一種用于抑制vhl基因表達(dá)的抑制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于抑制VHL基因表達(dá)的抑制劑，所述抑制劑為包含有miR-331-3p基因片段的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體由pTARGET質(zhì)粒改造獲得，具體的，是在pTARGET質(zhì)粒的多克隆位點區(qū)域中插入一段包含miR-331-3p基因片段的插入序列。本發(fā)明還進(jìn)一步公開了所述抑制劑的制備方法以及在抑制VHL基因表達(dá)中的應(yīng)用。
【專利說明】-種用于抑制VHL基因表達(dá)的抑制劑及其制備

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于抑制VHL基因表達(dá)的抑制劑及其制 備。

【背景技術(shù)】
[0002] MiRNA的表達(dá)及調(diào)節(jié)異常常見于大量人類腫瘤中，包括肝細(xì)胞性肝癌（HCC)。在 HCC細(xì)胞系中，miRNA芯片分析數(shù)據(jù)表明miR-331-3p可能是其中的一個異常表達(dá)的miRNA。
[0003] MicroRNA是有21-22個核苷酸組成的單鏈非編碼小RNA，廣泛存在于真核生物 細(xì)胞中，通過與革EmRNA3' -非編碼區(qū)域（3, -untranslated regions3' -UTR)的互補配對 在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制（Bartel, 2004 ;Calin & Croce2006)。MiRNA與靶mRNA分子組成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與包括細(xì)胞增殖、細(xì) 胞凋亡、細(xì)胞分化、發(fā)育和逆境應(yīng)答等多種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Gaal & 01ah，2012;Lin et al.，2013)。大量實驗結(jié)果表明miRNA在人類癌癥中普遍失調(diào)。MiRNA能夠抑制涉及癌癥 發(fā)生發(fā)展的下游靶基因表達(dá)，從而作為致癌或者抑癌因子發(fā)揮作用（Zhang et al.，2007)。 MiRNA表達(dá)失調(diào)可能是人類腫瘤發(fā)生的一個常見原因（Croce，2009)。
[0004] HCC是一種常見的癌癥，主要致病因素是慢性HBV感染。有文獻(xiàn)報道病毒感染能 夠干擾細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá)（Lin&Flemington et al.，2011)。大量的研究表明，HBV能夠 通過涉及的miRNAs方式在HCC中發(fā)揮促癌作用（Xu et al.，2013;Wang et al.，2011 ;Zou et al. , 2014) 〇
[0005] 在之前的研究中報道過用基因芯片的方法研究miRNAs在H印G2和H印G2. 2. 15 細(xì)胞中的差異性表達(dá)（Zhang et al.，2011)，從中，我們發(fā)現(xiàn)相對于對照細(xì)胞Η印G2， miR-331-3p在Η印G2. 2. 15細(xì)胞中呈上升的趨勢。同樣有文獻(xiàn)報道過miR-331-3p在其他 腫瘤中，例如：前列腺癌、胃癌、惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中發(fā)揮著重要的作用（Epis et al.，2014; Epis et al.，2012;Epis et al.，2011;Guo et al.，2010)，但是miR-331-3p 是否參與 HCC 發(fā)生發(fā)展以及miR-331-3p的作用有哪些還需要進(jìn)一步的研究。
[0006] VHL (von Hippel-Lindau tumor suppressor)綜合征是一種顯性遺傳的家族繼承 性癌癥綜合征，能夠誘發(fā)各種良性和惡性腫瘤。VHL基因的失活突變是造成VHL綜合征家族 性遺傳的基礎(chǔ)（Maher & Kaelin，1997)。VHL基因編碼的蛋白質(zhì)是包括轉(zhuǎn)錄延生因子B、轉(zhuǎn) 錄延生因子C和cullin-2在內(nèi)的蛋白復(fù)合物，并且具有泛素連接酶E3活性。此蛋白涉及缺 氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor HIF)的泛素化和降解（Cockman&Masson, 2000)。 VHL基因突變與許多腫瘤，例如嗜鉻細(xì)胞瘤、腎透明細(xì)胞癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜的血 管瘤等的形成相關(guān)，表明VHL基因可能在這些癌癥中起到一個腫瘤抑制作用（Latif et al. , 1993 ；Kim & Kaelin, 2004)〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種用于抑制VHL基因表達(dá)的抑制 劑及其制備。
[0008] 本發(fā)明的第一方面，首先公開了一種用于抑制VHL基因表達(dá)的抑制劑，為包含有 miR-331-3p基因片段的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體能夠正確地表達(dá)miR-331-3p基因。
[0009] 較佳的，所述表達(dá)載體由pTARGET質(zhì)粒改造獲得，具體的，是在pTARGET質(zhì)粒的多 克隆位點區(qū)域中插入一段包含miR-331-3p基因片段的插入序列。
[0010] 較佳的，所述插入序列的插入位點為xho I酶切位點和Sal I酶切位點之間。
[0011] 較佳的，所述包含miR-331-3p基因片段的插入序列如SEQIDN0. 1所示。
