一種用于治療骨髓增生異常綜合征的中藥組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于治療骨髓增生異常綜合征的中藥組合物及其應(yīng)用。所述中藥組合物質(zhì)量組成如下：海金沙草10～50份，杜仲葉10～50份，白花蛇舌草40～90份。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：提供了一種能用來制備治療骨髓增生異常綜合征的新的藥物目錄，拓寬了病人的選藥范圍，為治療骨髓增生異常綜合征提供了新的候選藥物。
【專利說明】一種用于治療骨髓增生異常綜合征的中藥組合物及其應(yīng)用
(—)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于治療骨髓增生異常綜合征的中藥組合物及其應(yīng)用。
(二)

【背景技術(shù)】
[0002]骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes, MDS)是一組以骨髓無效造血伴外周血細(xì)胞一系、兩系或多系減少為特征的惡性克隆性干細(xì)胞疾病，并具有向急性白血病轉(zhuǎn)化的高風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)生率高達(dá) 3.3/100，000 (Cogle C.R.，Craig B.M.，Rollison D.E.，et al.1ncidence of the myelodysplastic syndromes using a novel claims—basedalgorithm:high number of uncaptured cases by cancer registries[J].Blood，2011，117(26):7121-5.)。目前新確診的高風(fēng)險(xiǎn)MDS有上升趨勢(Sekeres M.A.，SchoonenW.M.，Kantarjian H.，et al.Characteristics of US patients with myelodysplasticsyndromes:results of six cross-sect1nal physician surveys[J].J Natl CancerInst, 2008，100 (21): 1542-51.)，唯一的治愈方案是異基因造血干細(xì)胞移植，但中老年患者不能耐受手術(shù)，只能接受小劑量的化療，支持治療和觀察治療(Szmigielska-Kaplon A.,Robak T..Hypomethylating agents in the treatment of my elodysplastic syndromesand myeloid leukemia [J].Curr Cancer Drug Targets，2011，11 (7): 837-48.)，但高危病人向白血病轉(zhuǎn)化，其中位生存期只有0.4年(Malcovati L.，Germing U.，KuendgenA.，et al.Time-dependent prognostic scoring system for predicting survivaland leukemic evolut1n in myelodysplastic syndromes[J].J Clin Oncol,2007,25(23):3503-10.)。1997年世界衛(wèi)生組織推出MDS國際預(yù)后評估系統(tǒng)(IPSS)，據(jù)骨髓的原始細(xì)胞比例、染色體核型和外周血三系減少程度將MDS分為低危組(O分)，中危組(0.5-2分)和高危組(2.5分以上)。其中低危組治療以細(xì)胞因子聯(lián)合支持治療，治療重點(diǎn)在改善血液學(xué)異常，中危組和高危組常有多系病態(tài)造血和惡性克隆增生同時(shí)存在，治療目標(biāo)重點(diǎn)是減少向白血病轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)，改善預(yù)后，治療手段主要為化療聯(lián)合細(xì)胞因子治療，療效差于急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML),異基因造血干細(xì)胞移植可有較好的效果，但移植相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于白血病(Greenberg P.L..Current therapeuticapproaches for patients with myelodysplastic syndromes.Br J Haematol，2010，150(2):131-43.Estey E..Acutemyeloid leukemia and myelodysplastic syndromesin older patients.J Clin Oncol，2007，25:1908-15.Estey E.H.，Thall P.F.，Cortes J.E., et al.Comparison of idarubicin+ara—C—，fludarabine+ara—C—，andtopotecan+ara-C-based regimens in treatment of newly diagnosed acute myeloidleukemia，refractory anemia with excess blasts in transformat1n, or refractoryanemia with excess blasts.Blood，2001，98 (13): 3575-83.)。