經(jīng)修飾的人類血漿多肽或Fc骨架和其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供經(jīng)修飾的人類血漿多肽或Fc和其用途。
【專利說明】經(jīng)修飾的人類血漿多肽或Fc骨架和其用途
[0001] 分案說明
[0002] 本申請案是申請日為2007年9月7日，申請?zhí)枮?00780033084. 7 (國際申請?zhí)枮?PCT/US2007/019528)，發(fā)明名稱為經(jīng)修飾的人類血漿多肽或Fc骨架和其用途的專利申請 的分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及經(jīng)修飾以包含至少一個(gè)非天然編碼氨基酸的人類血漿多肽或Fc分 子。

【背景技術(shù)】
[0004] 人類血漿包含多種執(zhí)行多種功能的蛋白質(zhì)。血漿的蛋白質(zhì)組分是密 集研究的焦點(diǎn)。關(guān)于人類血楽的已知蛋白質(zhì)組分的描述，例如參見Anderson 等人，Molecular&Cellular Proteomics, 3. 4:311-326 (2004);和 Ping 等 人，Proteomics，5:3506-3519 (2005)。人類血漿中可見的最常見蛋白質(zhì)是白蛋白。
[0005] 人類白蛋白（也稱為血清白蛋白）是血漿中可見的多功能蛋白質(zhì)。其由于有助于 形成血漿的膠體滲透壓而成為血漿容量和組織液平衡調(diào)控中的重要因素。白蛋白也充當(dāng)血 流中可見的其它分子的運(yùn)載體。白蛋白通常占血漿蛋白的50-60%，且因相對較低的分子量 (66, 500道爾頓）而施加80-85%的血液的膠體滲透壓。白蛋白調(diào)控跨血管流體通量且因此 調(diào)控血管內(nèi)和血管外流體容量，且轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)和脂溶性物質(zhì)。白蛋白溶液在某些類型的休克 或?yàn)l臨休克的治療中通常用于擴(kuò)大血漿容量和維持心輸出量，所述休克包括由灼傷、手術(shù)、 出血或其它外傷或存在循環(huán)容量不足的病狀引起的休克。
[0006] 白蛋白具有約兩周的血液循環(huán)半衰期且天生經(jīng)設(shè)計(jì)為運(yùn)載諸如脂質(zhì)、肽以及 其它蛋白質(zhì)等其它分子。疏水性結(jié)合口袋和游離硫醇半胱氨酸殘基（Cys34)是賦予 這一功能的特征。Cys34因其低pKa(約7)而成為出現(xiàn)在人類血漿中的一個(gè)更具反應(yīng) 性的硫醇基。白蛋白的Cys34也占血漿中硫醇濃度的主要部分（超過80% ) (Kratz 等人，J. Med. Chem.，45 (25) : 5523-33 (2002))。白蛋白通過其反應(yīng)性硫醇充當(dāng)運(yùn)載體 的能力已用于治療用途。舉例來說，描述了使藥物與白蛋白連接，從而改進(jìn)藥物的藥 理學(xué)性質(zhì)（Kremer 等人，Anticancer Drugs, 13: (6) :615-23(2002) ;Kratz 等人，J. Drug Target，8(5):305-18(2000) ;Kratz 等人，J. Med. Chem. ,45(25) :5523-33 (2002); Tanaka 等人，Bioconjug. Chem. ,2(4) :261-9(1991) ;Dosio 等人，J. Control. Release, 76(1-2) :107-17(2001) ;Dings 等人，Cancer Lett. ,194(1) :55-66(2003); Wunder 等人，J.Immunol. ,170(9) :4793-801(2003) ;Christie 等人，Biochem. Pharma col.，36(20):3379-85(1987))。也描述了使肽和蛋白質(zhì)治療劑與白蛋白連接（Holmes 等人，Bioconjug. Chem. ,11 (4) :439-44(2000) ;Leger 等人，Bioorg.Med. Chem. Lett.，13 (20) : 3571-5 (2003) ;Paige 等人，Pharm. Res.，12 (12) : 1883-8 (1995))。也進(jìn)行了 白蛋白與干擾素 a (Albuferon?)和白蛋白與人類生長激素（Albutropin?)以及白蛋白與 白細(xì)胞介素-2 (Albuleukin?)的結(jié)合。所屬領(lǐng)域也描述使用標(biāo)準(zhǔn)重組分子生物學(xué)技術(shù)來產(chǎn) 生白蛋白-蛋白質(zhì)融合物（美國專利第6, 548, 653號，其以引用的方式并入本文中）。所 有結(jié)合物（與白蛋白形成的最后一種結(jié)合物除外）都涉及使用外源白蛋白的離體結(jié)合物形 成。使用外源白蛋白的潛在缺點(diǎn)是污染或免疫原性反應(yīng)。
[0007] 也描述了治療劑與白蛋白的活體內(nèi)連接，例如其中選定肽在給予之前經(jīng)修飾以允 許白蛋白與肽結(jié)合。這種方法是使用二肽基肽酶IV抗性胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)類 似物來描述（Kim等人，Diabetes, 52 (3) :751-9 (2003))。使特異性連接子（[2-[2-[2-馬 來酰亞胺基-丙酰胺基_(乙氧基）_乙氧基]-乙酰胺）連接到肽上所添加的羧基末 端賴氨酸以使得白蛋白的半胱氨酸殘基能夠與肽結(jié)合。其它人已研究使特異性標(biāo)簽連 接到肽或蛋白質(zhì)以增加其活體內(nèi)與白蛋白的結(jié)合（Koehler等人，Bioorg Med. Chem. Lett.，12 (20) : 2883-6 (2002) ;Dennis 等人，J. Biol. Chem.，277 (38) : 35035-35043 (2002); Smith等人，Biocon jug. Chem.，12:750-756(2001))。已使用一種利用小分子藥物的類似方 法，其中藥物的衍生物經(jīng)特定設(shè)計(jì)以具有與白蛋白的半胱氨酸殘基結(jié)合的能力。舉例來說， 這種前藥策略已用于阿霉素（doxorubicin)衍生物，其中阿霉素衍生物在位置34的半胱氨 酸殘基處與內(nèi)源白蛋白結(jié)合（Cys34 ;Kratz 等人，J Med. Chem.，45 (25) : 5523-33 (2002))。 治療劑與白蛋白的活體內(nèi)連接相對于上述離體方法具有優(yōu)勢，這是因?yàn)槭褂脙?nèi)源白蛋白， 從而避免與外源白蛋白的污染或免疫原性反應(yīng)相關(guān)的問題。然而，藥物與內(nèi)源白蛋白的結(jié) 合物的活體內(nèi)形成的現(xiàn)有技術(shù)方法涉及藥物與白蛋白之間的永久性共價(jià)鍵。為達(dá)到可使所 述鍵可裂解或可逆的程度，從結(jié)合物釋放的藥物或肽應(yīng)呈最初化合物的修飾形式。