[0012] 1 AACTTCATTT CTAAATCAAA GTATTTTCTG CACTTTTATT GCACCAATCT GTTACCTTCT
[0013] 61 GTTCATACCA TGACTTMAT MTGCTTACT CAGGCACAGT ACTATCAGCT GACAACGTAC
[0014] 121 AGAAGGCTCC AGAAATGTCA CTCCCATCCC TTAAAGGTTG GTATATGGTC CTGGTACAGT
[0015] 181 CGTGGAGGTC CATATGGGTG MAAGCCCAG AAGTCTACCT GAGCTGAAAG CACTCCCAAG
[0016] 241 GAGTTTGGTT TTGTTTGGGT TTGTTCTAGG TATGGTCCCA GGGATCCCAG ATCMACCAG
[0017] 301 GCCCCTGGGC CTATCCTAGA ACCAACCTAA GCTCGCGCAT CATTCCTGGA ACATCAAGAG
[0018] 361 TGTGAAGACT GAAGATMCC TGAGGCCTAC CAGACATCCT ATATTCACCA AGATTCACAT
[0019] 421 TTTTTGGTAT GTGTGCCTAC ATTTTAGCAA AAATTGGTTG GTTAATCCTT CTAMATTAG
[0020] 481 AGGGATGACA TTGGGTMCA MGTCTTCCC AGCCTTTGGC ATTATAGTAA TTTCTCGCM
[0021] 541 TAGAAATTCC ATACAGATAT TATTGCCAGT GAAGAGAGCT ATTCTTGTTT ATTATCAGTT
[0022] 601 CTATATTTTT AGCTGAAGCA ACTTAGCCCT AAAA
[0023] 較佳的，所述抑制劑的序列如SEQ N0. 4所示。
[0024] 本發(fā)明第二方面，還進(jìn)一步公開了前述抑制劑的制備方法：通過PCR的方法在所 述包含miR-331-3p基因片段的插入序列兩端添加酶切位點序列，采用酶切、連接的方法 將所述miR-331-3p基因片段插入pTARGET質(zhì)粒載體，篩選、鑒定連接正確的連接產(chǎn)物為本 發(fā)明的抑制劑。
[0025] 較佳的，所述抑制劑適用于SMMC7721細(xì)胞等哺乳動物肝癌細(xì)胞系。
[0026] 本發(fā)明第三方面，提供了前述抑制劑用于抑制VHL基因表達(dá)的應(yīng)用。
[0027] 本發(fā)明的抑制劑可以通過本領(lǐng)域任何已知的方式配制藥物組合物來使用。這種組 合物包含活性成分，加上一種或多種藥物可接受的載體、稀釋劑、填充劑、結(jié)合劑及其它賦 形劑，這依賴于給藥方式及所設(shè)計的劑量形式。本領(lǐng)域枝術(shù)人員已知的治療惰性的無機或 有機的載體包括（但不限于）乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蠟、脂肪、多羥基化 合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，諸如此類，各種防腐劑、潤滑劑、分散劑、矯味劑。 保濕剮、抗氧化劑、甜味劑、著色劑、穩(wěn)定劑、鹽、緩沖液諸如此類也可加入其中，這些物質(zhì)根 據(jù)需要用于幫助配方的穩(wěn)定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情況下產(chǎn) 生可接受的口感或氣味，在這種組合物中可以使用的制劑可是其原始化合物本身的形式， 或任選地使用其藥物學(xué)可接受的鹽的形式，本發(fā)明的抑制劑可以單獨給藥，或以各種組合 給藥，以及與其它治療藥劑一起結(jié)合形式給藥。如此配制的組合物根據(jù)需要可選擇本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)姆绞桨岩种苿┻M(jìn)行給藥。使用藥物組合物時，是將安全有效量 的本發(fā)明的抑制劑施用于人，其中口服安全有效量通常至少約100微克/千克體重。當(dāng)然， 具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0028] 本發(fā)明的第四方面，公開了一種抑制VHL基因表達(dá)的方法，所述方法為將有效作 用量的本發(fā)明的所述抑制劑施用于作用對象。
[0029] 所述方法為非疾病的診斷和治療方法。
[0030] 本發(fā)明的有益效果為：
[0031] 本發(fā)明首次構(gòu)建了能夠抑制VHL基因表達(dá)的特殊設(shè)計的抑制劑，且通過大量的實 驗證實，本發(fā)明的抑制劑能夠顯著抑制過表達(dá)miR-331-3p的SMMC7721細(xì)胞中VHL基因在 mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。為進(jìn)一步研究VHL基因的功能提供了新的手段，加快了人們 對VHL基因功能和機制的研究。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖 1. pTARGET-miR-331-3p 抑制 VHL 的表達(dá)
[0033] (a)miR-331-3p 在轉(zhuǎn)染 pTARGET 或者 pTARGET-miR-331-3p 的 SMMC7721 細(xì)胞中的 相對表達(dá)量，以U6為內(nèi)參。
[0034] (b, c)轉(zhuǎn)染 pTARGET 或 pTARGET-miR-331-3p 的 SMMC7721 細(xì)胞中 VHL 的 mRNA 或蛋 白表達(dá)水平。
[0035] 圖2. pTARGET-miR-331-3p通過直接作用于3' -UTR抑制VHL表達(dá)
[0036] (a)pTARGET-miR-331-3p與VHL野生型或突變型3' -UTR結(jié)合位點原理圖；
[0037] (b)在共轉(zhuǎn)染各組不同質(zhì)粒的SMMC7721細(xì)胞中檢測其熒光素酶活 性· *Ρ〈0· 05, **Ρ〈0· 01.