但是由于大多數(shù)患者為老年人不能耐受骨髓移植，且移植相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)較高，所以多數(shù)患者不得不依賴藥物治療和輸血生存，并最終轉(zhuǎn)化為AML而死亡，原發(fā)性AML是骨髓中異常的原始細(xì)胞(白血病細(xì)胞)大量增殖并浸潤各種器官組織，使正常造血受抑制的血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，常規(guī)化療緩解率為55?72%，而高危MDS轉(zhuǎn)白血病與原發(fā)性AML的生物學(xué)特性有很大差異，對化療不敏感，易耐藥，預(yù)后極差。近幾年美國FDA批準(zhǔn)的用于MDS治療的去甲基化藥物5-氮雜胞苷(5-aza-cytidine, Aza C)和 5_ 氮雜 _2，-脫氧胞苷(5_aza_2，-deoxycitidine, DAC),由于非祀向的細(xì)胞毒作用、潛在致癌性、臨床應(yīng)用后耐藥病例的出現(xiàn)以及昂貴的治療費(fèi)用，限制了其在 MDS 的治療應(yīng)用(Qin T., Castoro R., EI Ahdab S., et al.Mechanismsof resistance to decitabine in the myelodysplastic syndrome.PLoS One,2011,6(8):e23372)。因此尋找療效佳、骨髓抑制輕且經(jīng)濟(jì)的新藥來改善中高危MDS患者的預(yù)后，仍是目前研究MDS治療的焦點(diǎn)。
(三)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種用于治療骨髓增生異常綜合征的中藥組合物，并提供了具體的藥效成分提取方法，成分明確，為新藥篩選提供了候選藥物。
[0004]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0005]一種用于治療骨髓增生異常綜合征的中藥組合物，其質(zhì)量組成如下:
[0006]海金沙草 10?50份
[0007]杜仲葉10?50份
[0008]白花蛇舌草 40?90份。
[0009]所述的骨髓增生異常綜合征為下列之一:難治性貧血(refractory anemia, RA)、難治性貧血伴有環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞增多(refractory anemia with ring sideroblasts,RARS)、難治性血細(xì)胞減少伴多系發(fā)育異常(refractory cytopenia with multilineagedysplasia, RCMD)、難治性貧血伴原始細(xì)胞增多 I 型(refractory anemia with excessblast-lRAEB-l)、難治性貧血伴原始細(xì)胞增多 II 型(refractory anemia with excessblast-lRAEB-2)、骨髓增生異常綜合征不能分類(MDS-unclassified，MDS_U)、5q_綜合征(MDS associated with isolated del (5q))、骨髓增生異常和骨髓增殖性疾病(MDS/myeloproliferative disorder, MDS/MPD)。
[0010]本發(fā)明還涉及所述的中藥組合物在制備治療骨髓增生異常綜合征的藥物中的應(yīng)用。
[0011]具體的，所述中藥組合物中各中藥原料經(jīng)提取后用于制備藥物，所述中藥原料提取方法如下:
[0012]海金沙草提取:海金沙草干燥粗粉用70?80%乙醇加熱回流提取2?3次，每次I?2h，合并提取液，減壓濃縮得稠浸膏，加水成混懸液，依次用石油醚、氯仿、正丁醇萃取，取正丁醇萃取液，減壓回收至干品，得正丁醇部位加粗硅膠拌樣，上樣于100?200目硅膠柱，以氯仿一甲醇梯度洗脫，所得流分減壓回收至干，得海金沙草提取物；
[0013]杜仲葉提取:杜仲葉干燥粗粉，用70?80%乙醇加熱回流提取2?3次，每次I?2h，合并提取液，減壓濃縮得稠浸膏，加水成混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇至干品，干品加蒸餾水成混懸液，采用HPD450型大孔樹脂進(jìn)行動態(tài)吸附，然后用水洗脫至無色，再用5?10 %乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收至干，得杜仲葉提取物；
[0014]白花蛇舌草提取:白花蛇舌草干燥粗粉，用80?90%乙醇加熱回流提取2?3次，每次I?2h，合并提取液，減壓濃縮得稠浸膏，加水成混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取液，減壓回收乙酸乙酯至干品，干品加蒸餾水成混懸液，采用HPD300型大孔樹脂進(jìn)行動態(tài)吸附，然后用水洗脫至無色，再用60?70%乙醇以動態(tài)洗脫，收集，減壓回收至干，得白花蛇舌草提取物；
[0015]將上述制得海金沙草提取物、杜仲葉提取物、白花蛇舌草提取物按照20?40:20?40:50?70質(zhì)量比混合，即為所述治療骨髓增生異常綜合征的藥物的藥效成分。
[0016]所述藥效成分每日有效劑量為6.25mg?100mg/kg成人。
[0017]所述藥效成分添加本領(lǐng)域常規(guī)藥用輔料，可制成下列之一的劑型:片劑、顆粒劑、丸劑、膠囊劑、口服液、散劑、注射劑。
[0018]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:提供了一種能用來制備治療骨髓增生異常綜合征的新的藥物目錄，拓寬了病人的選藥范圍，為治療骨髓增生異常綜合征提供了新的候選藥物。
