虹鱒IFN-γ2在制備抗IHN病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了虹鱒IFN-γ2在制備抗IHNV病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了rtIFN-γ2蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體在制備抑制傳染性造血器官壞死病病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述rtIFN-γ2蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)虹鱒IFN-γ2可以抗IHNV的活性，本發(fā)明能夠補(bǔ)充目前我國無抗IHNV有效制劑的現(xiàn)狀，同時γ干擾素還具有免疫調(diào)節(jié)活性，可將rtIFN-γ2進(jìn)一步開發(fā)為虹鱒魚用的天然免疫增強(qiáng)劑或佐劑。
【專利說明】虹鱒IFN-Y2在制備抗IHN病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種虹鱒IFN-γ 2在制備抗IHN病毒產(chǎn)品中 的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年魚類干擾素的研究熱度逐年提高，而干擾素的抗病毒作用一直是該項(xiàng)研究的 焦點(diǎn)內(nèi)容。較早的，2003年通過蝕斑減少實(shí)驗(yàn)，人工制備的大西洋鮭I型干擾素 α?亞類 被證實(shí)具有抗傳染性胰腺壞死病毒感染的作用。隨著研究的深入，斑馬魚、虹鱒、七帶石斑 魚、草魚被相繼證實(shí)具備抵抗病毒復(fù)制的能力。其中值得注意的是以制備的七帶石斑魚和 草魚干擾素注射魚，能使其各自能夠抵抗病毒的感染，這為人工制備的魚類干擾素臨床應(yīng) 用的有效性提供了有力的證據(jù)。2005年虹鱒γ干擾素被首次克隆，并證實(shí)利用原核表達(dá) 系統(tǒng)能夠成功制備出具有活性的重組虹鱒Υ干擾素，而2009年研究表明虹鱒γ干擾素 有第二個亞型的存在（rtIFN- γ 2)，且其在疫苗免疫和病毒感染的初期表達(dá)水平顯著高于 rtIFN- γ 1。2011年研究者將虹鱒的IFN- γ和大西洋鮭的I型干擾素 α 1亞類的抗病毒作 用進(jìn)行了比較，結(jié)果表明IFN-γ能夠上調(diào)Μχ蛋白、ISG15蛋白基因的表達(dá)，并很好的抑制傳 染性胰腺壞死病毒所導(dǎo)致的蝕斑形成，而與I型干擾素 α 1亞類相比，IFN-γ能更為有效 的誘導(dǎo)抗病毒蛋白GBP、干擾素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、趨化因子ΙΡ-10的產(chǎn)生。因此，利用低成本、 易操作、高效的原核表達(dá)系統(tǒng)制備具有活性的虹鱒IFN- γ 2將具有很好的發(fā)展前景。
[0003] 隨著我國魚類養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展，由于養(yǎng)殖密度的增大和環(huán)境的變化，魚類病害的 發(fā)生越發(fā)頻繁。魚類干擾素作為天然的抗病毒制劑，為防治乃至根治魚類病毒病指出了嶄 新的應(yīng)用前景。我國魚干擾素的人工制備已逐漸受到重視，相關(guān)發(fā)明專利有3項(xiàng)，其中虹鱒 α干擾素制備及純化的發(fā)明專利有1項(xiàng)（2012年），2013年我國學(xué)者也對虹鱒I型干擾素 (rtIFN3)進(jìn)行了人工制備。傳染性造血器官壞死?。↖nfectious Hematopoietic Necrosis, IHN)常引起魚苗或幼魚高死亡率，并能隱性感染，是目前我國虹鱒養(yǎng)殖業(yè)的威脅因素之一， 但截至目前還沒有文獻(xiàn)明確闡述傳染性造血器官壞死病病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus, IHNV)對虹鱒干擾素的敏感性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供rtIFN-Y2蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重 組載體的用途。
[0005] 本發(fā)明提供的rtIFN-Y 2蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體在制 備抑制傳染性造血器官壞死病病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0006] 所述rtIFN- γ 2蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
[0007] 上述應(yīng)用中，所述抑制病毒為抑制病毒的活性；所述rtIFN- γ 2蛋白來源于虹鱒。
[0008] 上述應(yīng)用中，所述rtIFN-Y 2編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述重組載體為將所述rtIFN- γ 2編碼基因插入表達(dá)載體得到的重 組載體，所述表達(dá)載體具體為pET32a，在本發(fā)明的實(shí)施例中，重組載體為將序列表中序列1 所示的IFN- γ 2基因插入載體pET32a的BamHI和Hindlll酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒。