[0008] 人類血清白蛋白已在包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (Etcheverry等 人，（1986)BioTechnology 8:726 和 EPA 123 544)、畢赤酵母（Pichia pastoris)(EPA 344 459)以及克魯維酵母（Kluyveromyces) (Fleer 等人，（1991)BioTechnology 9:968-975) 的酵母宿主細(xì)胞和大腸桿菌（E. coli)中表達(dá)（Latta等人，（1987)BioTechnology 5:1309-1314)，所述參考文獻(xiàn)以引用的方式并入本文中。
[0009] 天然產(chǎn)生的抗體（Ab)是由兩個(gè)相同免疫球蛋白（Ig)重鏈和兩個(gè)相同輕鏈組成的 四聚物結(jié)構(gòu)。免疫球蛋白是含有通過雙硫鍵結(jié)合在一起的多肽鏈的分子，所述多肽鏈通常 具有兩個(gè)輕鏈和兩個(gè)重鏈。在各鏈中，一個(gè)域（V)具有視分子的抗體特異性而定的可變氨 基酸序列。其它域（C)具有相同種類的分子所共有的相當(dāng)恒定的序列。
[0010] Ab的重鏈和輕鏈由不同域組成。各輕鏈具有一個(gè)可變域（VL)和一個(gè)恒定域（CL)， 而各重鏈具有一個(gè)可變域（VH)和三個(gè)或四個(gè)恒定域（CH)。由約110個(gè)氨基酸殘基組成的 各域是折疊成由兩個(gè)彼此堆疊的β_折疊形成的特征性β_夾層結(jié)構(gòu)，即免疫球蛋白折疊。 VL域各自具有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R1-3)且VH域各自具有多達(dá)四個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R1-4)， 所述互補(bǔ)決定區(qū)為在域的一端連接β鏈的環(huán)或轉(zhuǎn)角。輕鏈和重鏈的可變區(qū)通常對抗原特 異性有貢獻(xiàn)，但個(gè)別鏈對特異性的貢獻(xiàn)不必相同?？贵w分子已發(fā)展到通過使用隨機(jī)CDR環(huán) 與大量分子結(jié)合。
[0011] Ab的功能子結(jié)構(gòu)可通過蛋白水解和通過重組方法制備。所述子結(jié)構(gòu)包括包含通過 單一鏈間雙硫鍵連接的重鏈的VH-CH1域和輕鏈的VL-CL1域的Fab片段和僅包含VH和VL 域的Fv片段以及包含分子的非抗原結(jié)合區(qū)的Fc部分。在一些情況下，單一 VH域保留顯著 的對抗原的親和力（Ward等人，1989, Nature341，554-546)。也已顯示某種單體κ輕鏈將 特異性結(jié)合其抗原（L.Masat等人，1994, PNAS 91:893-896)。發(fā)現(xiàn)分離的輕鏈或重鏈有時(shí) 也保留某種抗原結(jié)合活性（Ward等人，1989, Nature 341，554-546)。
[0012] 另一功能子結(jié)構(gòu)是包含經(jīng)由肽連接子共價(jià)連接的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可 變區(qū)的單鏈 Fv (scFv) (S_z Hu 等人，1996, Cancer Research, 56, 3055-3061)。這些小 (Mr25, 000)蛋白質(zhì)通常保留對單一多肽中的抗原的特異性和親和力且可對較大的抗原特 異性分子提供便利的結(jié)構(gòu)單元。在多種情況下，scFv在循環(huán)中的短半衰期限制其治療效用。
[0013] 使用Ig VH域的一部分作為模板，設(shè)計(jì)出稱為"微抗體"的小蛋白質(zhì)骨架（Pessi等 人，1993, Nature 362, 367-369)。通過使對應(yīng)于VH的CDR1和CDR2的環(huán)隨機(jī)化，且然后使 用噬菌體呈現(xiàn)方法選擇突變體而鑒別出對白細(xì)胞介素-6具有高親和力（解離常數(shù)（K d)為 約 1(Γ7Μ)的微抗體（Martin 等人，1994, EMBO J. 13, 5303-5309)。
[0014] 當(dāng)分析來自駱駝血清的IgG樣物質(zhì)時(shí)，駱駝通常缺乏可變輕鏈域，這提示足夠的 抗體特異性和親和力可能僅源自VH域（三個(gè)或四個(gè)CDR環(huán)）。已制備出具有高親和力的 "駱駝化" VH域，且通過僅隨機(jī)化⑶R3可產(chǎn)生高特異性。
[0015] "微抗體"的替代物為"雙功能抗體"。雙功能抗體是具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小 型二價(jià)且具雙特異性的抗體片段。所述片段包含連接到同一多肽鏈上的輕鏈可變域（\)的 重鏈可變域（ν Η) (νΗ-')。雙功能抗體的大小與Fab片段類似。通過使用太短而不允許在同 一鏈上的兩個(gè)域之間配對的連接子，迫使所述域與另一鏈的互補(bǔ)域配對并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié) 合位點(diǎn)。這些二聚抗體片段或"雙功能抗體"是二價(jià)的且具雙特異性。參見P.Holliger等 人，PNAS 90:6444-6448(1993)。
[0016] 抗體片段包括除全長形式以外的抗體的任何形式。本文中的抗體片段包括為 存在于全長抗體內(nèi)的較小組分的抗體和已經(jīng)工程化的抗體?？贵w片段包括（但不限 于）Fv、Fc、Fab以及（Fab'） 2、單鏈Fv(scFv)、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、 雙功能雜交抗體、⑶R1、⑶R2、⑶R3、⑶R的組合、可變區(qū)、構(gòu)架區(qū)、恒定區(qū)等（Maynard 和 Georgiou，2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76 ; Hudson, 1998, Cur r. Op in. Biotechnol. 9:395-402)。
