性腹瀉病毒S蛋白、豬流行性腹瀉病毒S1蛋白、豬流行性腹瀉病 毒Μ蛋白、豬流行性腹瀉病毒Ν蛋白的一種或兩種混合物；所述"豬流行性腹瀉病毒亞單位 抗原"優(yōu)選為豬流行性腹瀉病毒S1蛋白。優(yōu)選地，所述豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉 病毒變異株。
[0008] 術(shù)語"豬流行性腹瀉病毒S蛋白"是豬流行性腹瀉病毒中的四個結(jié)構(gòu)蛋白之一，為 纖突蛋白（spike蛋白），位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白，在病毒粒子與細胞表面受體結(jié) 合后通過膜融合侵入宿主細胞和在感染宿主體內(nèi)介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要生 物學(xué)作用。該蛋白是由1384個氨基酸組成的多肽，含有27-29個潛在的糖基化位點，劃分 為2個功能區(qū)即S1 (第1-789位氨基酸）和S2 (第790-1383位氨基酸）。
[0009] 術(shù)語"豬流行性腹瀉病毒S1蛋白"位于豬流行性腹瀉病毒S蛋白的功能區(qū)之一，由 789個氨基酸組成（任曉峰，賈文龍.豬流行性腹瀉病毒S1蛋白截短表達及多抗制備.東 北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013, 44(9) :46-50)。
[0010] 術(shù)語"豬流行性腹瀉病毒Μ蛋白"是豬流行性腹瀉病毒中的四個結(jié)構(gòu)蛋白之一，為 膜蛋白（Membrane蛋白），是PEDV中含量最多的包膜蛋白，由226個氨基酸編碼而成，有三 方面的生物學(xué)作用：參與病毒粒子的組裝和出芽、刺激機體產(chǎn)生α-干擾素（α-IFN)、其產(chǎn) 生的抗體在不提存在時具有中和病毒的能力。
[0011] 術(shù)語"豬流行性腹瀉病毒N蛋白"是豬流行性腹瀉病毒中的四個結(jié)構(gòu)蛋白之一，為 核衣殼蛋白（Nucleocapsid蛋白），由1326個核苷酸組成，編碼441個氨基酸，是PEDV在感 染細胞中產(chǎn)生最多的病毒蛋白，結(jié)構(gòu)十分保守。
[0012] 術(shù)語"豬流行性腹瀉病毒變異株"是又稱高致病性豬流行性腹瀉病毒，包括但不限 于其S1蛋白具有與SEQ ID No. 1基本相同的核苷酸序列的PEDV。優(yōu)選地，豬流行性腹瀉病 毒變異株其S1蛋白具有與SEQ ID No. 1基本相同的核苷酸序列的PEDV。與SEQ ID No. 1基 本相同是指，PEDV的核苷酸序列優(yōu)選包含與SEQ ID No. 1有85% -100%相同的序列，優(yōu)選 在豬流行性腹瀉病毒變異株并非本文所述PEDV的條件下，例如與作為參考病毒分離物的 CH/YNKM/2012相比，S1的核苷酸同源性低于91 %，優(yōu)選低于92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %或99 %。豬流行性腹瀉病毒變異株核苷酸序列優(yōu)選有超過80^^81^^82 %、 83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，與SEQIDNo.l相同，同樣優(yōu)選在豬流行性腹 瀉病毒變異株并非本文所述PEDV的條件下，例如與作為參考病毒分離物的CH/YNKM/2012 相比，S1的核苷酸同源性低于91%，優(yōu)選低于92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%。
[0013] 術(shù)語"同源性"是指兩條氨基酸序列或兩條核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或 核苷酸序列的同源性可以通過本領(lǐng)域公知的任何適當?shù)姆椒ㄓ嬎愕玫?，例如，可以將目?氨基酸（或核苷酸）序列與參比氨基酸（或核苷酸）序列進行序列比對，必要時可以引入 空缺，使得兩條比對的序列間相同的氨基酸（或核苷酸）數(shù)目達到最優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上計 算兩條氨基酸（或核苷酸）序列之間相同氨基酸（或核苷酸）的百分比。氨基酸（或核苷 酸）序列的比對和同源性的計算可以通過本領(lǐng)域公知的軟件實現(xiàn)，例如，但不限于，BLAST 軟件（在美國國立生物技術(shù)信息中心％131的網(wǎng)址上可獲得：111^口:/7131381:.11(313；[.111111.11；[11· gov/Blast. cgi，或者見，例如，Altschul S.F. et al，J. Mol. Biol.，215 :403-410(1990); St印hen F. et al，Nucleic Acids Res.