原兒茶醛在制備防護(hù)吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】吸煙造成肺損害已經(jīng)是公認(rèn)的事實(shí)，保護(hù)或減輕長(zhǎng)期吸煙者的肺損害，是預(yù)防肺癌等吸煙并發(fā)癥的一個(gè)重要的保健措施，本研究組發(fā)現(xiàn)原兒茶醛對(duì)吸煙導(dǎo)致的肺損傷有明顯的保護(hù)作用，據(jù)此，本發(fā)明提出用原兒茶醛制備為一種可供臨床作為防護(hù)吸煙導(dǎo)致肺損傷的保健食品或藥品應(yīng)用，這種應(yīng)用是指原兒茶醛可以制備為膠囊，軟膠囊，片劑，顆粒劑，沖劑，口服液，噴霧劑，注射劑，供臨床作為防護(hù)吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面的應(yīng)用。
【專利說明】原兒茶醛在制備防護(hù)吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面 的應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】原兒茶醛是中藥丹參的主要活性成分之一，本發(fā)明涉及原兒茶醛在制 備防護(hù)吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面的應(yīng)用。
[0002] 研究背景吸煙有害健康，但全球仍有11億人在吸煙，占世界人口的1/6。世界衛(wèi) 生組織估計(jì)，與吸煙相關(guān)的疾病每年導(dǎo)致大約500萬人過早死亡，其中有大約60萬非吸煙 者死于二手煙的危害。而我國(guó)的肺癌發(fā)病率和死亡率一直呈顯著上升趨勢(shì)，預(yù)計(jì)2025年每 年死于肺癌的人數(shù)將接近100萬，其中90%肺癌的發(fā)生與吸煙有關(guān)。長(zhǎng)期吸煙可引起機(jī)體 的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，而氧化損傷和慢性炎癥正好是肺部疾病發(fā)生的重要因素。針對(duì)吸 煙誘導(dǎo)肺損傷的毒性作用及機(jī)制，本課題一直在尋找對(duì)吸煙致肺損傷有保護(hù)作用的物質(zhì)， 通過大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了原兒茶醛對(duì)吸煙導(dǎo)致的肺損傷具有十分明顯的保護(hù)作用。
[0003] 原兒茶醒（Protocatechuic aldehyde, PCA)，化學(xué)名為3,4_二輕基苯甲醒，是丹 參水溶性成分丹酚酸B降解的主要產(chǎn)物之一，也可從四季青葉、鼠尾草等活血化瘀藥物中 提取，常作為質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)控制丹參相關(guān)制劑的質(zhì)量。由于原兒茶醛的抗氧化活性來自其 鄰二酚的母核，因此它具有多種生理活性，如擴(kuò)張動(dòng)脈、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集、 抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基等作用。目前對(duì)原兒茶醛的藥理學(xué)研究主要有如下幾個(gè)方面：
[0004] 1.原兒茶醛保護(hù)心肌細(xì)胞作用：原兒茶醛對(duì)心肌的保護(hù)作用，有如下觀點(diǎn)：
[0005] (1)原兒茶醛可以減輕鈣超載，保護(hù)心?。盒募∪毖叭毖俟嘧p傷所造成的 心肌細(xì)胞損傷均與細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載有關(guān)。心肌細(xì)胞的電生理研究表明：缺血后細(xì)胞內(nèi)的無 氧代謝導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH降低而引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)Na+超載，進(jìn)一步引起的Ca2+超載，在心肌的缺 血性以及再灌注性損傷中均占有重要的地位。采用熒光探針Fura-2定量分析法，分別測(cè)定 丹參注射液及其活性成分丹參素、PCA對(duì)離體健康成人紅細(xì)胞胞漿Ca2+濃度的影響，結(jié)果 顯示丹參素和PCA均具有降低成人紅細(xì)胞胞漿Ca2+濃度的作用，并呈劑量依賴性，二者合 并用藥，藥效相加，作用與丹參注射液相似；而且PCA的鈣拮抗作用強(qiáng)于丹參素，紅細(xì)胞胞 漿ca濃度最大抑制率可達(dá)80%以上，且無鐘形曲線特點(diǎn)（沈玲紅，等，2004)。
[0006] (2)原兒茶醛能夠心肌損傷特異性的酶活性：最近有報(bào)道原兒茶醛對(duì)大鼠心肌缺 血/再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用，研究發(fā)現(xiàn)原兒茶醛能夠顯著降低該動(dòng)物模型的心肌 梗塞面積，對(duì)心肌損傷特異性的酶CK-MB，cTnl和LDH有明顯的降低作用，這些酶是細(xì)胞 內(nèi)重要的能量代謝酶，是急性心肌損傷的血清標(biāo)志物，心肌缺血/再灌注損傷大鼠血清中 的CK-MB，cTnl，LDH含量均明顯升高，應(yīng)用原兒茶醛能夠降低大鼠血清中的CK-MB. cTnl和 LDH水平，提示原兒茶醛對(duì)心肌的保護(hù)作用可能是與降低這些酶的活性有關(guān)（袁曉峰，等， 2013)。