[0017] 已制備出CDR肽和有機(jī)CDR模擬物（Dougall等人，1994，Trends Biotechnol. 12, 372-379)。⑶R肽是對應(yīng)于抗體的⑶R環(huán)的氨基酸序列的通常為環(huán)狀的短 肽。⑶R環(huán)會引起抗體-抗原相互作用。已顯示⑶R肽和有機(jī)⑶R模擬物保留某種結(jié)合親 和力（Smyth 和 von Itzstein, 1994, J. Am. Chem.Soc. 116, 2725-2733)。已在不損失親和 力的情況下將小鼠 CDR移植到人類Ig構(gòu)架上（Jones等人，1986, Nature 321，522-525 ; Riechmann 等人，1988)。
[0018] 在體內(nèi)，從大型文庫選擇特異性Ab并使其擴(kuò)增（親和力成熟）。這些過程可在活 體外使用組合文庫技術(shù)重現(xiàn)。Ab片段在噬菌體表面上的成功呈現(xiàn)使得有可能產(chǎn)生和篩選大 量 CDR 突變（McCafferty 等人，1990, Nature 348,552-554 ;Barbas 等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7978-7982 ;Winter 等人，1994, Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455)。通過 這種技術(shù)產(chǎn)生數(shù)目增加的Fab和Fv(和其衍生物）。這種組合技術(shù)可與Ab模擬技術(shù)組合。
[0019] 多個(gè)可潛在充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)骨架的蛋白質(zhì)域已表達(dá)為與噬菌體衣殼蛋白的融合物。 綜述見于 Clackson 和 Wells, Trends Biotechnol. 12:173-184(1994)中。已使用這些蛋 白質(zhì)域中的數(shù)種作為呈現(xiàn)隨機(jī)肽序列的骨架，所述蛋白質(zhì)域包括牛胰腺胰蛋白酶抑制劑 (Roberts 等人，PNAS 89:2429-2433 (1992))、人類生長激素 （Lowman 等人，Biochemistry 30:10832-10838(1991) ;Venturini 等人，Protein Peptide Letters 1:70-75(1994))以 及鏈球菌的 IgG結(jié)合域（O'Neil 等人，Techniques in Protein Chemistry V(Crabb，L編）， 第517-524頁，Academic Press, San Diego (1994))。這些骨架已呈現(xiàn)單一隨機(jī)化環(huán)或 區(qū)。已使用淀粉酶抑肽（tendamistat)作為絲狀噬菌體M13上的提呈骨架（presentation scaffold)(McConnell 和 Hoess, 1995, J. Mol. Biol. 250:460-470)。
[0020] 免疫球蛋白的Fc部分包括（但不限于）通過從抗體中去除兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)（Fab 片段）獲得的抗體片段。一種去除Fab片段的方法是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白。因 此，F(xiàn)c部分是由來自兩個(gè)重鏈的恒定區(qū)的大小近似相等的片段形成，所述片段通過非共價(jià) 相互作用和雙硫鍵締合。Fc部分可包括鉸鏈區(qū)且延伸穿過抗體的CH2和CH3域到達(dá)C-末 端。人類和小鼠免疫球蛋白的代表性鉸鏈區(qū)可見于Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck，C. A. K.編，W.H. Freeman and Co. ,1992 中，其教不以引用的方式并入本 文中。Fc部分可進(jìn)一步包括一個(gè)或一個(gè)以上糖基化位點(diǎn)。所屬領(lǐng)域中熟知多種含有鉸鏈 區(qū)、CH2和CH3域以及一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的代表性Fc蛋白的氨基酸序列。
[0021] 存在五種類型的具有不同效應(yīng)功能和藥物動力學(xué)性質(zhì)的人類免疫球蛋白Fc區(qū)： IgG、IgA、IgM、IgD以及IgE。IgG是血清中最豐富的免疫球蛋白。IgG還具有任何免疫球蛋 白中最長的血清半衰期（23天）。不同于其它免疫球蛋白，IgG在與Fc受體結(jié)合后可有效 地再循環(huán)。存在四個(gè)IgG亞類G1、G2、G3以及G4,其各自具有不同的效應(yīng)功能。G1、G2以及 G3能結(jié)合Clq和固定補(bǔ)體，而G4則不能。雖然G3能夠比G1有效地結(jié)合Clq，但G1在介導(dǎo) 補(bǔ)體導(dǎo)向的細(xì)胞溶解中更有效。G2以極低效率固定補(bǔ)體。IgG中的Clq結(jié)合位點(diǎn)位于CH2 域的羧基末端區(qū)。
[0022] 所有IgG亞類都能夠結(jié)合Fc受體（CD16、CD32、CD64)，其中G1和G3比G2和G4 有效。IgG的Fc受體結(jié)合區(qū)是由位于CH2域的鉸鏈區(qū)和羧基末端區(qū)中的殘基形成。
[0023] IgA可以單體形式和通過J-鏈結(jié)合在一起的二聚物形式存在。IgA是血清中第二 豐富的Ig，但其半衰期僅為6天。IgA具有三種效應(yīng)功能。其結(jié)合巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì) 胞上的IgA特異性受體，所述受體分別驅(qū)動吞噬作用和脫粒作用。其也可經(jīng)由未知的替代 途徑固定補(bǔ)體。
[0024] IgM是表達(dá)為通過J-鏈結(jié)合在一起的五聚物或六聚物。IgM具有5天的血清半衰 期。其經(jīng)由位于CH3域中的結(jié)合位點(diǎn)微弱地結(jié)合Clq。IgD具有3天的血清半衰期。尚不 清楚哪些效應(yīng)功能是歸因于這種Ig。IgE是單體Ig且具有2. 5天的血清半衰期。IgE結(jié)合 驅(qū)動脫粒作用且引起促發(fā)炎劑釋放的兩種Fc受體。
[0025] 本發(fā)明的多肽可含有上述同種型中的任一種，或可含有補(bǔ)體和/或Fc受體結(jié)合功 能已改變、變化或消除的突變Fc區(qū)。本發(fā)明的多肽可含有上述同種型中的任一種，或可含 有效應(yīng)功能已改變、變化或消除的突變Fc區(qū)。因此，本發(fā)明的多肽可含有免疫球蛋白的整 個(gè)Fc部分、免疫球蛋白的Fc部分的片段或其類似物。