，25 :3389-3402(1997)), ClustalW2 軟件（在歐 洲生物信息研究所網(wǎng)址上可獲得：http://www. eji. ac. uk/Toolsa/clustalw2/，另見，例 如，Higgins D.G. et al, Methods in Enzymology, 266 :383-402(1996) ;Larkin M. A. et al, Bioinformatics (Oxford，England) ,23(21) :2947-8(2007));和 TCoffee 軟件等（在瑞典 生物信息學(xué)研究所的網(wǎng)站上可以獲得：http://tcoffee. vital-it. ch/cgi-bin/Tcoffee/ tcoffee_cgi/index.cgi，另見，例如，Poirot O.et al，Nucleic Acids Res. ,31(13): 3503-6(2003) ;Notredame C.et al，J. Mol. Boil.，302(1) :205-17 (2000))。使用軟件進行 序列比對時，可以使用軟件提供的默認參數(shù)，或者也可以根據(jù)實際情況對軟件提供的參數(shù) 進行調(diào)整，這些都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
[0014] 優(yōu)選地，所述豬流行性腹瀉病毒S1蛋白核苷酸序列編碼SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8或SEQ ID No. 10氨基酸序列；進一步優(yōu)選地，所述豬流行性 腹瀉病毒S1蛋白核苷酸序列編碼SEQ ID No. 2氨基酸序列。
[0015] 作為本發(fā)明的一種實施方式，所述豬流行性腹瀉病毒S1蛋白為SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8或SEQ ID No. 10編碼的至少一種蛋白；優(yōu)選地，所述豬流 行性腹瀉病毒S1蛋白為SEQ ID No. 2編碼的蛋白。
[0016] 作為本發(fā)明的一種實施方式，優(yōu)選地，所述豬流行性腹瀉病毒S1蛋白的核苷酸序 列為 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7 或 SEQ ID No. 9，優(yōu)選為 SEQ ID No. 1。
[0017] 優(yōu)選地，所述豬流行性腹瀉病毒SI蛋白的含量為0. 5-20 μ g/mL。
[0018] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述疫苗組合物由豬流行性腹瀉病毒S1蛋白 和獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑組成。
[0019] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種豬流行性腹瀉疫苗組合物，其特征在于，所述疫 苗組合物包括所述豬流行性腹瀉病毒亞單位抗原、豬流行性腹瀉全病毒滅活抗原和載體。
[0020] 優(yōu)選地，所述豬流行性腹瀉病毒亞單位抗原為豬流行性腹瀉病毒S1蛋白，其核苷 酸序列編碼 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 氨基酸序 列；所述豬流行性腹瀉全病毒滅活抗原為滅活的豬流行性腹瀉病毒HN1301株。
[0021] 豬流行性腹瀉病毒 HN1301 株（Porcine epidemic diarrhea virus, strain HN1301)的保藏號為CCTCC NO. V201341，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為 中國武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2013年9月16日。
[0022] 優(yōu)選地，所述豬流行性腹瀉病毒S1蛋白的含量為0. 5-20 μ g/mL ;所述豬流行性腹 瀉全病毒滅活抗原的含量為滅活前1X 1〇4_°-1 X 107_°TCID5(l/mL。
[0023] 優(yōu)選地，所述載體包括佐劑，所述佐劑包括鋁膠佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳 齊U、水包油包水乳劑、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍 生物的共聚物、RIBI佐劑系統(tǒng)、Block c〇-polymer、SAF-M、單磷酰脂質(zhì)A、Avridine脂質(zhì)-胺 佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒素、MS1314、胞壁酰二肽或Gel佐劑中的一種或幾 種；優(yōu)選地，所述佐劑為鋁膠佐劑。
[0024] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物還包括其他抗原，所述其他抗原包括豬傳染性胃腸炎病 毒抗原、豬輪狀病毒抗原、豬圓環(huán)病毒抗原、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、副豬嗜血桿菌 抗原、豬細小病毒抗原、大葉性肺炎放線桿菌抗原、大腸桿菌抗原、豬萎縮性鼻炎抗原、豬偽 狂犬病病毒抗原、豬霍亂病原抗原、豬流感病毒抗原中的一種或多種；優(yōu)選地，所述其他抗 原為豬傳染性胃腸炎病毒抗原。
[0025] 術(shù)語"豬流行性腹瀉全病毒滅活抗原"是指在動物細胞上培養(yǎng)豬流行性腹瀉病毒， 然后經(jīng)過滅活劑滅活所制備的抗原。優(yōu)選地，所述動物細胞是Vero細胞。
[0026] 優(yōu)選地，所述"豬流行性腹瀉全病毒滅活抗原"為豬流行性腹瀉病毒變異株的滅活 抗原。
