人源化修飾型抗CD147嵌合抗體HcHAb18及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人源化修飾型抗CD147嵌合抗體HcHAb18及其應(yīng)用。具體而言是在獲得抗人CD147單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞及其抗體HAb18基因的基礎(chǔ)上，制備了抗CD147人鼠嵌合抗體，它的輕鏈可變區(qū)具有SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列，它的重鏈可變區(qū)具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列，在特定宿主細(xì)胞中巖藻糖不結(jié)合于抗體Fc段糖鏈還原端中的N‐乙酰氨基葡萄糖，糖型為甘露糖型(MAN5)，該抗體具有抗體介導(dǎo)的細(xì)胞依賴的細(xì)胞毒作用(ADCC)。本發(fā)明還包括所述的抗CD147嵌合抗體的表達(dá)載體、工程細(xì)胞株及其作為癌癥治療藥物的應(yīng)用。
【專利說明】人源化修飾型抗CD147嵌合抗體HcHAbl 8及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地說，本發(fā)明涉及一種新的人源化修飾型抗⑶147 單克隆嵌合抗體，該抗體能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并且還涉及氨基酸序列和編碼抗體的 核苷酸序列。本發(fā)明還包括該抗體作為用于癌癥治療的藥物的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] ⑶147分子是一種廣泛表達(dá)的細(xì)胞跨膜糖蛋白，在人類中，⑶147共有269個(gè)氨基 酸組成，可分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)。N端起始翻譯后前21個(gè)殘基為信號(hào)肽，22?205 構(gòu)成胞外區(qū)，206?229為跨膜區(qū)，具有典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，C端230?269為胞內(nèi)區(qū)。
[0004] CD147 屬免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF)成員，胞外 4個(gè) 半胱氨酸形成2個(gè)二硫鍵，構(gòu)成兩個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域。X射線晶體衍射分析表明，該分子胞外區(qū) 晶體結(jié)構(gòu)由兩個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域，其中N末端的結(jié)構(gòu)域?yàn)镮gC2 -set，而靠近胞膜的C端結(jié)構(gòu)域 屬于 Igl - set。
[0005] CD147也是一種糖蛋白，在Asp44、Aspl52、Aspl863個(gè)位點(diǎn)能發(fā)生N-糖基化修飾， 使其分子量由去糖基化狀態(tài)下的30kDa上升至35?60kDa。
[0006] CD147的糖基化對(duì)其功能成熟十分重要，與腫瘤的進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。
[0007] 國(guó)內(nèi)外研究均表明，⑶147分子在上皮來源的惡性腫瘤組織中特異性高表達(dá)，如肺 癌、乳腺癌、食道癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、皮膚基底細(xì)胞癌、口腔鱗狀細(xì)胞 寺。
[0008] 申請(qǐng)人:研發(fā)的"⑶147檢測(cè)試劑盒（免疫組化法）"（專利號(hào)：ZL200910022400. 1) 在3045例臨床組織標(biāo)本中的免疫組化染色結(jié)果顯示CD147分子在肺癌、肝癌、胃癌、食管 癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤組織中顯著高表達(dá)（總陽(yáng)性率85. 30%，1694/1986)， 而在正常組織及良性病變組織中低表達(dá)（總陽(yáng)性率7. 27%，77/1059)，尤其在肺癌中顯示 較高的靈敏度（95. 36% )與特異度（97. 96% )。
[0009] 既往研究表明，CD147分子是腫瘤發(fā)展過程重要的功能性膜蛋白，參與多種與癌癥 有關(guān)的現(xiàn)象，如：