[0026] 本發(fā)明的多肽可由單鏈蛋白質(zhì)組成或呈多鏈多肽形式?？僧a(chǎn)生兩個(gè)或兩個(gè)以上Fc 蛋白，以致其通過天然形成于Fc區(qū)之間的雙硫鍵相互作用。這些多聚物就共軛分子來說可 為同源的，或其可在融合蛋白的Fc部分的N-末端含有不同的共軛分子。
[0027] Fc或Fc樣區(qū)可用于延長與其融合的化合物的活體內(nèi)血漿半衰期。因?yàn)橛傻鞍姿?解所產(chǎn)生的IgG的Fc區(qū)具有與完整IgG分子相同的活體內(nèi)半衰期且Fab片段快速降解，所 以認(rèn)為用于延長半衰期的相關(guān)序列駐留在CH2和/或CH3域中。另外，文獻(xiàn)中已顯示不結(jié)合 高親和力Fc受體或Clq的IgG變異體的分解代謝率與親本野生型抗體的清除速率很難區(qū) 分，表明分解代謝位點(diǎn)不同于參與Fc受體或Clq結(jié)合的位點(diǎn)。[Wawrzynczak等人，（1992) Molecular Immunology 29:221]。使用鼠類IgGl Fc區(qū)的定點(diǎn)誘變研究提示，控制分解代 謝率的IgGl Fc區(qū)的位點(diǎn)位于CH2-CH3域的界面處。Fc區(qū)可在分解代謝位點(diǎn)處經(jīng)修飾以優(yōu) 化融合蛋白的半衰期。用于本發(fā)明的融合蛋白的Fc區(qū)可源自IgGl或IgG4 Fc區(qū)，且可含 有CH2和CH3區(qū)（包括鉸鏈區(qū)）。
[0028] 可產(chǎn)生包含F(xiàn)c和一個(gè)或一個(gè)以上其它分子（包括（但不限于）多肽）的嵌合分 子。嵌合分子可含有Fc的特異性區(qū)或片段和其它分子。任何所述片段都可由蛋白質(zhì)通過 標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)方法來制備，或通過表達(dá)編碼所述片段的多核苷酸來制備。多肽或其片段可 以包含人類血清白蛋白（HSA)、Fc或其部分的融合蛋白形式產(chǎn)生?？赏ㄟ^融合多肽與a)免 疫球蛋白的Fc部分、b)免疫球蛋白的Fc部分的類似物以及c)免疫球蛋白的Fc部分的片 段來產(chǎn)生融合物。
[0029] 最近，已報(bào)導(dǎo)蛋白質(zhì)科學(xué)中的一種全新技術(shù)，其有希望克服與蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異 性修飾相關(guān)的許多限制。具體來說，已向原核生物大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli) (例如 L. Wang 等人，(2001). Science 292:498-500)和真核生物釀酒酵母（Sacchromyces cerevisiae，S. cerevisiae)(例如 J. Chin 等人,Science 301:964-7 (2003) ;Drabkin 等人，（1996)Mol. Cell. Biol.，16:907)以及哺乳動物細(xì)胞（Sakamoto 等人，（2002) Nucleic AcidsRes. 30:4692)的蛋白質(zhì)生物合成機(jī)構(gòu)中添加新穎組件，所述組件使得 能夠?qū)⒎沁z傳編碼氨基酸在活體內(nèi)并入蛋白質(zhì)中。已使用這種方法響應(yīng)琥珀密碼子 TAG將多種具有新穎化學(xué)、物理或生物性質(zhì)的新穎氨基酸有效且高保真地并入大腸桿 菌和酵母中的蛋白質(zhì)中，所述氨基酸包括光親和標(biāo)記（photoaffinity label)和光致異 構(gòu)化氨基酸、光交聯(lián)氨基酸（例如參見Chin, J.W.等人，(2002)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:11020-11024 ；和 Chin, J. W.等人，（2002) T. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027)、 酮基氨基酸、含重原子的氨基酸以及糖基化氨基酸。例如參見J. W. Chin等 人,(2002), Tournalof the American Chemical Society 124:9026-9027 ；J.ff. Chin 和 P. G. Schultz, (2002). ChemBioChem 3(11):1135-1137 ;J. W. Chin 等人，(2002). PNAS United States of America99:11020-11024 ;以及 L. Wang 和 P. G. Schultz, (2002)，Chem. Comm.，1:1-11。所有參考文獻(xiàn)都以全文引用的方式并入本文中。這些研究已證明有可能 選擇性和常規(guī)地引入諸如酮基、炔基以及疊氮部分等化學(xué)官能團(tuán)，其在蛋白質(zhì)中未見，對20 種常見的遺傳編碼氨基酸中可見的所有官能團(tuán)來說都具有化學(xué)惰性且可用于有效地且選 擇性反應(yīng)以形成穩(wěn)定共價(jià)鍵。
[0030] 在蛋白質(zhì)中并入非遺傳編碼氨基酸的能力允許引入可提供天然存在的官能團(tuán)的 有價(jià)值替代物的化學(xué)官能團(tuán)，諸如賴氨酸的ε -NH2、半胱氨酸的巰基-SH、組氨酸的亞氨基 等。已知本文中所述的某些化學(xué)官能團(tuán)（諸如羰基、炔以及疊氮部分）對20種常見的遺傳 編碼氨基酸中可見的官能團(tuán)來說都具有惰性，但其干凈且有效地反應(yīng)以形成穩(wěn)定鍵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0031] 本發(fā)明提供人類血楽蛋白（human plasma protein, hPP)家族成員，包括（但 不限于）充當(dāng)其它分子的運(yùn)載體的血漿蛋白?？蛇m用于本發(fā)明的hPP包括（但不限 于）下列公開文獻(xiàn)中所列的那些蛋白質(zhì)，這些公開文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文 中：Anderson 等人，Molecular&Cellular Proteomics, 3. 4:311-326(2004);和 Ping 等 人，Proteomics，5:3506-3519(2005)。一些已知的hPP包括（但不限于）α 1-抗胰凝乳蛋 白酶、抗胰蛋白酶、α?-抗胰蛋白酶、前白蛋白、人類白蛋白（人類血清白蛋白）、α?