[0027] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述疫苗組合物由豬流行性腹瀉病毒S1蛋白、 豬流行性腹瀉全病毒滅活抗原和獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑組成。
[0028] 術(shù)語"佐劑"可包括錯膠佐劑；阜苷（saponin)，如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge ΜΑ)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals Incorporation, Birmingham AL);油包水乳劑；水包油乳劑；水包油包水乳劑；丙烯酸或甲 基丙烯酸的聚合物；順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物的共聚物選出的化合物。
[0029] 術(shù)語"乳劑"可尤其基于輕液體石錯油（European Pharmacopea類型）；因烯經(jīng)寡 聚產(chǎn)生的類異戊二烯油（isoprenoidoil)，如角藍燒（squalane)或角藍烯油（squalene oil)，尤其異丁烯或葵烯；酸或醇的含線性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇 二_(辛酸酯/葵酸酯）、甘油三_(辛酸酯/葵酸酯）或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或 醇的酯，尤其異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以便形成乳劑。乳化劑優(yōu)選非離子表面 活性劑，尤其山梨聚糖的酯、二縮甘露醇（mannide)的酯（如無水甘露醇油酸酯）、脂肪族 二元醇（glycol)的酯、聚甘油（polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、異硬脂 酸的酯、蓖麻油酸的酯或羥基硬脂酸的酯，它們?nèi)芜x乙氧基化，還有聚氧丙烯-聚氧乙烯 嵌段共聚物，尤其Pluronic產(chǎn)品，特別是L121。參見Hunter等編寫的《The theory and practical application of adjuvants》（Ed. by DES Stewart-Tull, John Wiley and Sons, New York, 1995:51-94)和 Todd 等編寫的《Vaccine》（1997, 15:564-570)。例如，可使用 Powell Μ 和 Newman Μ 編寫的〈〈Vaccine design, the Subunit and adiuvant approach〉〉（Plenum Press, 1995)第147頁描述的SPT乳劑及第183頁描述的MF59乳劑。
[0030] 術(shù)語"丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物"優(yōu)選為交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物， 尤其是與糖（sugar)的聚鏈烯基醚或聚醇交聯(lián)，這些化合物已知被稱為卡波姆（Carbomer， 商品名Carbopol) (Phameuropa, 1996, 8 (2))。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可參見美國專利 US2909462,其描述了這類丙烯酸聚合物，其與聚羥基化的化合物交聯(lián)，所述化合物具有至 少3個羥基，優(yōu)選不超過8個，其中至少3個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的不飽和 脂經(jīng)基（aliphatic radical)取代。優(yōu)選的基團是那些含有2-4個碳原子的基團，例如乙烯 基、烯丙基和其它烯屬不飽和基團（ethylenically unsaturated group)。所述不飽和基團 自身可包含其它取代基，如甲基。這些產(chǎn)品以卡波普的名義出售，（BF Goodrich, Ohio, USA) 特別合適。它們與烯丙基鹿糖或與烯丙基季戊四醇（allyl pentaerythritol)交聯(lián)。這其 中可提及卡波普974P、934P和971P，最優(yōu)選使用卡波普971P。
[0031] 術(shù)語"順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物"也可考慮順丁烯二酸酐與乙烯 的共聚物EMA(Monsanto)，這些聚合物在水中溶解產(chǎn)生酸性溶液，經(jīng)中和，優(yōu)選中和至生理 pH，以便產(chǎn)生佐劑溶液，能向其中摻入免疫原性、致免疫性或疫苗性組合物本身。
[0032] 術(shù)語"佐劑"還包括，但不限于，RIBI佐劑系統(tǒng)（Ribi Incorporation)、 Block co-polymer (CytRx，Atlanta GA)、SAF_M(Chiron，Emeryville CA)、單憐醜脂質(zhì) A(monophosphoryl lipidA)、Avridine脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素（重組或其 它）、霍亂毒素、MS1314、胞壁酰二肽、Gel佐劑等。