[0010] 上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為試劑盒或疫苗。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制傳染性造血器官壞死病病毒的重組載體。
[0012] 本發(fā)明提供的重組載體，為將所述rtIFN- γ 2編碼基因插入表達(dá)載體得到的重組 載體。
[0013] 上述重組載體中，所述表達(dá)載體為pET32a。
[0014] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種抑制傳染性造血器官壞死病病毒的重組菌。
[0015] 本發(fā)明提供的重組菌，為將上述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，得到的重組菌。
[0016] 上述的重組菌中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
[0017] 本發(fā)明第四個目的是提供一種傳染性造血器官壞死病疫苗。
[0018] 本發(fā)明提供的傳染性造血器官壞死病疫苗，其活性成分為rtIFN_Y2蛋白或其編 碼基因或含有其編碼基因的重組載體或上述重組菌。
[0019] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在rtIFN-Y 2可在大腸桿菌中高效表達(dá)， 0051 μ g/mL的rtIFN-Y2在CHSE-214細(xì)胞上對IHNV的抑制率為50%，并能顯著抑制 IHNV在CHSE-214細(xì)胞上蝕斑的形成，最終確定其抗IHNV的活性為6. 63X 106U/mg，本發(fā)明 能夠補(bǔ)充目前我國無抗IHNV有效制劑的現(xiàn)狀，同時γ干擾素還具有免疫調(diào)節(jié)活性，可將 rtIFN- γ 2進(jìn)一步開發(fā)為虹鱒魚用的天然免疫增強(qiáng)劑或佐劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為基因克隆及重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
[0021] 圖2為重組蛋白表達(dá)與純化
[0022] 圖3為蛋白rtIFN- γ 2抑制IHNV作用
[0023] 圖4為蝕斑減少實(shí)驗(yàn)

【具體實(shí)施方式】
[0024] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0025] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0026] 實(shí)施例1、虹鱒IFN- γ 2基因及表達(dá)其重組載體的獲得
[0027] 1、目的基因的克隆
[0028] 處死虹鱒（Oncorhynchus mykiss，實(shí)驗(yàn)室保存、飼養(yǎng)，為常規(guī)虹鱒魚種），迅速于冰 上無菌剝?nèi)☆^腎和脾，加入適量的含10 % FBS的MEM培養(yǎng)基，注射器內(nèi)柱碾壓后經(jīng)70 μ m的 尼龍網(wǎng)（Fisher Scientific公司產(chǎn)品）過濾，經(jīng)5 μ g/mL的植物血凝素刺激后利用Promega 公司的RNA提取試劑盒提取總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書，以引物Oligo (dT) 18進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一條鏈。
[0029] 參考已發(fā)表的虹鱒IFN- γ 2序列（Genbank :FM864345. 1)，設(shè)計用于擴(kuò)增 rtIFN- γ 2 的上下游引物，上游引物：5' -ATCGGATCCGCTCAGTACACATCAATTAAC-3' (下劃線所 示為BamHI酶切位點(diǎn)），下游引物：5' -GACAAGCTTTTACATGATGTGTGATTTGAG-3' (下劃線所示 為HindllI酶切位點(diǎn)）。
[0030] 以上述cDNA為模板，用上述上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0031] PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性7min，94°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸 30sec，共25個循環(huán)后，再進(jìn)行72°C終延伸lOmin。
[0032] 將PCR產(chǎn)物電泳檢測，結(jié)果如圖1A所示，A目的基因的克隆：M. DL2000DNA Marker ; 1.以頭腎cDNA的RT-PCR擴(kuò)增；2.以脾臟cDNA的RT-PCR ;3.陰性對照，圖1A顯示以經(jīng) ΡΗΑ刺激后的頭腎、脾淋巴細(xì)胞cDNA為模板均能夠成功擴(kuò)增出目的基因 PCR產(chǎn)物，大小約為 489bp。