-脂 蛋白、A-γ球蛋白、α 2-巨球蛋白、α 1-微球蛋白、α 2-微球蛋白、β 2-微球蛋白、本-周 蛋白（Bence Jones protein)、膽汁分泌組分、補(bǔ)體蛋白3、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白、脂肪酸結(jié)合 蛋白、鐵蛋白、鐵蛋白Η鏈、纖維蛋白原、抑胃肽（gastricinhibitory peptide)、球蛋白、 結(jié)合球蛋白、血紅蛋白、血紅蛋白A、血紅蛋白A1C、血紅蛋白F、糖化血紅蛋白、盤狀血紅蛋 白（pan hemoglobin)、乳鐵蛋白、脂肪酶、溶菌酶、mutY、肌紅蛋白、心臟肌紅蛋白、血清類 粘蛋白（orosmucoid)、類風(fēng)濕因子、胰泌素（secretin)、血清素（serotonin)、甲狀腺球蛋 白、甲狀腺素、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine)、轉(zhuǎn)移蛋白 (transferring)、維生素 D結(jié)合蛋白以及其包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的變異 體形式。本發(fā)明還提供包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的人類Fc (hFc)。
[0032] 在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含一個(gè)或一個(gè)以上翻譯后修飾。在一些實(shí)施例中， hPP或hFc與連接子、聚合物或生物活性分子連接。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc與雙功能 或多功能聚合物、雙功能或多功能連接子或至少一個(gè)其它生物活性分子連接。
[0033] 在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。在一些實(shí)施例中，水溶 性聚合物包含聚（乙二醇）部分。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸經(jīng)由連接子與水溶 性聚合物連接，或直接與水溶性聚合物鍵結(jié)。在一些實(shí)施例中，聚（乙二醇）分子是雙功能 或多功能聚合物。在一些實(shí)施例中，雙功能或多功能聚合物與第二多肽連接。在一些實(shí)施 例中，第二多肽是生物活性分子。
[0034] 在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含至少兩個(gè)與水溶性聚合物、連接子或生物活性分 子連接的氨基酸。在一些實(shí)施例中，至少一個(gè)氨基酸是非天然編碼氨基酸。
[0035] 在一些實(shí)施例中，包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的hPP是人類白蛋白 (hA)，其在所屬領(lǐng)域中也稱為人類血清白蛋白。hA可在多肽序列的582個(gè)位置中的一個(gè)或 一個(gè)以上位置處經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸取代，包括（但不限于）下列位置中 的一個(gè)或一個(gè)以上位置：位置1( S卩，在N-末端）之前、17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、 94、111、114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、 363、364、365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、 562、564、574、581以及位置582(即，在蛋白質(zhì)的羧基末端）之后（SEQ ID N0:1)。
[0036] hFc可在多肽序列的一個(gè)或一個(gè)以上位置處經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸 取代，包括（但不限于）位置1(即，在N-末端）之前和N-末端（SEQ ID N0:22)。
[0037] 在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含調(diào)節(jié)hPP或hFc對hPP或hFc受體或結(jié)合搭配物 的親和力的取代、添加或缺失，所述搭配物包括（但不限于）蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、多肽、小分 子或核酸。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含當(dāng)與無取代、添加或缺失的相應(yīng)hPP或hFc的 穩(wěn)定性相比時(shí)增加 hPP或hFc的穩(wěn)定性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc 包含當(dāng)與無取代、添加或缺失的相應(yīng)hPP或hFc的免疫原性相比時(shí)調(diào)節(jié)hPP或hFc的免疫 原性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含當(dāng)與無取代、添加或缺失的相 應(yīng)hPP或hFc的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間相比時(shí)調(diào)節(jié)hPP或hFc的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間的 取代、添加或缺失。
[0038] 在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含當(dāng)與無取代、添加或缺失的相應(yīng)hPP或hFc的水 溶性相比時(shí)增加 hPP或hFc的水溶性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包 含當(dāng)與無取代、添加或缺失的相應(yīng)hPP或hFc的溶解性相比時(shí)增加宿主細(xì)胞中所產(chǎn)生的hPP 或hFc的溶解性的取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含當(dāng)與無取代、添加 或缺失的相應(yīng)hPP或hFc的表達(dá)或合成相比時(shí)增加 hPP或hFc在宿主細(xì)胞中的表達(dá)或增加 hPP或hFc的活體外合成的取代、添加或缺失。包含這種取代的hPP或hFc保留激動活性且 保留或提高宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平。在一些實(shí)施例中，hPP或hFc包含當(dāng)與無取代、添加或 缺失的相應(yīng)hPP或hFc的蛋白酶抗性相比時(shí)增加 hPP或hFc的蛋白酶抗性的取代、添加或 缺失。