[0007] (3)原兒茶醛有抗氧化作用，原兒茶醛具有鄰二酚的母核結(jié)構(gòu)，該藥效基團(tuán)是其顯 著抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。有人利用體外抗氧化模型，定量比較丹參藥材的代表成分丹參 素、原兒茶醛、咖啡酸和丹酚酸B的體外抗氧化能力的強(qiáng)弱，4種酚性化合物清除· OH的Ic 值大小順序?yàn)椋旱⑺?gt;咖啡酸>原兒茶醛>丹酚酸B，表明丹酚酸B的作用最強(qiáng)，原兒茶 醛的作用次于丹酚酸B，這些成分可能是丹參通過清除氧自由基治療心血管疾病的重要活 性成分（劉梅，等，2009)。
[0008] 2原兒茶醛抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用：動(dòng)脈粥樣硬化是常見的心血管疾病，近年來 被認(rèn)為是一種慢性炎癥反應(yīng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素，許多 炎性刺激因子如脂多糖、腫瘤壞死因子等都可以造成血管內(nèi)皮的炎性損傷；血管內(nèi)皮細(xì)胞 損傷、凋亡會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮失去其完整性，是動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素之一，已證明原兒茶醛可 抑制某些炎癥因子及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)，從而抑制血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)；原兒茶醛 還有抑制細(xì)胞凋亡作用，可通過增加 NO, NOS的分泌來保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化修飾低密度 脂蛋白降低NO介導(dǎo)的血管損傷，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、凋亡和壞死。
[0009] 3原兒茶醛抗血栓形成的作用：原兒茶醛體內(nèi)、體外給藥對(duì)家兔和大鼠血小板用 ADP或凝血酶誘導(dǎo)的聚集以及5-HT釋放，均有明顯的抑制作用，并能降低血小板TXA，所以 原兒茶醛抑制血小板聚集可能與抑制血小板PGs代謝、減少TXA，生成有關(guān)，可能是通過抑 制PGs代謝系統(tǒng)環(huán)氧化酶的活性等作用所致。原兒茶醛還有促進(jìn)微循環(huán)的作用。
[0010] 還有報(bào)道原兒茶醛對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的有保護(hù)作用，抗肝纖維化作用，抗敗血癥、抗病 毒、神經(jīng)保護(hù)等作用。但關(guān)于原兒茶醛對(duì)吸煙誘導(dǎo)肺損傷的保護(hù)研究尚未發(fā)現(xiàn)。本項(xiàng)目組 利用已經(jīng)建立起來的吸煙導(dǎo)致肺損傷的動(dòng)物模型，對(duì)原兒茶醛是否對(duì)吸煙誘導(dǎo)的肺損傷具 有保護(hù)作用進(jìn)行了探討，結(jié)果證明原兒茶醛對(duì)吸煙造成的肺損傷具有明顯的保護(hù)作用。


【發(fā)明內(nèi)容】
[0011] 本研究組發(fā)現(xiàn)原兒茶醛對(duì)吸煙導(dǎo)致的肺損傷有明顯的保護(hù)作用，據(jù)此， 本發(fā)明提出用原兒茶醛制備為一種口腔含片，供臨床作為防護(hù)吸煙致肺損傷的保健食品及 藥品方面的應(yīng)用，同時(shí)，原兒茶醛還可以制備為膠囊，軟膠囊，片劑，顆粒劑，沖劑，口服液， 噴霧劑，注射劑，供臨床作為防護(hù)吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面的應(yīng)用。
[0012] 進(jìn)一步的研究證明原兒茶醛作為臨床作為防護(hù)吸煙致肺損傷的保健食品及藥品 時(shí)，當(dāng)制備成含片，膠囊，軟膠囊，片劑時(shí)，每粒含原兒茶醛60?150mg為佳，較佳的劑量為 66. 5mg或133mg ;制備為顆粒劑，沖劑時(shí)，每包含原兒茶醛60?150mg為佳，較佳的劑量為 66. 5mg或133mg ;制備為口服液時(shí)，每瓶含原兒茶60?150mg為佳，較佳的劑量為66. 5mg 或 133mg。

【具體實(shí)施方式】：