[0010] ①⑶147介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的粘附和運(yùn)動(dòng)：腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的⑶147與vinclin 相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞偽足形成，鋪展及粘附；與膜聯(lián)蛋白annxin II相互作用，促進(jìn)腫 瘤細(xì)胞MMP-2分泌，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和侵襲潛能；通過刺激腫瘤細(xì)胞自身及其周圍 的成纖維細(xì)胞，分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶（extracellular matrix metalloproteinase， MMP)，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-11以及MT1-MMP和MT2-MMP等，從而加快腫瘤周圍基 質(zhì)的降解，促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移。在腫瘤的異源移植小鼠模型中，抑制腫瘤細(xì)胞CD147的表達(dá) 或功能，在顯著下調(diào)瘤組織中MMPs表達(dá)的同時(shí)，還可以抑制腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。 CD147促進(jìn)MMPs分泌的機(jī)制，可能是通過活化胞內(nèi)信號(hào)蛋白ERK1/2、MAPK和FAK，以及促進(jìn) 胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流實(shí)現(xiàn)的。
[0011] ②⑶147參與腫瘤細(xì)胞的無氧代謝：⑶147是單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（monocarboxylate transporter)MCT-l和MCT-4的重要分子伴侶。CD147可以與MCT-1和MCT-4相互結(jié)合，輔 助它們?cè)诩?xì)胞膜上正確定位，并繼續(xù)調(diào)節(jié)它們對(duì)乳酸代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。由于腫瘤細(xì)胞 主要依靠無氧代謝產(chǎn)生能量，因此CD147可間接通過影響MCT的表達(dá)和功能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞 的能量代謝。
[0012] ③CD147促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥：耐藥是惡性腫瘤臨床治療失敗的重要原因。多藥耐 藥（multi-drug resistance，MDR)的腫瘤細(xì)胞通過過度表達(dá)P-糖蛋白（P-glycoprotein， Ρ-g)將進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的化療藥物泵出細(xì)胞以逃避化療藥的殺傷。CD147分子在促進(jìn)MMPs 分泌時(shí)，通過共表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制影響MDR基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)P-g的表達(dá)，從而可誘導(dǎo)腫瘤的多 藥耐藥。Kanekura等證實(shí)⑶147通過P-g導(dǎo)致MDR，所以下調(diào)⑶147的表達(dá)可能是一個(gè)有 效抵制MDR的靶點(diǎn)。Wang等在體外實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，沉默胃癌SGC7901細(xì)胞系⑶147的表 達(dá)，可使其對(duì)順鉬的化療敏感性增加。Zou等在人卵巢癌H0-8910細(xì)胞系中證實(shí)，通過抑制 ⑶147的表達(dá)可增加對(duì)紫杉醇的敏感性。Kuang在人口腔上皮鱗癌中同樣發(fā)現(xiàn)⑶147在耐 藥過程中起著重要的作用。Tang證明⑶147促進(jìn)p-TFII-I細(xì)胞核內(nèi)定位，上調(diào)未折疊蛋白 反應(yīng)（UPR)的關(guān)鍵因子Bip表達(dá)，引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR，從而抑制凋亡及對(duì)藥物 的不敏感性，抑制CD147分子可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，并可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)現(xiàn)有抗腫瘤藥物 的敏感性。
[0013] ④⑶147上調(diào)VEGF表達(dá)促進(jìn)腫瘤新生血管形成：VEGF是影響腫瘤形成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn) 移的關(guān)鍵因子。⑶147可以上調(diào)VEGF的表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管的生長(zhǎng)；抑制⑶147的表達(dá)，能 夠顯著抑制VEGF的分泌和腫瘤血管的生成。