【具體實施方式】
[0038] 下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非 限制本發(fā)明的范圍。
[0039] 實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件，如
[美]Sambrook. J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京：科學(xué)出版社2002 中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重 量計算。
[0040] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0041] 實施例lpTARGET-miR-331-3p質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)驗證
[0042] 首先，我們構(gòu)建了 miR-331-3p的表達(dá)質(zhì)粒，命名為pTARGET-miR-331-3p，并驗證 其過表達(dá)效率。
[0043] 1.試劑
[0044] 限制性內(nèi)切酶Xho I、Sal I購自TaKaRa公司，T4DNA連接酶購自Promega公司。
[0045] 2.細(xì)胞株和載體
[0046] Η印G2 和！fepG2. 2. 15 細(xì)胞于含 10 % 胎牛血清（FBS) (Gibco, USA)、lOOunits/ ml 青霉素和 100 μ g/ 鏈霉素（Hyclone, china)和 1· 2 % 丙酮酸鈉（Hyclone, china)的 MEM(Hyclone, china)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。SMMC7721 細(xì)胞于含 10%胎牛血清（FBS) (Gibco, USA)、 100units/ml 青霉素和 100yg/鏈霉素（Hyclone,china)的 RPMI1640(Hyclone,china) 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。Η印G2、Η印G2. 2. 15和SMMC7721均于含5% C02的37°C恒溫孵箱中培養(yǎng)。 Η印G2和！fepG2. 2. 15以60%的密度接種于六孔板，SMMC7721為45%，根據(jù)使用說明書，使 用 LipofectamineTM2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中。
[0047] 3.實驗方法
[0048] 3. lpTARGET-miR-331-3p 質(zhì)粒的構(gòu)建
[0049] 采用酶切連接的方法構(gòu)建pTARGET-miR-331-3p質(zhì)粒，在pTARGET的多克隆位點區(qū) 域的Xho I酶切位點和Sal I酶切位點之間插入如SEQIDN0. 1所示的包含miR-331-3p的 基因片段的插入序列。具體的，
[0050] (1)采用下表1中的引物，以Η印G2. 2. 15細(xì)胞基因組為模板，PCR擴增出694bp的 含miR-331-3p的基因片段。
[0051 ] 表1實驗所用到的引物
[0052]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于抑制VHL基因表達(dá)的抑制劑，所述抑制劑為包含有miR-331-3p基因片段的 表達(dá)載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑，其特征在于，所述表達(dá)載體由pTARGET質(zhì)粒改造獲 得，即在pTARGET質(zhì)粒的多克隆位點區(qū)域中插入一段包含miR-331-3p基因片段的插入序 列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑，其特征在于，所述插入序列的插入位點為Xho I酶切 位點和Sal I酶切位點之間。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑，其特征在于，所述包含miR-331-3p基因片段的插入 序列如SEQIDN0. 1所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑的序列如SEQIDN0. 4所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑的制備方法，其特征在于，通過PCR的方法在所述包 含miR-331-3p基因片段的插入序列兩端添加酶切位點序列，采用酶切、連接的方法將所述 miR-331-3p基因片段插入pTARGET質(zhì)粒載體，篩選、鑒定連接正確的連接產(chǎn)物為本發(fā)明的 抑制劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一權(quán)利要求所述的抑制劑的用途，是用于抑制VHL基因的表達(dá)。
8. -種抑制VHL基因表達(dá)的方法，所述方法為將有效作用量的所述抑制劑施用于作用 對象。
【文檔編號】A61K48/00GK104120146SQ201410311675
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】湯華, 曹漪伊 申請人:重慶貝羿生物科技有限公司