[0033] 優(yōu)選地，所述佐劑為鋁膠佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、 丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI 佐劑系統(tǒng)、Block c〇-polymer、SAF-M、單磷酰脂質(zhì)A、Avridine脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌不耐 熱腸毒素、霍亂毒素、MS1314、胞壁酰二肽或Gel佐劑中的一種或幾種；優(yōu)選地，所述佐劑 為鋁膠佐劑。
[0034] 優(yōu)選地，所述佐劑在所述疫苗組合物中的體積比為5 % -30 %，優(yōu)選為20 %。
[0035] 本發(fā)明所用術(shù)語"豬流行性腹瀉"與"PED"、"豬流行性腹瀉病毒"與"PEDV"在本 發(fā)明中可互換使用。
[0036] 本發(fā)明所用縮略語為：AA，氨基酸；bp，堿基對。
[0037] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法，其特征在于，所述 方法包括：（1)克隆表達所述亞單位抗原；以及（2)按比例混合所述表達的所述亞單位抗原 和佐劑。
[0038] 優(yōu)選地，克隆表達所述亞單位抗原為所述S1蛋白，其包括其核苷酸序列為編碼 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 氨基酸序列的序列。
[0039] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法，其特征在于，所述 方法包括：（1)克隆表達所述亞單位抗原；(2)增殖培養(yǎng)所述豬流行性腹瀉病毒，滅活；以及 (3)按比例混合所述表達的所述亞單位抗原和滅活的豬流行性腹瀉全病毒抗原，加入佐劑。
[0040] 優(yōu)選地，克隆表達所述亞單位抗原為所述S1蛋白，其包括其核苷酸序列為編碼 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 氨基酸序列的序列；所 述豬流行性腹瀉全病毒滅活抗原為滅活的豬流行性腹瀉病毒HN1301株。
[0041] 優(yōu)選地，所述的克隆表達方法為采用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達。
[0042] 本發(fā)明的還一目的在于提供所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療豬流行性 腹瀉的藥物中的應(yīng)用。
[0043] 術(shù)語"預(yù)防和/或治療"在涉及豬流行性腹瀉病毒感染時是指抑制豬流行性腹瀉 病毒的復(fù)制、抑制豬流行性腹瀉病毒的傳播或防止豬流行性腹瀉病毒在其宿主體內(nèi)定居， 以及減輕豬流行性腹瀉病毒感染的疾病或病癥的癥狀。若病毒荷載量減少、病癥減輕和/ 或攝食量和/或生長增加，那么就可以認為所述治療達到了治療效果。
[0044] 優(yōu)選地，所述豬流行性腹瀉包括由豬流行性腹瀉病毒變異株和豬流行性腹瀉病毒 普通株導(dǎo)致的豬流行性腹瀉。
[0045] 本發(fā)明所用術(shù)語"豬"是指任何屬于豬科（Suidae)成員的動物，如豬。
[0046] 本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點：
[0047] (1)所述疫苗組合物可通過基因工程手段對疫苗組合物的組分進行大量重組表 達，不僅耗時短，還可便于大規(guī)模生產(chǎn)；
[0048] (2)所述疫苗組合物含有免疫原性蛋白及豬流行性腹瀉全病毒滅活抗原時，比單 獨使用全病毒滅活抗原免疫時，效果更好。
[0049] (3)疫苗保護范圍廣，可以預(yù)防和治療由豬流行性腹瀉病毒變異株和豬流行性腹 瀉病毒普通株導(dǎo)致的豬流行性腹瀉。
[0050] 序列表中：
[0051] 序列1為豬流行性腹瀉病毒Sla蛋白的核苷酸人工序列；
[0052] 序列2為豬流行性腹瀉病毒Sla蛋白的氨基酸人工序列；
[0053] 序列3為豬流行性腹瀉病毒CH/YNKM/2012株S1蛋白的核苷酸序列；
[0054] 序列4為豬流行性腹瀉病毒CH/YNKM/2012株S1蛋白的氨基酸序列；
[0055] 序列5為豬流行性腹瀉病毒SD-M株S1蛋白的核苷酸序列；
[0056] 序列6為豬流行性腹瀉病毒SD-M株S1蛋白的氨基酸序列；
[0057] 序列7為豬流行性腹瀉病毒⑶S03株S1蛋白的核苷酸序列；
[0058] 序列8為豬流行性腹瀉病毒⑶S03株S1蛋白的氨基酸序列；
[0059] 序列9為豬流行性腹瀉病毒CH4株S1蛋白的核苷酸序列；
[0060] 序列10為豬流行性腹瀉病毒CH4株S1蛋白的氨基酸序列。

【具體實施方式】
[0061] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0062] 本發(fā)明實施例中所采用豬流行性腹瀉全病毒毒株為HN1301株（Porcine印idemic diarrhea virus, strain HN1301)，該毒株的保藏號為CCTCC NO. V201341，保藏單位為中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2013年9月16日。