(四)

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為PHDE對Skm-1細(xì)胞增殖的抑制作用；*表示組內(nèi)比較有顯著性差異P〈0.05，#表示組間比較有顯著性差異p〈0.05。
[0020]圖2-A為流式細(xì)胞術(shù)檢測不同劑量PHDE誘導(dǎo)Skm-1細(xì)胞株凋亡圖；圖2_B為不同劑量PHDE對Skm-1細(xì)胞株凋亡率的影響，*P〈0.05。
[0021]圖3為經(jīng)PHDE處理后Skm-1細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。
[0022]圖4-A為不同劑量PHDE對Skm-1細(xì)胞周期影響圖；圖4_B為不同劑量PHDE對Skm-1細(xì)胞DNA含量)的影響，*Ρ〈0.05。
[0023]圖5為不同劑量PHDE對Skm-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
[0024]圖6為不同劑量PHDE對Skm-1細(xì)胞IAPs相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
[0025]圖7為不同劑量PHDE對Skm-1細(xì)胞Bcl_2家族相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
[0026]圖8為不同劑量PHDE對Skm-1細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
[0027]圖9為不同劑量PHDE對Skm-1細(xì)胞信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
(五)

【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0029]實(shí)施例1:
[0030]海金沙草IKg干燥粗粉，用12000mL的80%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮得10g稠浸膏。加500mL水成混懸液，依次用500mL石油醚、500mL氯仿、500mL正丁醇萃取三次。取正丁醇萃取液，減壓回收至干品，得正丁醇部位(40g)，加粗硅膠(SOOg)拌樣，上樣于硅膠(100?200目)柱，以氯仿一甲醇(80:20)洗脫，所得流分減壓回收至干，得組分allg。
[0031]杜仲葉Ikg干燥粗粉，用1000mL的80%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮得稠浸膏130g。加500mL水成混懸液，依次用500mL石油醚、500mL乙酸乙酯、500mL正丁醇分別萃取三次。取正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇至干品，干品加10mL蒸餾水成混懸液，采用HPD450型大孔樹脂純化，按0.5mL/min的吸附速度(徑高比為1:10)進(jìn)行動態(tài)吸附，然后用水洗脫至無色，再用5%乙醇以lmL/min流速動態(tài)洗脫，收集洗脫液，減壓回收至干，得組分bl5g。
[0032]白花蛇舌草IKg干燥粗粉，用12000mL80%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮得120g稠浸膏。加500mL水成混懸液，依次用500mL石油醚、500mL乙酸乙酯、500mL正丁醇各萃取三次。取乙酸乙酯萃取液，減壓回收乙酸乙酯至干品，干品加10mL蒸餾水成混懸液，采用HPD300型大孔樹脂，按0.5mL/min的吸附速度(徑高比為1:10)進(jìn)行動態(tài)吸附，然后用水洗脫至無色，再用60%乙醇以lmL/min流速動態(tài)洗脫，收集，減壓回收至干，所得流分減壓回收至干，得組分clOg。
[0033]上述組分a、組分b、組分c按照20:20:60質(zhì)量比混合,得藥效成分(PHDE)。
[0034]實(shí)施例2:中藥組合物藥效成分(PHDE)對骨髓增生異常綜合征抑制的應(yīng)用
[0035](I)細(xì)胞培養(yǎng)
[0036]人MDS細(xì)胞株Skm-1細(xì)胞株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液病研究所贈送，該細(xì)胞株從由日本學(xué)者Nakagawa從一名高危MDS病人建立的細(xì)胞株，細(xì)胞培養(yǎng)條件為含10% GIBCO胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，在37°C，5% CO2孵育箱中培養(yǎng)，每天傳代一次。
[0037](2) MTT法檢測細(xì)胞存活率
[0038]取對數(shù)生長期的Skm-1細(xì)胞懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)后，按照5 X 14個(gè)/mL植入24孔培養(yǎng)板，每孔lmL。實(shí)驗(yàn)設(shè)加藥組、對照組:加藥組藥物濃度分別為0.05,0.075、0.U0.125mg/mL，對照組不加藥，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)復(fù)孔。加過藥物后將板置于37°C、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在指定的時(shí)間，轉(zhuǎn)入96孔板中，每孔200 μ L，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，每孔加入20μ L5mg/mL的MTT工作液，37 °C培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，離心(3000rpm，1min)后棄上清，每孔加入200 μ L DMSO溶液，吹打混勻后，于酶標(biāo)儀570nm處讀取吸光值(A)，根據(jù)吸光值計(jì)算生長抑制率。結(jié)果見圖1。
