一種回心康片的制備方法及其在抑制乳腺腫瘤細胞c127細胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種回心康片的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的回心康片的制備方法，由鉤藤780g、回心草910g、何首烏26g、黃芪260g、三七26g、山楂650g、甘草260g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得人參皂苷Rg1含量有很大提高。本發(fā)明還提供了回心康片在制備抑制小鼠乳腺腫瘤細胞C127細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】一種回心康片的制備方法及其在抑制乳腺腫瘤細胞Cl 27細胞增殖藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種回心康片的制備方法及其在抑制小鼠乳腺腫瘤細胞C127細胞增殖藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]回心康膠囊標(biāo)準(zhǔn)號WS-10737(ZD-0737)-2002，記載于國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科心系分冊。由鉤藤780g、回心草910g、何首烏26g、黃芪260g、三七26g、山楂650g、甘草260g作為原料藥制成，具有益氣活血，鎮(zhèn)靜平肝的功效。用于氣虛血瘀，肝陽上亢引起的胸痹，眩暈，癥見胸痹，胸悶，心悸，頭暈等癥，冠心病，高血壓屬上述證候者。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有回心康膠囊在提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的報道，而中藥直接打粉，水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種回心康片的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種回心康片在制備抑制小鼠乳腺腫瘤細胞C127細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的:
一種回心康片的制備方法，由鉤藤780g、回心草910g、何首烏26g、黃芪260g、三七26g、山楂650g、甘草260g作為原料藥制成，所述的制備方法由下列步驟組成:取，三七、何首烏、回心草，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時間180-220min,得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入1L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0.3g。
[0007]上述的回心康片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
[0008]上述的回心康片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25 MPa。
[0009]上述的回心康片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為40°C。
[0010]上述的回心康片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中CO2流量2ml/g生藥.η?η。
[0011]上述的回心康片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取時間為200min。
[0012]上述的回心康片的制備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0013]上述的回心康片的制備方法中，所述微波萃取每次萃取時間為8分鐘。
[0014]上述的回心康片在制備抑制小鼠乳腺腫瘤細胞C127細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0015]現(xiàn)有技術(shù)中，回心康膠囊每次5粒，一日3次?；匦目的z囊服藥量大。采用本發(fā)明方法制備成的回心康片每片重0.3g，每次僅需2片，一日服用3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過下述試驗證明。且制備成片劑，患者隨水吞下即可，服藥量小且無苦味，患者易于接受。
[0016]試驗一、不同方法制備的回心康片中人參阜苷Rgl含量的比較
1、儀器及試藥本發(fā)明回心康片:按實施例1方法制備，使用3012g原料藥，經(jīng)提取制成400片，每片重0.3g。原回心康膠囊，按照WS-10737(ZD-0737)-2002標(biāo)準(zhǔn)方法制備。Agilentl200高效液相色譜儀；METTLER AE240電子分析天平；人參皂苷Rgl對照品(中國藥品生物制品檢定所)。
[0017]2、方法
照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄V D)測定。
[0018]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(20:80)為流動相；檢測波長為203nm。理論板數(shù)按人參皂苷Rgll峰計算應(yīng)不低于6000。
[0019]對照品溶液的制備取在60°C減壓干燥2小時的人參皂苷Rgll對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液,即得。
[0020]本發(fā)明產(chǎn)品供試品溶液的制備取本發(fā)明的回心康片，研細，精密稱定，研細，取1.2g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚適量，加熱回流I小時，棄去乙醚液，藥渣揮去乙醚，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流提取至無色，甲醇液蒸干，殘渣加水20ml溫?zé)崾谷芙?，放冷，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用1%氫氧化鈉溶液振搖提取2次，每次30ml，棄去堿液，正丁醇液用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30ml，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加水15ml，分次溫?zé)崛芙?，放冷，通過已處理好的DlOl型大孔樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm，長15cm)，以水50ml洗脫，棄去水液，再用20%乙醇50ml洗脫，棄去20%乙醇洗脫液，繼用70%乙醇10ml洗脫，收集洗脫液，蒸干,殘渣加甲醇使溶解并定量轉(zhuǎn)移至1ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。
[0021]對照產(chǎn)品供試品溶液的制備取本對照的40片(薄膜衣片除去包衣)，精密稱定，研細，取3g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚適量，加熱回流I小時，棄去乙醚液，藥渣揮去乙醚，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流提取至無色，甲醇液蒸干，殘渣加水20ml溫?zé)崾谷芙猓爬?，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用1%氫氧化鈉溶液振搖提取2次，每次30ml，棄去堿液，正丁醇液用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30ml，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加水15ml，分次溫?zé)崛芙?，放冷，通過已處理好的DlOl型大孔樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm，長15cm)，以水50ml洗脫，棄去水液，再用20%乙醇50ml洗脫，棄去20%乙醇洗脫液，繼用70%乙醇10ml洗脫，收集洗脫液，蒸干,殘渣加甲醇使溶解并定量轉(zhuǎn)移至1ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。
[0022]測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10--1，注入液相色譜儀，測定，即得。
[0023]3、結(jié)果
結(jié)果表明，本發(fā)明回心康片中人參皂苷Rgl的含量為2-4mg/片；而原回心康膠囊中人參皂苷Rgl的含量為0.38mg/袋，每次服用量2片的人參皂苷Rgl含量為原顆粒劑含量的2-4倍，在服用量減少的情況下，人參皂苷Rgl含量有很大提高。
[0024]上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的回心康片，有效成分含量遠遠高于WS-10737 (ZD-0737)-2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的回心康膠囊。

【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作更進一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0026]實施例1
取鉤藤780g、回心草910g、何首烏26g、黃芪260g、三七26g、山楂650g、甘草260g，取三七、何首烏、回心草加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，C02流量2ml/g生藥.π?η，萃取時間200min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入1L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0.3g。