[0033] 回收PCR產(chǎn)物，連接pMD18T simple載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，得到轉(zhuǎn)化子提取質(zhì) 粒送去測序，結(jié)果，PCR產(chǎn)物具有序列表中序列1所示的核苷酸，為IFN-γ 2基因，其編碼的 蛋白rtIFN- γ 2的氨基酸序列為序列表中序列2。將含有該P(yáng)CR產(chǎn)物的質(zhì)粒命名為pMD18T simple-IFN- γ 2〇
[0034] 2、重組載體的構(gòu)建
[0035] 利用限制性內(nèi)切酶 BamHI 和 Hindlll 切割 pMD18T simple-IFN- γ 2,回收 489bp 的 酶切片段，將酶切片段與經(jīng)過同樣酶切的載體pET32a(Novagen? 69015-3CN)連接，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH5ci，得到轉(zhuǎn)化子。
[0036] 提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR鑒定（引物為上下游引物）、BamHI單酶切鑒定 和雙酶切鑒定（BamHI和Hindlll酶切）。
[0037] 結(jié)果如圖 1B 所示，Ml. DL2000DNA Marker ;M2. DL15000DNA Marker ;1·重組質(zhì)粒的 PCR鑒定；2.重組質(zhì)粒的單切鑒定；3.重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定，可以看出，PCR和雙酶切均 得到489bp的產(chǎn)物，說明為陽性質(zhì)粒。
[0038] 將陽性送去測序，結(jié)果該陽性質(zhì)粒為將序列表中序列1所示的IFN- γ 2基因插入 載體pET32a的BamHI和Hindlll酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，其表達(dá)蛋白rtIFN-Y2,命名為 pET32a-rtIFN-γ 2〇
[0039] 將含有 pET32a-rtIFN_ γ 2 的轉(zhuǎn)化子命名為 DH5 a /pET32a-rtIFN_ γ 2。
[0040] 實(shí)施例2、虹鱒IFN- γ 2基因的應(yīng)用
[0041] 1、蛋白的表達(dá)及表達(dá)形式分析
[0042] 將重組菌 DH5 a /pET32a-rtIFN- γ 2 于含 100 μ g/mL AMP 的 5mL LB 培養(yǎng)基中，37°C， 220rpm震蕩培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)物以1:100比例接種于lOOmLLB培養(yǎng)基中，220rpm 震蕩培養(yǎng)至0D值達(dá)到0. 6-0. 8,加入ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，4h后4000rpm，4°C下離心收集菌 體。
[0043] 以1/10初始培養(yǎng)基體積的PBS重懸菌體，超聲裂解破碎后分為上清和沉淀， SDS-PAGE分析目的蛋白存在形式。
[0044] 結(jié)果如圖2所示，Μ為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1為表達(dá)菌株誘導(dǎo)前；2為表達(dá)菌株誘 導(dǎo)后；3為表達(dá)菌株誘導(dǎo)后超聲上清；4為表達(dá)菌株誘導(dǎo)后超聲沉淀；5為目的蛋白的純化， 可以看出，SDS-PAGE結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的重組菌在預(yù)期位置38. 4KD處有明顯的表達(dá)條帶出 現(xiàn)，而誘導(dǎo)前無此條帶出現(xiàn)，表明目的蛋白能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)中正確表達(dá)（泳道2)，菌體 經(jīng)超聲裂解后取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，顯示目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)（泳 道4)。
[0045] 2、目的蛋白的純化及復(fù)性
[0046] 純化：以適當(dāng)體積的復(fù)性液（2M尿素、0. 4M Tris Base、lmM2-巰基乙醇、0. 5mM氧化 型谷胱甘肽、〇.5mM還原型谷胱甘肽、10%甘油、10%丙酮，pH8.0)充分洗滌包涵體兩次。加 入 3ml 變性液（8M 尿素、0· 1M NaH2P04、0. 01M Tris-cl，ρΗ8· 0)，于 4°C下溶解過夜。
[0047] 復(fù)性：將溶解物逐滴加入到27ml冰浴的復(fù)性液中，邊加邊攪拌，4°C下靜置過夜。 次日SOOOrpmfC下離心30min，將上清轉(zhuǎn)至透析袋中，在含3M尿素的PBS溶液中，于4?下 靜置12h，而后更換兩次PBS溶液（含1M和0M尿素），同樣于4°C下靜置12h。
[0048] 復(fù)性后的電泳結(jié)果如圖2的泳道5所示，所得的包涵體經(jīng)洗滌、溶解后，獲得了純 度較高的目的蛋白rtIFN-γ 2。
[0049] 目的蛋白采用稀釋復(fù)性法進(jìn)行復(fù)性，過程中僅產(chǎn)生少量沉淀，最終利用紫外分光 光度計法測得復(fù)性后目的蛋白濃度約為〇. 207mg/mL。