[0014] ⑤⑶147結(jié)合多種分子參與相互作用：⑶147蛋白的跨膜段存在一個(gè)在進(jìn)化上高 度保守的負(fù)電荷谷氨酸，是其可以與多種細(xì)胞膜蛋白發(fā)生相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，同時(shí)也提 示⑶147可以通過與多種蛋白的相互作用，影響細(xì)胞的多種生理活動(dòng)。⑶147可以通過與 0)98、Integrin、caveolin-1、cyclophilins(CyP)等多種蛋白相互作用，從能量代謝、細(xì) 胞-基質(zhì)相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)方面影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程。
[0015] 此外，多項(xiàng)回顧性研究還表明CD147分子在腫瘤組織中的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤病人的 預(yù)后之間，存在著緊密的相關(guān)性。在非小細(xì)胞肺癌病人中，CD147表達(dá)增高的水平與病人的 預(yù)后情況密切相關(guān)。
[0016] 因此，CD147分子已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，其中抗體藥物"利卡汀"的研制成功， 證明了該靶點(diǎn)成藥的安全性和有效性。
[0017] 利卡?。ǖ鈁1311]美妥昔單抗注射液（Iodine[mI]Metuximab Injection))，是 以CD147分子為靶點(diǎn)的首個(gè)用于原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的單克隆抗體免疫靶向藥物。該藥物 通過美妥昔單抗特異性結(jié)合肝癌細(xì)胞膜上的高表達(dá)的CD147抗原，將單抗荷載的放射性碘 [ 1311]輸送到腫瘤部位，通過高能β離子的"交叉火力"作用，發(fā)揮局部腫瘤殺傷作用。
[0018] 多中心臨床試驗(yàn)結(jié)果表明：利卡汀對(duì)肝癌移植術(shù)后復(fù)發(fā)降低了 21% ;對(duì)肝癌射頻 消融術(shù)后復(fù)發(fā)降低了 34%。治療原發(fā)性肝癌臨床控制率86. 30%，臨床有效率27. 40%，中 位生存時(shí)間20個(gè)月，顯示了較好的安全性和有效性。但利卡汀由于荷載有放射性同位素碘 [1311]，因此在臨床應(yīng)用、醫(yī)護(hù)人員防護(hù)、廢棄物處理等環(huán)節(jié)存在一定局限。
[0019] 單克隆抗體（McAb)以其高特異性、高親和力、毒副作用小、免疫原性低、體內(nèi)作用 時(shí)間長(zhǎng)、可利用體內(nèi)自身免疫系統(tǒng)發(fā)揮療效等優(yōu)點(diǎn)，在許多疾病的診療中得到廣泛應(yīng)用，成 為新型藥物研制的一條有效途徑。
[0020] 然而，眾多的研究表明，鼠源性單克隆抗體具有相對(duì)較短的半衰期，并且用于 人類時(shí)，缺乏一些免疫球蛋白的基本功能特性，如補(bǔ)體依賴R細(xì)胞毒作用（Complement Dependent Cytotoxicity, Q)C)和抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（Antibody Dependent Cell mediated Cytotoxicity, ADCC)〇
[0021] 另外，鼠源McAb重復(fù)注入人體內(nèi)會(huì)引起患者誘發(fā)人抗鼠抗體（human anti mouse antibody，HAMA)反應(yīng)，出現(xiàn)全身過敏毒性反應(yīng)并阻斷抗體功效的發(fā)揮。
[0022] 因此，為了降低鼠源McAb在人體內(nèi)的免疫原性，盡可能地避免患者出現(xiàn)HAMA反 應(yīng)，從而可以給患者重復(fù)應(yīng)用McAb實(shí)施治療，同時(shí)提高抗體的效應(yīng)功能，加強(qiáng)對(duì)腫瘤靶細(xì) 胞的殺傷作用，成為目前抗體生物藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。
[0023] 通過將鼠源性抗體的V區(qū)基因與人抗體的C區(qū)基因拼接為嵌合基因，然后插入載 體，轉(zhuǎn)入工程細(xì)胞，獲得的嵌合抗體，因其減少了鼠源基因成分，從而可心降低鼠源性抗體 引起的不良反應(yīng)，另一方面，保留鼠源性抗體上的抗原抗體互補(bǔ)決定簇，維持人源化改造抗 體識(shí)別抗原的特異性；第三，人源化抗體的效應(yīng)區(qū)能夠更好地與人免疫系統(tǒng)的其它部分相 互作用，通過ADCC或CDC作用更加有效的殺傷靶細(xì)胞。
[0024] 盡管在人體中免疫球蛋白有多種類型及其亞類，當(dāng)前單抗藥物主要是IgGl，因?yàn)?它們?cè)谘逯杏懈L(zhǎng)的半衰期以及更強(qiáng)的效應(yīng)功能。
[0025] 腫瘤治療性抗體在體內(nèi)發(fā)揮作用的主要途徑包括:ADCC、CDC、抗體直接誘導(dǎo)細(xì)胞 凋亡以及維持抗體濃度的補(bǔ)救途徑等。ADCC效應(yīng)是抗體殺傷腫瘤的最主要途徑。