[0063] 本發(fā)明實施例中所采用豬流行性腹瀉攻毒毒株為HN1301株或滬毒株，其中，滬毒 株已在中國專利CN101117627A中公開，農(nóng)業(yè)部公告270號文件中將該毒株作為豬流行性腹 瀉普通株CV777株的效檢用強毒株。
[0064] 本發(fā)明實施例中所用的pH7. 2PBS液配方為：1000mL蒸餾水中加入NaC19g、 Na2HP04 · 12H206g、NaH2P04 · 2H200. 4g，本發(fā)明中所用到的化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集 團。
[0065] 本發(fā)明實施例以體積比為20%的鋁膠佐劑制備豬流行性腹瀉疫苗組合物為例進 行闡述，但該實施方式無論在任何情況下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。
[0066] 本發(fā)明實施例中所用的豬流行性腹瀉全病毒滅活抗原含量以滅活前 1 X 105_°TCID5(l/mL為例進行闡述，但該實施方式無論在任何情況下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限 定。
[0067] 本實施例中豬流行性腹瀉發(fā)病的判定標準為：厭食、通常黃色或淺黃色水樣腹瀉， 部分仔豬伴有嘔吐、寒顫、脫水等癥狀，在臨床觀察的5-6日之內(nèi)可能有部分仔豬脫水后死 亡。發(fā)病程度可能輕重不同，但判定發(fā)病最基本的、也是不可少的條件是腹瀉。
[0068] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。本發(fā)明所述 的實驗方法，若無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述的生物材料，若無特殊說明，均可從商業(yè)途 徑獲得。
[0069] 實施例1豬流行性腹瀉病毒S1蛋白的制備、鑒定及含量測定
[0070] 1. 1豬流行性腹瀉病毒Sla蛋白的制備、鑒定及含量測定
[0071] 1. 1. 1重組載體Bacmid-Sla的構(gòu)建
[0072] 根據(jù)豬流行性腹瀉病毒S1蛋白核苷酸序列（見序列表SEQ ID No. 1)，采用人工合 成的方法，由上海生物工程有限公司合成，所合成的基因片段全長為2367bp。在此人工合成 S1基因片段的基礎(chǔ)上制備S1蛋白的模板。
[0073] 以前一步驟所合成的S1全長基因片段用做PCR反應(yīng)的模板，設(shè)計一對特異性引 物，并分別在上下游添加 Xhol、PstI酶切位點，引物序列如下：
[0074] Sla-Pl :5' GCTCTCGAGATGACGCCTTTAATTTACTTCTGGT3'，
[0075] Sla-P2 :5' GGGCTGCAGTCTAATACTCATACTAAAGTTGGTG3'。
[0076] 運用PCR擴增S1片段，將擴增后的片段命名為Sla。PCR擴增條件為：94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 60s，35 個循環(huán)，72°C延伸 5min。
[0077] 將擴增產(chǎn)物使用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳產(chǎn)物使用DNA凝膠回收試劑盒回 收后，將目的基因片段連接至pGEM-Τ載體，并轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，酶切鑒定后，將陽性 質(zhì)粒測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pGEM-T-Sla。Sla的測序結(jié)果如序列表SEQ ID No. 1所示。
[0078] 重組pFastbac I-Sla的構(gòu)建：將pGEM-T-Sla、pFastbac I同時進行雙酶切，酶切 產(chǎn)物進行電泳，使用DNA凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的Sla、pFastbac I片段。將回收的Sla、 pFastbac I片段使用T4DNALigase進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細胞。將含有充 足質(zhì)粒的DH5 a感受態(tài)細胞進行培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并進行雙酶切鑒定， 同時將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pFastbac I-Sla。Sla的 測序結(jié)果如序列表SEQ ID No. 1所示。