[0039]細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算方法如下:細(xì)胞增殖抑制率=(1-A實(shí)驗(yàn)/A對照)X 100%
[0040]利用MTT法，檢測了 PHDE作用24、48h對Skm-1細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果如圖1所示，作用24h后，0.05至0.125mg/ml的PHDE對Skm-1細(xì)胞的增殖抑制率分別為3.30%,15.83%,49.53 %,67.93 %，48h 后各組細(xì)胞增殖抑制率為:4.70 %、IL 30%,54.30 %,86.90%，由此表明，PHDE能顯著抑制Skm-1細(xì)胞增殖，并且具有濃度依賴性。
[0041](3)流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測細(xì)胞凋亡
[0042]取對數(shù)生長期的Skm-1細(xì)胞以I X 15個(gè)/mL接種于六孔板，每孔體積為5mL，依次加入不同體積的PHDE，使每孔藥物終濃度分別為0、0.075,0.1,0.125mg/mL, 37°C >5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，100rpm離心5min，棄去培養(yǎng)基，再用ImL PBS洗滌，共洗2次。然后每組各加入 500 μ L Annexin V BindingBuffer 重懸細(xì)胞，再加入 5 μ L Annexin V-FITC和5yL PI，混勻，室溫避光反應(yīng)1min上機(jī)檢測，采用FlowJo7.6軟件分析結(jié)果。結(jié)果見圖2_A0
[0043]為檢測PHDE誘導(dǎo)Skm-1細(xì)胞凋亡情況，我們采用終濃度為0.075,0.1,0.125mg/mL的PHDE處理Skm-1細(xì)胞株，24h后收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果如圖2-A所示，對照組早期凋亡率為4.49%，PHDE不同濃度處理后早期凋亡率為7.28%、9.37%U8.10%。結(jié)果表明，PHDE能有效誘導(dǎo)Skm-1細(xì)胞株凋亡。
[0044](4) Hoechst33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
[0045]將對數(shù)生長期的Skm-1細(xì)胞離心后計(jì)數(shù)，以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至IX 15個(gè)/HiL接種于六孔板，每孔體積為5mL，依次加入不同體積的PHDE，使每孔藥物終濃度分別為O、0.075,0.1,0.125mg/mL，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h。離心(lOOOrpm，5min)，收集細(xì)胞，PBS 清洗2遍，每個(gè)處理組用500uL4%多聚甲醛冰上固定30min。PBS清洗2遍，將細(xì)胞涂至玻片，晾干，用2% Trixton-1OO溶液透化20min。倒掉多余液體，將玻片轉(zhuǎn)移至搖床，PBS清洗3遍，每遍15min，將Hoechst33258溶液用PBS稀釋1000倍后均勻滴加至玻片，室溫避光孵育15min, PBS洗2遍,每遍15min,突光顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果見圖3。
[0046]為了觀察藥物處理后Skm-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，我們用0.05、0.075、0.1、0.125mg/mL的PHDE處理Skm-1后進(jìn)行Hoechst33258熒光染色，并在熒光顯微鏡下觀察、拍照。結(jié)果如圖3，對照組細(xì)胞核形狀規(guī)則，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞所發(fā)熒光較弱且均勻，而在藥物處理組，細(xì)胞核出現(xiàn)皺縮、邊集現(xiàn)象，可見致密強(qiáng)熒光，并且隨著藥物劑量增大，顆粒狀或碎片狀致密濃染逐漸增多。
[0047](5)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期阻滯
[0048]取對數(shù)生長期的Skm-1細(xì)胞離心(lOOOrpm，5min)后計(jì)數(shù)，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度至2X 15個(gè)/mL接種于六孔板，每孔體積為5mL。加入PHDE使藥物終濃度分別為0,0.05,0.075mg/mL，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。每組收集I X 16個(gè)細(xì)胞，100rpm離心5min,棄去培液，PBS洗滌一次，再離心去除PBS，將細(xì)胞加入到預(yù)冷的70%乙醇中，4°C固定過夜。離心(1500rpm，5min)去除固定液，PBS重懸細(xì)胞，離心去除PBS。再用少量PBS重懸細(xì)胞，每組加入約2.5?5uL的RNaseA酶工作液使終濃度為50ug/mL，37°C溫浴30min，再加入25?50uL的PI工作液使終濃度為50ug/mL，4°C避光反應(yīng)30min后上機(jī)檢測采用modfitLT軟件分析,結(jié)果見圖4-A。