[0026] ADCC是抗體識(shí)別靶細(xì)胞表面抗原后，抗體Fc結(jié)合NK細(xì)胞表面激活型 Fc γ Rs (Fc γ RI、Fc γ R II a和Fc γ R III a)受體，其中Fc γ R III a是主要受體，這種結(jié)合觸 發(fā)了細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)傳導(dǎo)，并致使NK細(xì)胞釋放穿孔素/顆粒酶復(fù)合物裂解靶細(xì)胞。一個(gè)IgG 分子在其Fc段有兩個(gè)N -連接的寡聚糖位點(diǎn)，是在重鏈的297位天冬酰胺（Asn297)上。該 糖基化位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性與抗體的效應(yīng)功能相關(guān)。既往研究表明去除巖藻糖后可增強(qiáng)抗體 Fc對(duì)Fc γ Rllla的結(jié)合能力，從而提高抗體的ADCC作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0027] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷或不足，本發(fā)明目的之一是提供一種人源化修飾型抗CD147 嵌合抗體。
[0028] 為此，本發(fā)明提供的人源化修飾型抗⑶147嵌合抗體HcHAbl8特異性結(jié)合人⑶147 分子，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于：輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0:1的 氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
[0029] 本發(fā)明提供的人源化修飾型抗⑶147嵌合抗體HcHAblS特征還在于重鏈及輕鏈恒 定區(qū)序列對(duì)應(yīng)于人同種型IgGl。
[0030] 本發(fā)明提供的人源化修飾型抗⑶147嵌合抗體HcHAbl8特征還在于其包括含有 SEQ ID N0:3的輕鏈氨基酸序列，和包括含有SEQ ID N0:4的重鏈氨基酸序列。
[0031] 本發(fā)明提供的人源化修飾型抗⑶147嵌合抗體HcHAbl8特征還在于抗體具有 N-糖苷-連接的復(fù)合糖鏈的Fc區(qū)，其中巖藻糖或木糖不與所述糖鏈還原端中的N-乙酰氨 基葡萄糖結(jié)合。
[0032] 本發(fā)明另一目的是提供了編碼上述抗體的DNA分子。該DNA分子含有SEQ ID N0:5 所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQ ID N0:6所示的編碼所述單抗重 鏈可變區(qū)的核苷酸序列。SEQ ID N0:7所示的編碼輕鏈核苷酸序列，SEQ ID N0:8所示的編 碼重鏈核苷酸序列。
[0033] 本發(fā)明的目的之三是提供了一種表達(dá)載體。該表達(dá)載體為pQD-Hyg-GSeu-CHAbl8， 該表達(dá)載體含有上述DNA序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
[0034] 本發(fā)明的目的之四是提供一種宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞被上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，優(yōu)選 的，該宿主細(xì)胞來源于CH0-K1細(xì)胞。
[0035] 本發(fā)明的目的之五是提供上述的抗體在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用，所述 癌癥是選自肺癌、肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、血液病或胃癌。
[0036] 為克服鼠源性抗體HAbl8(專利號(hào)：ZL02114471. 0)在臨床應(yīng)用中的局限性，本發(fā) 明通過RT-PCR的方法從雜交瘤細(xì)胞中克隆其輕、重鏈可變區(qū)基因，分別與人的恒定區(qū)基因 相連，構(gòu)建了抗CD147的嵌合抗體基因，并構(gòu)建了相應(yīng)的表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)染化學(xué)誘導(dǎo)的巖 藻糖缺陷型CH0-K1細(xì)胞（MAGE1. 5) (Eureka Therapeutics)，獲得了 ADCC效應(yīng)增強(qiáng)型的抗 CD147嵌合抗體一HcHAbl8,該抗體在特定宿主細(xì)胞中巖藻糖不結(jié)合于抗體Fc段糖鏈還原 端中的N-乙酰氨基葡萄糖末端，抗體Fc段糖型為甘露糖型（MAN5)。體外實(shí)驗(yàn)表明，此嵌 合抗體保留了與鼠源性親本抗體相似的親和力和特異性，并能誘發(fā)ADCC效應(yīng)，同時(shí)具有抑 制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的能力；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，該嵌合抗體具有抑制腫瘤的生長(zhǎng)能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1為質(zhì)類pQD-Hyg-GSeu_cHAbl8載體示意圖；