[0079] 重組穿梭載體Bacmid-Sla的構(gòu)建：將上述構(gòu)建的pFastbac I-Sla質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DHlOBac感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化細胞接種于含有三抗的LB固體培養(yǎng)基，同時進行藍白斑篩選。挑 取白斑接種于含三抗的LB液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。收獲菌液，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì) 粒，并進行PCR鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為Bacmid-Sla。
[0080] 1. 1. 2Bacmid_Sla質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、表達及鑒定
[0081] Bacmid-Sla質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞：在6孔細胞板培養(yǎng)Sf9細胞，轉(zhuǎn)染Bacmid-Sla 質(zhì)粒，觀察轉(zhuǎn)染細胞生長狀態(tài)，并換液，至細胞出現(xiàn)病變時，收集上清，4°C避光保存。并按照 0. 1M. 0. I進行F2代、F3代的擴增。
[0082] Sla蛋白的表達：將收獲的F3代按2-5M. 0. I的體積比接種Sf9細胞進行懸浮 培養(yǎng)，分別置于液氮、37°C水浴中反復(fù)凍融2-3次，離心，去除細胞碎片，將所獲上清進行 SDS-PAGE電泳，同時添加0. 1%甲醛于所獲上清并置37°C滅活6h，電泳結(jié)果表明：相對于對 照，在相應(yīng)位置出現(xiàn)目的蛋白。并進行Western blot鑒定，結(jié)果標明：所獲得的Sla蛋白能 與豬抗PEDV陽性血清反應(yīng)。
[0083] 1. 1. 3Sla蛋白含量的測定
[0084] 將上述獲得的上清，使用硫酸銨法沉淀，離心后，沉淀使用PBS重懸，并測定蛋白 濃度。將Sla蛋白使用SDS-PAGE進行電泳，分別取梯度稀釋后濃度為500、375、187. 5、 93. 75、46. 875μ g/mL的牛血清白蛋白（BSA)標準品同步進行電泳。SDS-PAGE電泳后，使用 考馬斯亮藍染色，脫色后使用掃描儀掃描。使用Alph-Imag er?3400軟件對電泳圖像進行定 量分析，以BSA標準品建立回歸曲線，計算重組Sla蛋白的濃度，將測定的重組Sla蛋白稀 釋至 100 μ g/mL。
[0085] 1. 2豬流行性腹瀉病毒Sib蛋白的表達、鑒定及含量測定
[0086] 1. 2. 1重組載體Bacmid-Slb的構(gòu)建
[0087] S1 基因的克隆及pMD18_T_Sl 載體的構(gòu)建:根據(jù) NCBI (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov)中報道的PEDVCH/YNKM/2012株（登錄號為JX018180. 1)中SI蛋白的基因序列（見序 列表SEQ ID No. 3)設(shè)計一對特異性引物，并分別在上下游添加 Xhol、PstI，引物序列如下：
[0088] Slb-Pl:5' GCTTCTCGAGATGACGCCTTTAATTTACTTCTGGT3'，
[0089] Slb-P2 :5' GGGCTGCAGCCTAATACTCATACTAAAGTTGGTG3'。
[0090] 運用PCR擴增S1片段，將擴增后的片段命名為Sib。PCR擴增條件為：94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 60s，35 個循環(huán)，72°C延伸 5min。
[0091] 將擴增產(chǎn)物使用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳產(chǎn)物使用DNA凝膠回收試劑盒回 收后，將目的基因片段連接至pGEM-Τ載體，并轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，將陽性質(zhì)粒測序，測 序正確的質(zhì)粒命名為pGEM-T-Slb。Sib的測序結(jié)果如序列表SEQ ID No. 3所示。
[0092] 重組pFastbac I-Slb的構(gòu)建：將pGEM-T-Slb、pFastbac I同時進行雙酶切，酶切 產(chǎn)物進行電泳，使用DNA凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的Sla、pFastbac I片段。將回收的Sib、 pFastbac I片段使用T4DNALigase進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細胞。將含有充 足質(zhì)粒的DH5 a感受態(tài)細胞進行培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并進行雙酶切鑒定， 同時將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pFastbac I-Slb。Sib的 測序結(jié)果如序列表SEQ ID No. 3所示。