[0013] 為證明原兒茶醛對(duì)吸煙導(dǎo)致的肺損傷有保護(hù)作用，本研究采用C57BL/6小鼠進(jìn)行 建模研究，C57BL/6小鼠是目前國(guó)內(nèi)外最常用于吸煙誘導(dǎo)肺損傷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，本課題組 預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將C57BL/6小鼠的吸煙量設(shè)為每天Sg煙絲，暴露20d，能導(dǎo)致小鼠肺損傷，本實(shí) 驗(yàn)擬通過C57BL/6小鼠暴露于煙草煙霧中，建立吸煙誘導(dǎo)的肺損傷模型，探索原兒茶醛干 預(yù)后吸煙誘導(dǎo)肺損傷的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的變化及病程中的組織病理學(xué)的改變，進(jìn)一步 研究原兒茶醛作為抗氧化劑對(duì)吸煙誘導(dǎo)的肺損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。
[0014] 1研究目的
[0015] I. 1吸煙致肺損傷的小鼠模型建立及發(fā)病機(jī)制的探討
[0016] 參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)吸煙致肺損傷的文獻(xiàn)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的基本條件，確定吸煙致肺損 傷的各個(gè)因素，如每次使用的煙絲重量，每天吸煙的時(shí)間，每天吸煙的次數(shù)以及造模的天數(shù) 等。通過模型組肺部的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和纖維化情況，判斷造模是否成功。
[0017] 1. 2觀察三個(gè)劑量的PCA對(duì)吸煙小鼠肺損傷的影響
[0018] 觀察原兒茶醛治療吸煙致肺損傷的量效關(guān)系，并比較原兒茶醛與維生素 C治療肺 損傷的效果。通過觀察各個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠肺部組織病理學(xué)變化，肺羥脯氨酸含量及Masson 纖維化染色情況，評(píng)價(jià)原兒茶醛對(duì)肺損傷的保護(hù)作用，同時(shí)，通過觀察抗氧化酶SOD、MDA、 GSH-PX活性的影響，評(píng)價(jià)探討推測(cè)原兒茶醛對(duì)吸煙致小鼠肺損傷的藥理作用及作用機(jī)制。
[0019] 2材料與方法
[0020] 2. 1實(shí)驗(yàn)材料
[0021] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本實(shí)驗(yàn)使用8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，共60只，體重為（20 ±2) g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證：SCXK (粵）2008-0002
[0022] 飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)于清潔動(dòng)物房，室溫保持24°C?28°C，濕度在50%?60%之內(nèi)，每 天12h光照，自由飲水與攝食（廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供的標(biāo)準(zhǔn)飼料），每周稱重一次。
[0023] 實(shí)驗(yàn)藥物原兒茶醒的配制：準(zhǔn)確稱取60mg，120mg，180mg原兒茶醒分別溶于60ml 雙蒸水（配藥時(shí)按比例縮減，按需要量配制），充分振蕩溶解，配成溶液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0024] 2. 2實(shí)驗(yàn)方法
[0025] 2. 2. 1設(shè)計(jì)與分組
[0026] 60只8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物適應(yīng)性 喂養(yǎng)1周后按體重隨機(jī)分成6組，分別為正常組（Control組）、模型組（TS組）、原兒茶醛 低劑量組（PCA-L組）、原兒茶醛中劑量組（PCA-M組）、原兒茶醛高劑量組（PCA-H組）和維 生素 C陽性對(duì)照組（VC組）。小鼠進(jìn)行為期30d的吸煙誘導(dǎo)肺損傷觀察，吸煙即煙草煙霧暴 露方法如下：每天煙草的用量為8g，每天進(jìn)行煙霧暴露4次，每次完全燃燒2g煙絲，每次暴 露15min，每次吸煙完畢后中途間隔5min再繼續(xù)進(jìn)行下一次吸煙。每天吸煙前一小時(shí)分別 對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃給藥，給藥量均按照小鼠體重〇. Iml · IOg' TS組給予生理鹽水，PCA-L組 給予原兒茶醒IOmg · kg< · (Γ1，PCA-M組給予原兒茶醒20mg · kg< · (Γ1，PCA-H組給予原兒 茶醛30mg · kg4 · cf1，VC組給予維生素 ClOOmg · kg4 · cf1。最后一次給藥完畢24h后，取左 肺進(jìn)行超氧化歧化酶（SOD)，過氧化氫酶（CAT)，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX)和過氧化物 髓化酶（MPO)的活力檢測(cè)，以及丙二醛（MDA)水平檢測(cè)，提取蛋白進(jìn)行相關(guān)炎癥、凋亡和氧 化因子檢測(cè)。右肺去部分組織做病理切片，進(jìn)行HE、MASSON、粘液染色和免疫組化檢測(cè)。