[0038] 圖2為HcHAbl8抗體糖譜分析
[0039] 圖3為HcHAbl8抗體與靶抗原⑶147分子親和力測(cè)定，圖中A圖為HcHAbl8測(cè)定 結(jié)果；B圖為鼠源性親本抗體HAbl8測(cè)定結(jié)果；
[0040] 圖4為HcHAb 18單抗在組織中的免疫組化染色結(jié)果；
[0041] 圖5為HcHAbl8對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)DCC體外殺傷試驗(yàn)；
[0042] 圖6為HcHAb 18對(duì)肺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響；
[0043] 圖7為HcHAb 18抑制肺癌細(xì)胞侵襲能力；
[0044] 圖8為HcHAbl8抑制NCI-H520荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。

【具體實(shí)施方式】
[0045] 下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而以下實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)例僅對(duì)本發(fā) 明進(jìn)行進(jìn)一步說明，而不是用來限制本發(fā)明。
[0046] 實(shí)施例1 :鼠源抗CD147單克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)基因的克隆和測(cè)序
[0047] 按Trizol Reagent試劑盒（Invitrogen公司）說明書提取2X 106分泌抗人⑶147 單克隆抗體HAbl8的雜交瘤細(xì)胞（專利號(hào)：02114471. 0)的總RNA。經(jīng)1 %瓊脂糖電泳鑒定 總RNA質(zhì)量后，用PrimeScript? RT reagent Kit(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得 總RNA的cDNA。根據(jù)專利"抗人肝癌單克隆抗體HAbl8輕、重鏈可變區(qū)基因及其應(yīng)用"（專 利號(hào)：02114471. 0)所公布的HAbl8單抗輕、重鏈可變區(qū)基因序列信息，設(shè)計(jì)合成相應(yīng)引物 擴(kuò)增HAbl8單抗輕、重鏈可變區(qū)基因。引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下：
[0048] VL-5' ：5' -GGGGATATCCACCATGAACTTCGGGCTGAGCTGG-3' ；VL-3' ：5' -GGATACAGTTGG TGGTGCAGTCGACTTACGTTT (GT)GTTTCA (AG)CTT-3 ' ；VH-5 ' ： 5 ' -GGGGATATCCACCATGGACTCACAT ACTCAGGTC-3 ' ；VH-3 ' ： 5 ' -GAC (ACT)CATGGGG (CG)TGT (TC)GTGCTAGCTG(AD)(AG)GAGAC(AGT) GTGA-3，。
[0049] 反應(yīng)條件：94 °C，lmin ;55 °C，lmin ;72 °C，lmin ;40 個(gè)循環(huán)，最后 72 °C 延伸， lOmin。PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產(chǎn)物并連入pMD18-T載體 (TaKaRa)，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果證明該序列與專利（專利號(hào)：02114471.0)所公布 序列一致。將測(cè)序正確的結(jié)果分別命名為PMD18T-VL或pMD18T-VH。
[0050] 實(shí)施例2 :VL和VH基因的優(yōu)化和嵌合抗體構(gòu)建
[0051] 在獲得VL和VH測(cè)序結(jié)果后。首先，采用倉(cāng)鼠的密碼子偏性對(duì)輕、重鏈基因進(jìn)行改 造，以解決在翻譯過程中因 CHO細(xì)胞中稀有密碼子產(chǎn)生的蛋白質(zhì)表達(dá)量較低，其原理是基 于解決氨基酸合成過程中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的tRNA偏性，即采用所對(duì)應(yīng)tRNA含量較多的密碼子， 加快蛋白質(zhì)的合成。根據(jù)倉(cāng)鼠的密碼子利用度表，對(duì)實(shí)施例一中獲得的VL和VH核苷酸序 列中的密碼子偏性進(jìn)行優(yōu)化，獲得如SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:8所示的單克隆抗體的輕、 重鏈可變區(qū)氨基酸序列及其核苷酸編碼序列。