[0049]通過流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測時(shí)，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1/G0，S期和G2/M期，并通過特殊軟件，計(jì)算各時(shí)相的百分率。據(jù)此原理，我們分別用0.075,0.lmg/ml的PHDE處理Skm-1細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞進(jìn)行PI染色，F(xiàn)ACS檢測細(xì)胞周期。結(jié)果如圖4-A所示，不加藥物處理時(shí)，細(xì)胞G0/G1期比率為34.89 %，S期為65.11 %，0.075mg/ml的PHDE處理細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞比率增至41.53%, S期細(xì)胞比率則下降至55.09%,0.lmg/ml的PHDE處理細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞比率增至48.02%，S期細(xì)胞比率則下降至42.26%，提示PHDE可以使Skm-1細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。
[0050](6) Western-Blotting方法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、IAPs家族蛋白、Bcl_2家族相關(guān)蛋白、G0/G1期相關(guān)蛋白、PI3K/Akt信號通路蛋白及NF- κ B信號蛋白
[0051]I).收集蛋白上清液
[0052]收集對數(shù)生長期的Skm-1細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞密度至I X 15個(gè)/mL接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶體積為10mL。加入不同體積的PHDE使每個(gè)處理組藥物終濃度分別為0,0.05,0.075,0.lmg/mL，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。100rpm離心5min收集細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞團(tuán)塊大小加入約30?40uL蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑)，冰上放置30min后，4°C 12000rpm離心1min,收集蛋白上清。
[0053]2).BCA蛋白定量法:取潔凈的96孔板，在每個(gè)孔中加入I μ L的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或蛋白樣品，19μ LPBS，每個(gè)孔中加入200μ L BCA工作液，輕微震蕩混勻30sec，60°C溫育30min，取出96孔板，待冷卻至室溫后于酶標(biāo)儀570nm波長檢測吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白樣品濃度。
[0054]3).SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0055]按B1-Rad公司說明書安裝玻璃板，分別灌制8%?12%分離膠和5%積層膠。凝膠固定于電泳裝置中，上、下槽各加入IXTris-甘氨酸電泳緩沖液，拔去梳子，并用電泳緩沖液沖洗梳孔，按30?50ug的蛋白量進(jìn)行上樣。濃縮膠用恒壓60V，當(dāng)樣品跑至分離膠時(shí)，把電壓調(diào)至120V,直至溴酹藍(lán)跑至分離膠底部。根據(jù)膠的大小,剪四張合適的Whatman3mm濾紙和一張PVDF膜，PVDF膜先用甲醇浸泡活化，之后再和濾紙一起放在盛有轉(zhuǎn)膜緩沖液的槽中浸泡5min，在黑色一面(負(fù)極)墊上海綿墊，在其上放置兩張用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡過的濾紙，將凝膠置于其上，然后是PVDF膜和另外兩張濾紙，將另一塊海面墊置于其上，以上各步均應(yīng)排盡氣泡。將上述裝置放入盛有轉(zhuǎn)膜緩沖液的電轉(zhuǎn)槽中，PVDF膜面朝正極，恒流400mA轉(zhuǎn)10min左右。轉(zhuǎn)移結(jié)束后將PVDF膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，浸泡在封閉液中，置搖床上緩慢搖動，室溫2h。將PVDF膜轉(zhuǎn)移到配制好的一抗溶液中，4°C過夜。用IXTBST洗膜三次，洗去非特異結(jié)合的蛋白，每次15min。PVDF膜正面朝上，加入現(xiàn)配的二抗溶液中，室溫?fù)u床孵育2h。用IXTBST洗膜三次，洗去非特異結(jié)合的蛋白，每次15min。根據(jù)膜的大小、多少，取等量的ECL發(fā)光試劑盒中的A液、B液進(jìn)行混合，然后把PVDF膜置于混合液中淋洗lmin。浙去膜上多余的溶液，將膜置于兩層保鮮膜中，置于X光片盒中。在暗室中壓片，曝光30s?5min, 一次性完成顯影、定影。