[0050] 將同樣利用pET32a表達(dá)的其他無關(guān)蛋白的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH5 α中，得到對照 重組菌，采用上述表達(dá)、純化目的蛋白，得到40KD的對照蛋白。
[0051] 3、目的蛋白rtIFN- γ 2在抑制IHNV活性中的中應(yīng)用
[0052] 1)抗病毒實(shí)驗(yàn)
[0053] 于96孔細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)CHSE-214細(xì)胞（ATCC CRL-1681)至單層，將4倍 倍比稀釋純化的rtIFN-Y2蛋白以ΙΟΟμΙ的量加入到96孔板中，于15°C的C0 2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)12h，棄去培養(yǎng)液后加入100TCID5(I的IHNV (記載在如下文獻(xiàn)中：徐黎明，劉洪柏與 盧彤巖，傳染性造血器官壞死病毒_Sn株基質(zhì)蛋白基因克隆及生物信息學(xué)分析.水產(chǎn)學(xué) 報，2013 (09):第1409-1415頁.徐黎明，劉紅柏，徐進(jìn)，盧彤巖，傳染性造血器官壞死病病 毒高效RT-PCR檢測方法的建立.水生生物學(xué)報：第1頁；公眾可從中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑 龍江水產(chǎn)研究所獲得），同時設(shè)立不加干擾素的對照組、加入對照蛋白組、不加病毒的對照 組，繼續(xù)培養(yǎng)并逐日觀察和記錄細(xì)胞病變情況，最后以PBS洗滌細(xì)胞后每孔加入0. 1 %結(jié)晶 紫染色10min，輔助判斷細(xì)胞死亡情況。參照病毒TCID5(I測定方法將病變抑制孔代替毒價 測定中的病變孔，按Reed-Meunch法計算rtIFN- γ 2在CHSE-214細(xì)胞上抗IHNV的活性。
[0054] 抗病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，A.不加干擾素的對照組；B.加入對照蛋白組；C.干 擾素處理組，D.不加病毒對照組。顯示對照蛋白組細(xì)胞生長良好，陽性對照組細(xì)胞（A組和 B組）完全病變，而目的蛋白rtIFN-Y2處理的CHSE-214細(xì)胞無病變發(fā)生；不加病毒的對 照組IHNV抑制率為100 %，不加干擾素的對照組IHNV抑制率為0 %，對照蛋白組IHNV抑制 率為0%。經(jīng)計算目的蛋白rtIFN- γ 2在CHSE-214細(xì)胞上抑制IHNV活性約為6. 63X 106U/ mg〇
[0055] 采用不同濃度的rtIFN- γ 2進(jìn)行上述抗病毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示：
[0056] 表1為不同濃度的rtIFN- γ 2的IHNV抑制率結(jié)果
[0057]

【權(quán)利要求】
1. rtIFN- γ 2蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體在制備抑制傳染性造血 器官壞死病病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述rtIFN- γ 2蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抑制病毒為抑制病毒的活性；所述 rtIFN-γ 2蛋白來源于虹鱒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述rtIFN-γ 2編碼基因的核苷酸 序列為序列表中序列1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述重組載體為將所述 rtIFN- γ 2編碼基因插入表達(dá)載體得到的重組載體，所述表達(dá)載體具體為pET32a。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述產(chǎn)品為試劑盒或疫苗。
6. -種抑制傳染性造血器官壞死病病毒的重組載體，為將所述rtIFN- γ 2編碼基因插 入表達(dá)載體得到的重組載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于：所述表達(dá)載體為pET32a。
8. -種抑制傳染性造血器官壞死病病毒的重組菌，為將權(quán)利要求6或7所述的重組載 體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，得到的重組菌。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組菌，其特征在于：所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
10. -種傳染性造血器官壞死病疫苗，其活性成分為rtIFN-Y2蛋白或其編碼基因或 含有其編碼基因的重組載體或權(quán)利要求8所示的重組菌。
【文檔編號】A61K48/00GK104043111SQ201410293289
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】曹永生, 徐黎明, 趙景壯, 盧彤巖 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所