[0052] 其次，人工合成抗體輕、重鏈基因的寡核苷酸片段，并在重鏈基因的兩端分別合成 Nhel和BamHl酶切位點(diǎn)，在輕鏈基因的兩端分別合成Hindlll和Xbal酶切位點(diǎn)。用Nhel 和BamHl、HindIII和Xbal分別對(duì)人工合成的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)DNA序列進(jìn)行酶切，經(jīng) 1%瓊脂糖電泳分離后，用Gel Extraction Kit(0mega bio-tek)純化酶切片段。
[0053] 然后，將純化獲得的酶切片段與同酶切的質(zhì)粒pcDNA3. 1 (Invitrogen)用T4DNA 連接酶（TaKaRa公司）進(jìn)行連接，構(gòu)建成含抗體重鏈和輕鏈全長(zhǎng)基因的真核表達(dá)載體 pQD-Hyg-GSeu-cHAbl8,如圖 1 所示。
[0054] 實(shí)施例3 :CH0細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與重組克隆的篩選
[0055] 用上述構(gòu)建的含有人源化抗體基因的表達(dá)載體pQD-Hyg-GSeu-CHAbl8轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH-5a菌株，接種于100ml LB培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)增。
[0056] 用超純質(zhì)粒DNA純化試劑盒（Qiagen)，按試劑盒說明書要求提取表達(dá)載體 pQD-Hyg-GSeu_cHAbl8 質(zhì)粒 DNA。
[0057] 采用電穿孔法將pQD-Hyg-GSeu-CHAbl8質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到巖藻糖轉(zhuǎn)移酶缺陷的CH0 細(xì)胞（MAGE1. 5 細(xì)胞）（專利：2〇〇98〇145664· 9)中。
[0058] 采用終濃度為500ug/ml潮霉素 B (Invitrogen，簡(jiǎn)稱HyB)對(duì)轉(zhuǎn)染的MAGE1. 5細(xì)胞 進(jìn)行壓力篩選，后采用終濃度為25uM的L-甲硫氨酸亞研J安（L-Methionine Sulfoximine， MSX) (Sigma)繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞篩選培養(yǎng)；并采用ClonePix FL(Genentix，Inc)，對(duì)MSX壓力篩 選后仍存活的細(xì)胞進(jìn)行多次克隆化篩選。通過上述操作獲得了人源化抗體細(xì)胞株HcHlS-M。
[0059] 在CD OptiCHO(Invitrogen)培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選出的單克隆細(xì)胞株HcH18-M，用 Protein A親和層析從培養(yǎng)上清中分離純化抗體HcHAbl8 (即人源化修飾型抗⑶147嵌合抗 體）。
[0060] 實(shí)施例4 :HcHAbl8抗體的N-連接寡糖譜分析
[0061] 取2mg純化的嵌合抗體HcHAb 18經(jīng)脫鹽處理后，放入薄壁長(zhǎng)試管中，經(jīng)真空干燥儀 45°C干燥，加入經(jīng)2M三氟乙酸（TFA) 4mL，10(TC條件下水解2h，再次干燥后重懸于Mi 11 i-Q 級(jí)水中。樣品經(jīng)再次脫鹽處理后，加入PNGase F，37°C反應(yīng)過夜，切下連接在抗體上的N-連 接型糖鏈，濾膜過濾，獲得供試品N-連接寡糖進(jìn)行分析。
[0062] N-連接寡糖通過高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法（HPAEC-PAD)方法進(jìn)行分 析。色譜條件如下：色譜柱Shimpack CLC-ODS column(60X 150mm;Japan),色譜柱經(jīng)淋洗 液A(10mM磷酸鈉溶液（pH3.8))平衡，流速1.0ml/min，55°C ;加入N-連接寡糖樣品25μ 1 后，用淋洗液B(10mM磷酸鈉溶液（ρΗ3. 8)含0. 5%正丁醇）和淋洗液Α進(jìn)行梯度洗脫，淋洗 液B和淋洗液A的比率在80min內(nèi)線性增加至60:40。用熒光（激發(fā)光波長(zhǎng)320nm，發(fā)射光 波長(zhǎng)400nm)檢測(cè)流出液。檢測(cè)得到的寡糖峰通過PA標(biāo)記的寡糖標(biāo)準(zhǔn)品（TaKaRa)進(jìn)行比 對(duì)分析。
[0063] 結(jié)果如圖2所示，與表達(dá)于野生型CH0細(xì)胞的對(duì)照樣品cHAblS相比，表達(dá)于 MAGE1. 5細(xì)胞的HcHAbl8只有單一寡糖峰，進(jìn)一步進(jìn)行單糖分析表明，HcHAbl8抗體的糖型 為高甘露糖（Man5)，未檢測(cè)到巖藻糖或木糖。
[0064] 實(shí)施例5 :重組人源化修飾型嵌合抗體的生物學(xué)功能
[0065] (1)抗體親和力測(cè)定