[0027]經(jīng)檢測，成品中人參皂苷Rgl的含量為3.89mg/片。
[0028]實施例2
取鉤藤780g、回心草910g、何首烏26g、黃芪260g、三七26g、山楂650g、甘草260g，取三七、何首烏、回心草加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，C02流量3ml/g生藥.π?η，萃取時間180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入1L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0.3g。
[0029]經(jīng)檢測，成品中人參皂苷Rgl的含量為2.59mg/片。
[0030]實施例3
取鉤藤780g、回心草910g、何首烏26g、黃芪260g、三七26g、山楂650g、甘草260g，取三七、何首烏、回心草加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，C02流量lml/g生藥.π?η，萃取時間220min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入1L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0.3g。
[0031]經(jīng)檢測，成品中人參皂苷Rgl的含量為1.98mg/片。
[0032]實施例4:回心康片抑制小鼠乳腺腫瘤細胞C127細胞增殖的實驗研究資料1.實驗材料 1.1實驗用細胞株
小鼠乳腺腫瘤細胞C127細胞，山東大學(xué)實驗室細胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0033]1.2實驗藥物
研究藥物:本發(fā)明回心康片:按實施例1方法制備。
[0034]藥液儲液:稱取10mg回心康片，溶于5ml無水乙醇中，0.2--m濾器過濾，500--ldoff管分裝，-20°C存儲，同時0.2--m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0035]1.3實驗試劑
DMEM ( GIBCO公司Cat.N0.12100-061 Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810-033 Lot.N0.1088387) ;Trypsin (AMRESC0 公司);EDTA (AMRESC0 公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇(溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公司)；MTT (B1sharp 批號:0793):PBS (實驗室自配);
1.4實驗器材
萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號:DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型號:SPECTRAMAX 190);CO2培養(yǎng)箱(FORMA型號:3111);超凈臺(蘇凈集團安泰公司制造型號:Sff-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號:S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實驗設(shè)備公司型號:DHG9123A);冰箱(西門子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠型號:KA-1000);0.2--m 濾器(MILLIP0RE 型號:SLGP033RB);lcm 培養(yǎng)皿(NEST 公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細胞計數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0036]2.實驗方法
I) L5178Y細胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進行常規(guī)培養(yǎng)(1cm培養(yǎng)皿)，當(dāng)細胞生長至對數(shù)期時，收集細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0.25%胰蛋白酶-0.0496EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，100rpm離心5min，調(diào)整細胞懸液濃度3X 14個/ml。
[0037]2)將細胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液180--1，培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中(37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0038]3)根據(jù)細胞生長情況，一般長至50%_70%，加入回心康片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0039]4) 24h 后加入 20--1 MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT),繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0040]5)4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200--1 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0041]6)同時設(shè)置本底(不加細胞，只加培養(yǎng)液)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個復(fù)孔。
[0042]7)結(jié)果以藥物對細胞的抑制率表示:細胞增值抑制率(%)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)、對照孔OD值X 100%。實驗重復(fù)3次。
[0043]3.統(tǒng)計處理
采用Microsoft Excel 2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗,數(shù)據(jù)以mean土S.D.表不O
[0044]4.實驗結(jié)果
MTT法實驗后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當(dāng)劑量達到5mg/ml時，對L5178Y細胞增殖抑制有差異(P〈0.05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0.01)，當(dāng)劑量達到
15-20mg/ml時有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0045]表1回心康片對L5178Y細胞增殖抑制影響研究(X土SD)

【權(quán)利要求】
1.一種回心康片的制備方法，由鉤藤780g、回心草910g、何首烏26g、黃芪260g、三七26g、山楂650g、甘草260g作為原料藥制成，其特征在于，所述的制備方法由下列步驟組成:取，三七、何首烏、回心草，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時間180-220min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入1L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0.3g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的回心康片的制備方法，其特征在于，所述0)2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的回心康片的制備方法，其特征在于，所述0)2超臨界萃取中萃取壓力為25 MPa。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的回心康片的制備方法，其特征在于，所述0)2超臨界萃取中萃取溫度為40°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的回心康片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中CO2 流量 2ml/g 生藥.min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的回心康片的制備方法，其特征在于，所述0)2超臨界萃取中萃取時間為200min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的回心康片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取功率為700W。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的回心康片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取每次萃取時間為8分鐘。
9.權(quán)利要求1所述的回心康片在制備抑制小鼠乳腺腫瘤細胞C127細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K36/74GK104069211SQ201410311692
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】劉慧 , 關(guān)軍 申請人:關(guān)軍