[0056]Caspase的激活是凋亡事件的核心機(jī)制，來自于細(xì)胞表面受體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的死亡誘導(dǎo)信號促發(fā)了 Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Caspase-3是Caspase家族中最重要的執(zhí)行分子，正常以酶原(32KD)形式存在于胞漿中，當(dāng)接受Caspase啟動分子的信號時(shí)被激活，裂解相應(yīng)的胞漿核底物而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，多聚(ADP-核糖)聚合酶(poly (ADP-ribose)polymerase, PARP)是 Caspase-3 的主要底物，在 DNA 損傷修復(fù)、重組和維持基因組穩(wěn)定性上起著重要的作用，在凋亡啟動時(shí)，PARP被Caspase-3剪切成兩個(gè)片段，使得PARP中與DNA結(jié)合的兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)與羧基端的催化區(qū)域分離，不能發(fā)揮正常功能而引起凋亡。我們用0.05?0.lmg/mL PHDE作用Skm-1細(xì)胞24h后，提取總蛋白，利用Western-Blotting檢測了藥物作用后Caspase家族相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果顯示如圖5, PHDE能顯著激活Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3和PRAP等凋亡相關(guān)蛋白。
[0057]凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins IAPs)是一類抑制凋亡蛋白，其主要包括XIAP、CIAP-l、CIAP_2、Survivin、Livin等，是Caspases的主要調(diào)節(jié)因子之一。前面我們已經(jīng)證實(shí)PHDE作用后引起Caspase家族蛋白的激活，是否IAPs也參與此調(diào)節(jié)過程，我們用0.05?0.lmg/mL PHDE作用Skm-1細(xì)胞24h后，提取總蛋白進(jìn)行檢測結(jié)果顯示，PHDE 顯著抑制 XIAP、CIAP-1、CIAP-2、Survivin 等蛋白的表達(dá)(圖 6)。
[0058]我們觀察到Caspase-9的激活，表明PHDE通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在正常細(xì)胞中cytc位于線粒體內(nèi)、外膜之間，在呼吸傳遞鏈中起重要作用，但當(dāng)細(xì)胞被誘導(dǎo)凋亡是，cytc可以從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與Apaf-1結(jié)合,提高了 Apaf-1結(jié)合ATP或dATP的親和力，Apaf-1與cytc復(fù)合物與ATP/dATP的結(jié)合激發(fā)其多聚化從而形成凋亡體,在凋亡體上Apaf-1的CARD結(jié)構(gòu)域向外暴露，吸引胱解酶9前體到凋亡小體，引起其他胱解酶的活化，進(jìn)而導(dǎo)致凋亡。Bcl-2蛋白家族在線粒體通路中有重要的調(diào)節(jié)作用，Bcl-2是一個(gè)多基因家族，主要包括3個(gè)亞家族:Bcl-2亞家族(抑制細(xì)胞凋亡)主要包括Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1等，Bax亞家族(促進(jìn)細(xì)胞凋亡)包括Bax、Bak, BH3_only蛋白家族，(促進(jìn)細(xì)胞凋亡)，包括 Bid、Bad、Bim/Bod、Nip3、Nix/BNIP3 等，我們用 0.05 ?0.lmg/mL PHDE 作用Skm-1細(xì)胞24h后，提取總蛋白進(jìn)行檢測結(jié)果顯示，PHDE顯著上調(diào)cytc，抑制Bcl_2亞家族(Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-l)表達(dá)，并呈劑量依賴性，劑量依賴性上調(diào)Bax亞家族Bak，但對Bax、Bid表達(dá)無明顯影響(圖7)。
[0059]CyclinD/⑶K4復(fù)合體是真核細(xì)胞必不可缺的G1/S期調(diào)控因素，是細(xì)胞周期推進(jìn)的動力，CylcinDl是Gl期活性最強(qiáng)的CyclinD亞型之一，被認(rèn)為是細(xì)胞癌變的驅(qū)動器(Guglielmi F., Luceri C., G1vannelli L., et al.Effect of4-coumaric and3,4-dihydroxybenzoic acid on oxidative DNA damage in rat colonic mucosa[J].Br JNutr, 2003,89 (5): 581-7.)。CyclinDl和CDK4在多種腫瘤中均有高表達(dá)，因此，抑制CDK4,CyclinDl的表達(dá)使得細(xì)胞周期停滯在Gl期可有效地抑制腫瘤生長，前期利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)PHDE誘導(dǎo)Skm-1細(xì)胞發(fā)生Gl期細(xì)胞阻滯，因此我們檢測調(diào)控細(xì)胞由Gl期進(jìn)入S期的CyclinDl、CDK4、CDK6表達(dá)。我們采用Western-Blotting檢測了 PHDE作用于Skm-1細(xì)胞24h后，⑶K4/6、cyclinDl的變化。結(jié)果如圖8所示，PHDE能顯著下調(diào)⑶K4/6、Cyclin Dl，并呈劑量依賴性。