[0027] 2. 2. 2造模方法
[0028] 動(dòng)物被放置于吸煙箱（由透明有機(jī)玻璃制成，長(zhǎng)48cm，寬36cm，高30cm)，吸煙箱 蓋為可活動(dòng)門，該門有兩個(gè)Icm的圓形排氣孔，并裝有一個(gè)小型抽風(fēng)機(jī)。抽風(fēng)機(jī)進(jìn)風(fēng)口處連 接一個(gè)IL的塑料儲(chǔ)藏室，其上方放置著一個(gè)15ml圓柱形的金屬煙絲槽。開始實(shí)驗(yàn)時(shí)，煙絲 被放置于煙絲槽中，點(diǎn)燃煙絲，啟動(dòng)小型抽風(fēng)機(jī)，煙霧被吸到塑料儲(chǔ)藏室與空氣混勻，然后 勻速排進(jìn)吸煙室內(nèi)。每天小鼠吸煙4次，每次15min，每次吸煙結(jié)束后，打開吸煙箱蓋驅(qū)走 箱內(nèi)煙霧，間隔5min再繼續(xù)下一次吸煙。每天煙絲使用量8g，每次燃燒2g煙絲，2g煙絲約 2min會(huì)燃燒殆盡，小鼠總吸煙時(shí)間為60min。
[0029] 2. 2. 3小鼠肺組織的處理
[0030] 取小鼠肺組織放置于0°C生理鹽水中漂洗，出去血液，濾紙拭干，稱重，放入玻璃勻 漿器內(nèi)。用移液槍量取預(yù)冷的〇. 9%生理鹽水（生理鹽的體積總量為組織塊重量的9倍）， 用移液管取總量1/2的生理鹽水于玻璃勻漿器圓頸壁中，用眼科剪將肺組織快速剪碎，然 后在玻璃勻漿管中快速研磨，勻漿器的下端插入盛有碎冰的器皿中，充分研碎后，將勻漿液 分裝到2ml的離心管內(nèi)。剩余的1/2冷生理鹽水沖洗殘留在勻漿器中的勻漿液，然后倒入 對(duì)應(yīng)的離心管。將制備好的10%勻漿，用低溫離心機(jī)在4°C環(huán)境中以2500r/min轉(zhuǎn)速，離心 15min，用移液槍分離上清液，分裝后放入-80°C超低溫冰箱儲(chǔ)藏備用。
[0031] 2. 2. 4小鼠肺組織SOD，CAT，GSH-PX和MPO活性檢測(cè)
[0032] 小鼠肺組織SOD活性采用WST-I法測(cè)定；小鼠肺組織CAT活性采用鑰酸銨法測(cè) 定，肺組織GSH-PX活性檢測(cè)用谷胱甘肽過氧化物酶的酶促反應(yīng)速度法測(cè)定。小鼠肺組織 MPO(髓過氧化物酶）活性檢測(cè)采用鄰連茴香胺供氫法測(cè)定。
[0033] 2. 2. 5小鼠肺組織羥脯氨酸含量檢測(cè)
[0034] 小鼠肺組織羥脯氨酸含量測(cè)定根據(jù)羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn) 物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色的原理，用相關(guān)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。
[0035] 2. 2. 6小鼠肺組織病理評(píng)分
[0036] 每張切片采用盲法評(píng)估。通過400倍的顯微鏡下觀察300個(gè)肺泡進(jìn)行評(píng)分，每一 個(gè)視野按照下表的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。所有的得分累加并根據(jù)重要性進(jìn)行加權(quán)計(jì)算，最終得分 按照以下公式進(jìn)行：肺損傷分?jǐn)?shù)=[肺泡出血得分/視野數(shù)+2X (肺泡浸潤(rùn)得分/視野 數(shù)）+3 X (纖維沉積得分/視野數(shù)）+ (肺泡壁充血/視野數(shù)）]/總肺泡數(shù)。見表2. 1 :
[0037] 表2. 1肺組織病理評(píng)分表
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 原兒茶醛在制備防護(hù)吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的原兒茶醛在制備防護(hù)吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面的 應(yīng)用，其特征是指原兒茶醛可以制備為膠囊，軟膠囊，片劑，顆粒劑，沖劑，口服液，噴霧劑， 注射劑，供臨床應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1所述的原兒茶醛在制備防護(hù)吸煙致肺損傷的保健食品及藥品方面 的應(yīng)用，其特征是指原兒茶醛制備為含片，膠囊，軟膠囊，片劑時(shí)，每粒含原兒茶醛60? 150mg，制備為顆粒劑，沖劑時(shí)，每包含原兒茶醛60?150mg，制備為口服液時(shí)，每瓶含原兒 茶醒60?150mg。
【文檔編號(hào)】A61P11/00GK104288132SQ201410327516
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】吳鐵, 鄭志明, 崔燎, 鄒麗宜, 張新樂 申請(qǐng)人:廣東醫(yī)學(xué)院