[0039] 在一些實(shí)施例中，hPP或hFc中的氨基酸取代可為經(jīng)天然存在或非天然存在的氨 基酸取代，只要至少一個(gè)取代是經(jīng)非天然編碼氨基酸取代即可。
[0040] 在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基、乙?；毖趸?、肼基、酰肼基、氨 基脲基（semicarbazide group)、疊氮基、炔基、苯胺氨基或糖部分。
[0041] 在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基 酸具有如下結(jié)構(gòu)：
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種hPP或hA多肽，其包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一個(gè)或一個(gè)以 上翻譯后修飾。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述多肽與連接子、聚合物或生物活性 分子連接。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的hPP或hA多肽，其中所述多肽與水溶性聚合物連接。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述多肽與雙官能聚合物、多官能聚合 物、雙官能連接子、多官能連接子或至少一個(gè)生物活性分子連接。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的hPP或hA多肽，其中所述連接子或聚合物與第二種多肽連 接。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的hPP或hA多肽，其中所述第二種多肽為生物活性分子。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚（乙二醇）部 分。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物與所述hPP或hA多 肽中存在的非天然編碼氨基酸連接。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸是在選自由以下殘基 組成的群組的位置處經(jīng)取代：SEQ ID ΝΟ:1 的 17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、 114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、 365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、 574、581。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一個(gè)或一個(gè)以 上調(diào)節(jié)所述hPP或hA的至少一種生物活性的氨基酸取代、添加或缺失。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一個(gè)或一個(gè)以 上增加所述hPP或hA多肽的穩(wěn)定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一個(gè)或一個(gè)以 上增加所述hPP或hA多肽在重組宿主細(xì)胞中的表達(dá)或活體外合成的所述hPP或hA多肽的 氨基酸取代、添加或缺失。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一個(gè)或一個(gè)以 上增加所述hPP或hA多肽的蛋白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸與不與所述多 肽中的20種常見氨基酸中的任一種反應(yīng)的連接子、聚合物或生物活性分子反應(yīng)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧 基、餅基、醜餅基、氣基脈基、置氣基或塊基。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸具有如下結(jié) 構(gòu)：
其中η為0-10況為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；R2為Η、烷基、芳基、經(jīng)取代 烷基以及經(jīng)取代芳基；且R3為Η、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且R4為Η、氨基酸、多 肽或羧基末端修飾基團(tuán)。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含氨氧基。
20. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含酰肼基。
21. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含肼基。
22. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸殘基包含氨基 脈基。
23. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸殘基包含疊氮 基。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸具有如下結(jié) 構(gòu)：
其中η為0-10成為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基、經(jīng)取代芳基或不存在；X為0、N、S或不存 在；m為0-10 ;R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且R3為H、氨基酸、多肽或羧基末 端修飾基團(tuán)。
25. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含炔基。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸具有如下結(jié) 構(gòu)：
其中η為0-10成為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；X為0、N、S或不存在；m為 0-10 ;馬為!1、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)；且馬為!1、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基 團(tuán)。
27. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物具有約0. lkDa與約 lOOkDa之間的分子量。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物具有約0. lkDa與 約50kDa之間的分子量。
29. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通過使包含含羰基的氨基酸的hPP或 Μ多肽與包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的水溶性聚合物反應(yīng)來制備。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的hPP或hA多肽，其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基 通過酰胺鍵與所述水溶性聚合物連接。
31. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通過使包含羰基的水溶性聚合物與包 含包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然編碼氨基酸的多肽反應(yīng)來制備。
32. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通過使包含含炔的氨基酸的hPP或hA 多肽與包含疊氮部分的水溶性聚合物反應(yīng)來制備。
33. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其是通過使包含含疊氮基的氨基酸的hPP 或Μ多肽與包含炔部分的水溶性聚合物反應(yīng)來制備。
34. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的hPP或hA多肽，其中所述疊氮基或炔基通過酰胺鍵與水溶 性聚合物連接。
35. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物為分支或多臂聚合 物。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物的各分支具有約 lkDa與約lOOkDa之間的分子量。
37. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含糖部分。
38. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的hPP或hA多肽，其中所述連接子、聚合物或生物活性分子經(jīng) 由糖部分與所述多肽連接。
39. -種編碼SEQ ID N0:1中所述的氨基酸序列的經(jīng)分離多核苷酸分子，其包含選 擇密碼子，其中所述選擇密碼子是選自由琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子（opal codon)、獨(dú)特密碼子、稀有密碼子以及四個(gè)堿基的密碼子組成的群組。
40. -種制備根據(jù)權(quán)利要求3所述的hPP或hA多肽的方法，所述方法包含使包含非天 然編碼氨基酸的經(jīng)分離hPP或hA多肽與包含與所述非天然編碼氨基酸反應(yīng)的部分的連接 子、聚合物或生物活性分子接觸。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述聚合物包含選自由水溶性聚合物和聚（乙 二醇）組成的群組的部分。
42. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼 基、餅基、氣基脈基、置氣基或塊基。
43. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基部分且所述連 接子、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼和氨基脲部分。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分通過酰胺鍵 與所述連接子、聚合物或生物活性分子連接。
45. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含炔部分且所述連接 子、聚合物或生物活性分子包含疊氮部分。
46. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含疊氮部分且所述連 接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
47. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述疊氮部分或炔部分通過酰胺鍵與連接子、 聚合物或生物活性分子連接。
48. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述聚（乙二醇）部分具有約O.lkDa與約 lOOkDa之間的平均分子量。
49. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述聚（乙二醇）部分為分支或多臂聚合物。
50. -種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載 劑。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的組合物，其中所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連 接。
52. -種治療患有由hPP或hA調(diào)節(jié)的病癥的患者的方法,所述方法包含向所述患者給 予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求50所述的組合物。
53. -種細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求39所述的核酸。
54. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
55. -種制備包含非天然編碼氨基酸的hPP或hA多肽的方法，所述方法包含在允許所 述包含非天然編碼氨基酸的hPP或hA多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含一種或一種以上編碼hPP 或Μ多肽的包含選擇密碼子、正交RNA合成酶和正交tRNA的多核苷酸的細(xì)胞；和純化所述 hPP或hA多肽。
56. -種調(diào)節(jié)hPP或hA多肽的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間的方法，所述方法包含用一個(gè)或 一個(gè)以上非天然編碼氨基酸取代所述hPP或hA多肽中的任何一個(gè)或一個(gè)以上天然存在氨 基酸。
57. -種由具有SEQ ID ΝΟ:1中所示的序列的多核苷酸編碼的hPP或hA多肽，其中所 述多核苷酸包含選擇密碼子且其中所述多肽包含至少一種非天然編碼氨基酸。
58. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸與連接子、聚 合物、水溶性聚合物或生物活性分子連接。
59. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚（乙二醇） 部分。
60. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸是在選自由以下殘 基組成的群組的位置處經(jīng)取代：SEQ ID ΝΟ:1 的 17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、 114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、 365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、 574、581和其任何組合。
61. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨 氧基、醜餅基、餅基、氣基脈基、置氣基或塊基。
62. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的hPP或hA多肽，其中所述聚（乙二醇）部分具有約0. lkDa 與約lOOkDa之間的分子量。
63. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的hPP或hA多肽，其中所述聚（乙二醇）部分為分支或多臂 聚合物。
64. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的hPP或hA多肽，其中所述聚（乙二醇）部分具有約lkDa 與約lOOkDa之間的分子量。
65. -種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求57所述的hPP或hA多肽和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載 劑。
66. -種hPP或hA多肽，其包含一個(gè)或一個(gè)以上增加所述hPP或hA多肽在重組宿主細(xì) 胞中的表達(dá)的氨基酸取代、添加或缺失。
67. -種包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的hPP或hA多肽，其中所述非天然編 碼氨基酸與選自由小有機(jī)分子、以化學(xué)方式合成的肽、用核糖體合成的多肽、聚合物和連接 子組成的群組的分子鍵結(jié)。
68. -種hPP或hA多肽，其包含在單個(gè)氨基酸處通過共價(jià)鍵與所述hPP或hA多肽連接 的水溶性聚合物。
69. 根據(jù)權(quán)利要求68所述的hPP或hA多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚（乙二醇） 部分。
70. 根據(jù)權(quán)利要求68所述的hPP或hA多肽，其中所述與所述水溶性聚合物共價(jià)連接的 氨基酸為非天然編碼氨基酸。
71. 根據(jù)權(quán)利要求70所述的hPP或hA多肽，其中所述非天然編碼氨基酸是在選自如下 群組的位置處經(jīng)取代：對應(yīng)于 SEQ ID ΝΟ:1 的 17、34、55、56、58、60、81、82、86、92、94、111、 114、116、119、129、170、172、173、276、277、280、297、300、301、313、317、321、362、363、364、 365、368、375、397、439、442、495、496、498、500、501、505、515、538、541、542、560、562、564、 574、581。
72. -種包含至少一個(gè)連接子、聚合物或生物活性分子的hPP或hA多肽，其中所述連接 子、聚合物或生物活性分子通過經(jīng)核糖體并入所述多肽中的非天然編碼氨基酸的官能團(tuán)與 所述多肽連接。
73. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一個(gè)或一個(gè)以 上調(diào)節(jié)所述hPP或hA多肽的免疫原性的氨基酸取代、添加或缺失。
74. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的hPP或hA多肽，其中所述hPP或hA多肽包含一個(gè)或一個(gè)以 上調(diào)節(jié)生物活性分子的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間的氨基酸取代、添加或缺失。
75. -種調(diào)節(jié)生物活性分子的免疫原性的方法，所述方法包含用一個(gè)或一個(gè)以上非天 然編碼氨基酸取代所述hPP或hA多肽中的任何一個(gè)或一個(gè)以上天然存在氨基酸。
【文檔編號】A61P43/00GK104193815SQ201410302933
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2007年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2006年9月8日
【發(fā)明者】約瑟夫·謝菲爾, 席雅·諾曼, 理查D.·戴馬基, 斯蒂芬妮·周, 安娜-瑪麗亞·A.·海斯·普特南, 田鋒, 丹尼斯·克拉維茲, 曹豪崇 申請人:Ambrx公司