[0093] 重組穿梭載體Bacmid-Slb的構(gòu)建：將上述構(gòu)建的pFastbac I-Slb質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DHlOBac感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化細胞接種于含有三抗的LB固體培養(yǎng)基，同時進行藍白斑篩選。挑 取白斑接種于含三抗的LB液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。收獲菌液，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì) 粒，并進行PCR鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為Bacmid-Slb。
[0094] 1. 2. 2Bacmid_Slb質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、表達及鑒定
[0095] Bacmid-Slb質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞：在6孔細胞板培養(yǎng)Sf9細胞，轉(zhuǎn)染Bacmid-Slb 質(zhì)粒，觀察轉(zhuǎn)染細胞生長狀態(tài)，并換液，至細胞出現(xiàn)病變時，收集上清，4°C避光保存。并按照 0. 1M. 0. I進行F2代、F3代的擴增。
[0096] Sib蛋白的表達：將收獲的F3代按2-5M. 0. I的體積比接種Sf9細胞進行懸浮 培養(yǎng)，分別置于液氮、37°C水浴中反復(fù)凍融2-3次，離心，去除細胞碎片，將所獲上清進行 SDS-PAGE電泳，同時添加0. 1 %甲醛于所獲上清置37°C滅活6h，電泳結(jié)果表明：相對于對 照，在相應(yīng)位置出現(xiàn)目的蛋白。并進行Western blot鑒定，結(jié)果標明：所獲得的Sib蛋白能 與豬抗PEDV陽性血清反應(yīng)。
[0097] 1. 2. 3Slb蛋白含量的測定
[0098] 將上述獲得的上清，使用硫酸銨法沉淀，離心后，沉淀使用PBS重懸，并測定蛋白 濃度。將Sib蛋白使用SDS-PAGE進行電泳，分別取梯度稀釋后濃度為500、375、187. 5、 93. 75、46. 875μ g/mL的牛血清白蛋白（BSA)標準品同步進行電泳。SDS-PAGE電泳后，使用 考馬斯亮藍染色，脫色后使用掃描儀掃描。使用Alph-Imag er?3400軟件對電泳圖像進行定 量分析，以BSA標準品建立回歸曲線，計算重組Sib蛋白的濃度，將測定的重組Sib蛋白稀 釋至 100 μ g/mL。
[0099] 1. 3豬流行性腹瀉病毒Sic、Sid、Sle蛋白的表達及鑒定
[0100] 根據(jù) NCBI (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov)中報道的 SD_M 株、GDS03 株、CH4 株 (登錄號依次為JX560761. 1、AB857235. 1、JQ239432. 1)中S1蛋白的基因序列（依次見序 列表 SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9)，分別按照實施例 L 2 中 L 2. 1 至 L 2. 2 部分 所述的方法構(gòu)建重組載體，并對其進行轉(zhuǎn)染、表達及鑒定，將表達后鑒定正確的蛋白依次命 名為Slc、Sld、Sle蛋白。
[0101] 按照實施例1. 2中1. 2. 3部分所述的方法對表達、鑒定后的Sic蛋白進行含量測 定，將測定后重組的Sic、Sid、Sle各蛋白均稀釋至100 μ g/mL。
[0102] 實施例3豬流行性腹瀉病毒疫苗組合物的制備
[0103] 3. 1豬流行性腹瀉病毒亞單位抗原的制備
[0104] 使用pH7. 2PBS將實施例1制備的重組蛋白Sla、Slb、Slc、Sld、Sle分別進行稀釋， 并加入鋁膠佐劑充分混勻，使疫苗組合物中的重組蛋白Sla、Sib、Sic、Sid、Sle的含量如表 1所示，同時保證鋁膠佐劑與疫苗組合物的體積比為1:5。將制備好的疫苗組合物作為免疫 原，于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0105] 3. 2豬流行性腹瀉全病毒滅活抗原的制備
[0106] 將PEDV HN1301株病毒液使用pH7. 2PBS稀釋，將稀釋病毒液按3 % (體積比） 接種量接種長滿致密單層的非洲綠猴腎細胞（Vero細胞，購自上海生化所），置于37 °C、 5% C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48-72h。當細胞出現(xiàn)腫脹、變圓、融合、脫落，細胞融合性病變達 80% -90%時，反復(fù)凍融后收獲,收獲病毒液置-20°C保存。將收獲的病毒液取樣測定病毒 含量，病毒含量彡107 5TCID5(l/mL合格。將檢驗合格的病毒液以3000rpm離心lOmin，上清 按0. 1 %體積比加入甲醛溶液，置37°C滅活12h，并進行滅活檢驗。將檢驗合格的病毒液于 4°C保存。
[0107] 將檢驗合格的病毒液用PBS稀釋，并與鋁膠佐劑混合，使其與疫苗組合物的體積 比為1:5,以制備豬流行性腹瀉滅活疫苗（疫苗I)，使所制備的疫苗中抗原的病毒含量為滅 活前l(fā)X10 5_°TCID5(l/mL(見表1)。將制備好的疫苗組合物作為免疫原，于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0108] 3. 3豬流行性腹瀉病毒亞單位抗原與全病毒滅活抗原疫苗組合物的制備