[0066] 經(jīng)ProteOn XPR36蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)測(cè)定HcHAbl8抗體與靶抗原CD147分子的 親和力，利用朗繆爾動(dòng)力學(xué)（Kinetic -Langmuir)模型分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：HcHAbl8抗 體與抗原⑶147的親和力KD = 3. 62*10_1°M。與鼠源性抗體HAbl8相比，經(jīng)改造后的HcHAbl8 抗體與靶抗原的親和力無顯著差異。結(jié)果如圖3所示。
[0067] (2)抗體特異性測(cè)定
[0068] 用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)HcHAblS單抗與腫瘤組織的特異性結(jié)合能力，考察該 抗體的免疫組織交叉反應(yīng)。具體操作如下：常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水、水化組織芯 片；3% H202阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶；正常羊血清工作液封閉；以HcHAbl8抗體為一抗， 生物素標(biāo)記的兔抗人Fc抗體為二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液為三抗， DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明后封片、鏡檢。結(jié)果如圖4和表1所示，HcHAblS單抗在肺 癌、肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌、食管癌和胃癌等多種惡性腫瘤組織中可見特異 性著色（總陽(yáng)性率84. 66% )著色程度均為"++"或"+++"，其著色部位為癌細(xì)胞胞膜；而與 正常組織極少結(jié)合（總陽(yáng)性率13. 70%，22/159)，在肺癌中顯示較高的靈敏度88. 24% )與 特異度（91.67% )。
[0069] 表lHcHAbl8單抗與腫瘤組織免疫交叉研究
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 一種人源化修飾型抗CD147嵌合抗體HcHAbl8,該抗體特異性結(jié)合人腫瘤相關(guān)抗原 CD147分子，它包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示，所述重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，恒定區(qū)為人抗體恒定 區(qū)。
2. 如權(quán)利要求1所述的人源化修飾型抗CD147嵌合抗體HcHAbl8,其特征在于，該抗體 是IgGl人同種型。
3. 如權(quán)利要求1所述的人源化修飾型抗CD147嵌合抗體HcHAbl8,其特征在于，該抗體 包含具有N-糖苷-連接的復(fù)合糖鏈的Fc區(qū)，其中巖藻糖或木糖不結(jié)合于所述糖鏈還原端 中的N-乙酰氨基葡萄糖。
4. 如權(quán)利要求1所述的人源化修飾型抗CD147嵌合抗體HcHAbl8,其特征在于，輕鏈的 氨基酸序列如SEQIDN0:3所示，重鏈氨基酸序列如SEQIDN0 :4所示。
5. -種核苷酸分子，其編碼權(quán)利要求1所述的抗CD147嵌合抗體HcHAbl8,其特征在 于，編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示，編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如 SEQ ID N0:6 所示。
6. 如權(quán)利要求5所述的核苷酸分子，其特征在于，編碼輕鏈核苷酸序列如SEQ ID NO: 7 所示，編碼重鏈核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
7. -種表達(dá)載體，其特征在于，該表達(dá)載體含有權(quán)利要求5或6所述的核苷酸分子，該 表達(dá)載體為 pQD-Hyg-GSeu-cHAbl8。
8. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，該宿主細(xì)胞被權(quán)利要求7的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
9. 權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，為CH0-K1細(xì)胞。
10. 權(quán)利要求1所述的抗體HcHAbl8在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用，所述癌癥是 選自肺癌、肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、血液病或胃癌。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK104086654SQ201410320878
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月4日
【發(fā)明者】陳志南, 張征, 張陽(yáng), 馮飛, 呼和牧仁, 楊向民 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)