[0060]PI3K/AKT信號通路為細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，經(jīng)線粒體通路抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活，PI3K、AKT是此通路中關(guān)鍵分子，NF-kB是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，是與惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化、耐藥和凋亡有關(guān)的重要因子。用0.05?0.lmg/mL PHDE作用Skm-1細(xì)胞24h后，提取總蛋白，Western-Blotting檢測PI3K、Akt、p_Akt、p65和pp65蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，BIIB021顯著抑制PI3K、磷酸化Akt (p-Akt)表達(dá)，對總Akt也有抑制作用，此外，PHDE也抑制p65和pp65蛋白表達(dá)(如圖9)。
[0061]因此，本發(fā)明中藥組合物藥效成分(PHDE)能夠抑制MDS細(xì)胞株Skm-1細(xì)胞增殖，且呈濃度-時(shí)間依賴性；能同時(shí)激活內(nèi)、外源途徑(死亡受體途徑和線粒體途徑)誘導(dǎo)Skm-1細(xì)胞凋亡細(xì)胞阻滯于G0/G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；能夠通過PI3K/Akt信號通路，NF-kB信號通路而引起細(xì)胞凋亡，減少藥物耐藥性。
[0062](7)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0063]數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件分析，單變量兩組間數(shù)據(jù)比較采取t-檢驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，各組數(shù)據(jù)以“均值土標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P < 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
【權(quán)利要求】
1.一種用于治療骨髓增生異常綜合征的中藥組合物，其質(zhì)量組成如下: 海金沙草 10?50份 杜仲葉10?50份 白花蛇舌草 40?90份。
2.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物在制備治療骨髓增生異常綜合征的藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述中藥組合物中各中藥原料經(jīng)提取后用于制備藥物，所述中藥原料提取方法如下: 海金沙草提取:海金沙草干燥粗粉用70?80%乙醇加熱回流提取2?3次，每次I?2h，合并提取液，減壓濃縮得稠浸膏，加水成混懸液，依次用石油醚、氯仿、正丁醇萃取，取正丁醇萃取液減壓回收正丁醇后，加粗硅膠拌樣，上樣于100?200目硅膠柱，以氯仿一甲醇梯度洗脫，所得流分減壓回收至干，得海金沙草提取物； 杜仲葉提取:杜仲葉干燥粗粉，用70?80%乙醇加熱回流提取2?3次，每次I?2h，合并提取液，減壓濃縮得稠浸膏，加水成混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取正丁醇萃取液減壓回收正丁醇至干品，干品加蒸餾水成混懸液，，采用HPD450型大孔樹脂進(jìn)行動態(tài)吸附，然后用水洗脫至無色，再用5?10%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收至干，得杜仲葉提取物； 白花蛇舌草提取:白花蛇舌草干燥粗粉，用80?90%乙醇加熱回流提取2?3次，每次I?2h，合并提取液，減壓濃縮得稠浸膏，加水成混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取液減壓回收乙酸乙酯至干品，干品加蒸餾水成混懸液，采用HPD300型大孔樹脂進(jìn)行動態(tài)吸附，然后用水洗脫至無色，再用60?70%乙醇以動態(tài)洗脫，收集，減壓回收至干，得白花蛇舌草提取物； 將上述制得海金沙草提取物、杜仲葉提取物、白花蛇舌草提取物按照20?40:20?40:50?70質(zhì)量比混合，即為所述治療骨髓增生異常綜合征的藥物的藥效成分。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥效成分有效劑量為6.25mg?10mg/kg成人。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥效成分添加藥用輔料，制成下列之一的劑型:片劑、顆粒劑、丸劑、膠囊劑、口服液、散劑、注射劑。
【文檔編號】A61K36/748GK104127543SQ201410324070
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】林圣云, 蔣劍平, 葉寶東, 李靜 申請人:林圣云, 蔣劍平