[0109] 同時制備豬流行性腹瀉病毒亞單位抗原與全病毒滅活抗原的疫苗組合物，其組成 如表1疫苗Η所示，同時保證錯膠佐劑與疫苗組合物的體積比為1:5。將制備好的疫苗組合 物作為免疫原，于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0110] 表1豬流行性腹瀉疫苗組合物所含組分及比例 [0111]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬流行性腹瀉疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物包括豬流行性腹瀉病 毒亞單位抗原和載體；其中，所述豬流行性腹瀉病毒亞單位抗原包括豬流行性腹瀉病毒S 蛋白、S1蛋白、Μ蛋白、N蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述豬流行性腹瀉病毒S1蛋白核 苷酸序列編碼 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 氨基酸 序列；優(yōu)選地，所述豬流行性腹瀉病毒SI蛋白核苷酸序列編碼SEQ ID No. 2氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述豬流行性腹瀉病毒S1蛋白的 含量為 0. 5-20μ g/mL。
4. 一種豬流行性腹瀉疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物包括權(quán)利要求1-2任 一項所述豬流行性腹瀉病毒亞單位抗原、豬流行性腹瀉全病毒滅活抗原和載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其特征在于，所述豬流行性腹瀉病毒亞單位抗 原為豬流行性腹瀉病毒S1蛋白，其核苷酸序列編碼SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、 SEQ ID No. 8或SEQ ID No. 10氨基酸序列；所述豬流行性腹瀉全病毒滅活抗原為滅活的豬流 行性腹瀉病毒HN1301株。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗組合物，其特征在于，所述豬流行性腹瀉病毒S1 蛋白的含量為〇. 5-20 μ g/mL ;所述豬流行性腹瀉全病毒滅活抗原的含量為滅活前 lX104cl-lX107CITCID5(l/mL。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的疫苗組合物，其特征在于，所述載體包括佐劑，所 述佐劑包括鋁膠佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、丙烯酸或甲基丙烯 酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐劑系統(tǒng)、Block c〇-polymer、SAF-M、單磷酰脂質(zhì)A、Avridine脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒 素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐劑中的一種或幾種；優(yōu)選地，所述佐劑為鋁膠佐劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物還包括其 他抗原，所述其他抗原包括豬傳染性胃腸炎病毒抗原、豬輪狀病毒抗原、豬圓環(huán)病毒抗原、 豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、副豬嗜血桿菌抗原、豬細小病毒抗原、大葉性肺炎放線桿菌 抗原、大腸桿菌抗原、豬萎縮性鼻炎抗原、豬偽狂犬病病毒抗原、豬霍亂病原抗原、豬流感病 毒抗原中的一種或多種；優(yōu)選地，所述其他抗原為豬傳染性胃腸炎病毒抗原。
9. 一種制備權(quán)利要求1-3所述疫苗組合物的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 克隆表達所述亞單位抗原；以及 (2) 按比例混合所述表達的亞單位抗原和佐劑。
10. -種制備權(quán)利要求4-6所述疫苗組合物的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 克隆表達所述亞單位抗原； (2) 增殖培養(yǎng)所述豬流行性腹瀉病毒，滅活；以及 (3) 按比例混合所述表達的亞單位抗原和滅活的豬流行性腹瀉全病毒抗原，加入佐劑。
11. 權(quán)利要求1-6任一項所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療豬流行性腹瀉的藥 物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K39/215GK104248762SQ201410290911
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】張許科, 孫進忠, 王瑩, 王延輝, 田克恭 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司